Đề tài Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria

rất lớn giữa các chủng. Chẳng hạn, B. longum và B. bifidum được sử dụng trong canh trường thuần khiết để sản xuất sữa lên men thì không phát triển trong sữa, trong khi nồng độ tế bào B. aldolescentis tăng lên chỉ 5 lần trong suốt 48h ủ (Samona và cộng sự, 1996). Mặc dù sữa chứa những dưỡng chất thiết yếu cho bifidobacteria, sự phát triển của chúng tương đối chậm vì bị giới hạn nồng độ của các acid amin và các peptide mạch ngắn. Bổ sung dịch chiết nấm men vào sữa, mà chứa các vitamin hòa tan, khoáng, acid amin và peptide cũng như nước cốt MRS (de Man, Rogosa & Sharpe, 1960) cải thiện sự phát triển (Roy, Dussault & Ward, 1990). Thêm vào đó, môi trường dựa trên sữa phải được bổ sung với những cơ chất có khả năng oxy hóa khử thấp như là cysteine hoặc acid ascorbic để giảm khả năng oxy hóa cao của sữa và để đạt được yêu cầu kỵ khí của bifidobacteria (Roy và cộng sự, 1990). Bởi vì những yêu cầu dinh dưỡng và tính cạnh tranh thấp của chúng khi trộn với LAB khác, bifidobacteria thường được nhân giống trong canh trường thuần khiết và cuối cùng mới trộn với những canh trường (Tamine, Marshall & Robinson, 1995). Bảng 6: Dữ liệu sản xuất bifidobacteria trong những hệ thống lên men và điều kiện môi trường khác nhau Trong phương pháp lên men tế bào tự do theo mẻ cổ điển của sữa với canh trường thuần khiết của bifidobacteria có hoặc không có kiểm soát pH, những yếu tố chính giới hạn sự phát triển là sự tích lũy những sản phẩm cuối của quá trình Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 24 trao đổi chất như lactic, acid acetic, và việc tháo xả nước cốt môi trường (Desjardins, Roy, Toupin & Goulet, 1990). Những nghiên cứu về bifidobacteria phát triển trong sữa gầy đã được lọc siêu không có kiểm soát pH cho kết quả sản lượng tế bào tối đa của những chủng khác nhau phổ rộng từ 6,2.108 đến 1,7.109 cfu/ml đối với sữa gầy và từ 2,9.109 đến 3,6.109 cfu/ml đối với sữa gầy cô đặc 5 lần bằng siêu lọc (Ventling & Mistry, 1993). Số lượng tế bào lớn đạt được với lọc siêu được kết hợp với thể tích đệm làm gia tăng thêm do nồng độ cao của protein và các muối không hòa tan, mà vẫn duy trì pH của sữa ở giá trị hỗ trợ sự phát triển bifidobacteria trong thời gian dài. Môi trường dựa trên whey cũng được phát triển để sản xuất bifidobacteria (Core, Madec & Boyaval, 1992). Trong nghiên cứu này, whey được bổ sung thêm acid casamino hoặc dịch chiết nấm men và một chất khử, như acid ascorbic hay cysteine, là môi trường thích hợp cho B. bifidum phát triển trong suốt quá trình lên men theo mẻ không có sự điều chỉnh pH. Tuy nhiên, lượng tế bào tối đa (9.108 cfu/ml) thấp hơn môi trường MRS-cysteine giá trị cao (1,4.109 cfu/ml), trong đó việc nhân giống bifidobacteria được thực hiện trong phòng thí nghệm. Lượng bifidobacteria cao trong môi trường MRS cho kết quả với bốn chủng của B. longum, với nồng độ tế bào tối đa là 3,3; 8,9; 3,7; và 1,3.109 cfu/ml tại pH theo thứ tự là 5.5, 6.0, 6.5 và 7.0 (Reilly và Gilliland, 1999) Việc bổ sung vào môi trường MRS với whey permeate cho thấy sự gia tăng tốc độ phát triển bifidobacteria trong quá trình lên men theo mẻ có kiểm soát pH (Doleyres và cộng sự, 2002b). Whey permeate là phụ phẩm giá trị thấp của ngành công nghiệp bơ, chủ yếu chứa lactose (80 – 85%), khoáng (2.5%) và các hợp chấtchứa nitrogen (2%) trên cơ sở ẩm tự do. Sản lượng rất cao B. bifidum đạt được trong 12h lên men trong môi trường MRS-whey permeate-cysteine, đạt đến 9,0; 17,3; 15,0; và 6,3.109 cfu/ml tại pH tuần tự là 5.0; 5.5; 6.0 và 6.5, so với 8,7.109 cfu/ml trong môi trường cysteine sau 12h lên men ở pH 5.5 (Doleyres và cộng sự, 2002b) Để sản xuất thực phẩm bổ sung probiotic cho người ăn kiêng trong môi trường chi phí thấp, dịch chiết thịt chứa nước cốt thịt MRS thay thế thành công cho môi trường dựa trên peptone đậu nành, glucose và dịch chiết nấm men cho quá trình nhân giống bifidobacteria, mà không ảnh hưởng đến tổng số tế bào tối đa và thời gian ủ (Heenan, Adams, Hosken & Fleet, 2002). Một môi trường rau có chứa 6% nước ép cà rốt, 12% nước ép cải bắp và 3% nước ép hành tây thích hợp cho việc nhân giống B. breve và B. bifidum (Savard, Gardner và Champagne, 2003). Tuy nhiên, việc thất thoát lượng lớn tế bào xảy ra trong suốt quá trình dự trữ của nước ép rau củ đã lên men ở 4oC trong 30 – 60 ngày, do thể tích dịch đệm của môi trường thấp gây hại cho việc acid hóa về sau. Nghiên cứu về số lượng chỉ ra rằng sữa đậu nành hỗ trợ sự phát triển của bifidobacteria nhưng ở mức độ thấp hơn nhiều so với sữa bò hay MRS (Kamaly, 1997; Chou & Hou, 2000; Wang và công sự, 2002). Chẳng hạn, tổng số tế bào B. longum và B. bifidum sau 24h lên men trong sữa đậu nành không kiểm soát pH đạt được tuần tự 5,0.107 và 1,3.108 cfu/ml, trong khi nồng độ cao hơn 3 – 10 lần trong Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 25 sữa hoàn nguyên và MRS (Kamaly, 1997). Tương tự nồng độ tối đa đạt được trong sữa đậu nành sau 48h phát triển của những chủng khác B. infantis và B. longum đạt đến 3,2.108 và 1,3.107 cfu/ml theo thứ tự (Chou & Hou, 2000). Tuy nhiên, Garro, de Valdez và de Giori (2004) cho kết quả rằng nồng độ cao 1,5.109 cfu/ml của B. longum đạt được trong sữa đậu nành sau 8h ủ ở 37oC, chỉ ra những ảnh hưởng chính của việc lựa chọn chủng và thành phần sữa đậu nành. Trong một nghiên cứu để so sánh việc sử dụng đường trong các canh trường B. longum, lên men tế bào tự do theo mẻ và liên tục được thực hiện trong môi trường MRS chứa lactose hoặc glucose như là nguồn carbon (Kim, Song, Kang và Oh, 2003). Nồng độ tế bào cuối sau 22h lên men theo mẻ trên lactose và glucose lần lượt là 4,37 và 3,42 g tế bào khô/l, trong khi nồng độ tế bào B. longum thấp hơn trong quá trình lên men liên tục, trung bình khoảng 2.5 – 3.0 g/l cho tỉ lệ pha loãng (D) phổ rộng từ 0,07 đến 0,33 h–1. Tuy nhiên, tính theo hiệu suất, lên men liên tục cho phép sản lượng là 0,75 – 0,90 gl–1h–1 với D = 0,33 h–1, so với chỉ 0,15 – 0,20 gl–1h–1 trong suốt 22h lên men theo mẻ. Việc gia tăng D lên đến 0,4 h–1, gần với tỉ lệ phát triển đặc hiệu cao nhất của B. longum, kết quả là làm giảm khối lượng tế bào khô xuống khoảng 1,8 g/l, mà vẫn tương đương hiệu suất 0,7 gl–1h–1 (Kim và cộng sự, 2003) 2.2.3 Ảnh hưởng của những tính chất công nghệ đến đặc tính của tế bào Khả năng của vi sinh vật đường ruột phát triển và tồn tại phụ thuộc nhiều vào khả năng thích ứng với sự thay đổi môi trường của nó. Sự thích nghi với môi trường không có lợi thường xuyên kết hợp với sự cảm ứng của số lượng chủng, sự tổng hợp của protein cảm ứng với stress (stress – response) và sự phát triển của hiện tượng đề kháng chéo (cross – resistance) to various stress. Hiện nay các kỹ thuật chủ yếu dựa trên sự nuôi cấy của tế bào tự do trong tình trạng bỏ đói hoặc các điều kiện gây stress khác, ví dụ như nhiệt, nồng độ cao của muối, muối mật, H2O2 hoặc pH thấp. Nó cũng được biết đến như tế bào trong pha tĩnh có khả năng chịu đựng hơn trong môi trường so với tế bào phát triển theo hàm mũ. Tuy nhiên, một nghiên cứu nhỏ đã được biết đến trên khả năng thích nghi stress của bifidobacteria. Sự phản ứng của những chủng bifidobacteria khác nhau với việc tăng nhiệt độ gây chết, muối hoặc xứ lý muối mật bằng cách tổng hợp các protein có tính bảo vệ đặc hiệu chống stress kết quả là khả năng chịu đựng được cải thiện. Ví dụ, gia nhiệt tế bào B. adolescentis tới 47oC trong khoảng thời gian 15 phút trước khi sốc nhiệt lần lượt trong khoảng 10s và 20s. Hơn thế nữa, sự bảo vệ chéo (cross- protection) được chứng minh trong nghiên cứu này sau khi xử lý muối (salt treatment) là kết quả của sự tăng khả năng chịu đựng sau giai đoạn rã đông (frezze – thawing cycles) (14-fold khả năng tồn tại cao hơn với các tế bào khi xứ lý thô với 2% NaCl trong 1h – 14 – fold khả năng sống sót của tế bào cao hơn trước xử lý là 2%...) hoặc stress bằng nhiệt độ gây chết (lethal heat stress) (15-fold khả năng tồn tại cao hơn tại 55oC đã đạt được bằng xứ lý thô với 1.5% NaCl trong 1h). Một số nhà nghiên cứu đã quan sát khả năng thích nghi acid tại pH 5.2 trong 2h Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 26 đã bảo vệ tế bào B. breve chống lại pH gây chết xảy ra sau đó (subsequent lethal pH) (2-5), bile (0.2-1%), H2O2 (100-1000ppm) stress và trong suốt thời gian bảo quản tại những nhiệt độ khác nhau. Pha tĩnh – các chủng bifodobacteria đã được xử lý nhiệt và acid cũng đưa ra các phản hồi về sự thích nghi khác nhau và khả năng bảo vệ chéo trong các thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm (laboratory scale). Sự phản hồi của bảo vệ chéo (nhiệt bảo vệ chống lại pH thấp và pH thấp bảo vệ chống lại bile) được quan sát trong 2 chủng bifidobacteria đã được kiểm tra (B. breve và B. animalis), nhưng ngược lại sự phản hồi khả năng thích nghi (xử lý sơ bộ tại pH 3 -4 bảo vệ chống lại pH 2.5 hoặc xử lý thô tại 47oC bảo vệ chống lại nhiệt độ 55oC) được quan sát chỉ với B. longum. Hơn thế nữa, kết quả tại quy mô phòng thí nghiệm với B. animalis không thể được lặp lại tại thùng lên men (fermented scale), điều này có thể được giải thích vì sự khó khăn trong tìm kiếm điều kiện thích hợp cho các quá trình xử lý thành công của các chủng tại thùng lên men (fermenter scale). Trong một nghiên cứu khác, ứng dụng của các điều kiện stress trong suốt quá trình sản xuất B. longum và B. lactis đem lại kết quả khác trên khả năng chịu lạnh và acid. B. longum thể hiện khả năng chịu lạnh cao, trong khi B. lactis chỉ cho thấy cải thiện về khả năng chịu đựng acid, cho thấy sự phản hồi stress phụ thuộc vào loài và chủng probiotic bifidobacteria phải được lựa chọn cẩn thận cho việc sử dụng trong thực phẩm và bổ sung trong các phần ăn (dietary supplements). Tuy nhiên các điều kiện cho trước hoặc các biện pháp gây stress cũng phải có kết quả trong việc giảm sản lượng tế bào, hoạt động của tế bào và/ hoặc hiệu suất về thể tích của quá trình phụ thuộc vào chủng hoặc loài, pha phát triển và cơ chế bảo vệ gây stress. 2.3 Vi lọc Phương pháp vi lọc để tách các tế bào vi sinh vật. Cấu hình thiết bị membrane dạng sợi rỗng (hollow fiber) được sử dụng phổ biến. Kích thước mao quản membrane thường là 0,1µm hoặc 0,2 µm. Năng suất hoạt động của thiết bị có thể đạt 20000 m3/ngày. 2.3.1 Mô hình sợi (hollow fiber module) Thiết bị membrane được chế tạo bằng thép không rỉ có dạng hình trụ với đường kính thường dao động trong khoảng 2,5÷12,7cm; chiều dài: 18÷120cm. Bên trong thiết bị có chứa sợi membrane. Mỗi module chứa từ 50÷3000 sợi. Đường kính sợi thay đổi từ 0,2÷3mm. Trong quá trình thẩm thấu ngược, đường kính sợi sử dụng có thể giảm xuống 0,04mm. Thông thường chiều dày membrane từ 100÷400µm. Khi hoạt động, canh trường vi sinh vật được bơm vào bên trong thiết bị và chui vào trong các sợi membrane. Dòng ra retentate sẽ đi hết theo chiều dài sợi và tập trung thoát ra ở đầu còn lại của thiết bị. Dòng ra permeate sẽ chui qua các lỗ mao dẫn membrane, thoát ra ngoài sợi rồi được tập trung vể cửa ra nằm trên thân Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 27 thiết bị. Riêng hãng Dupont thiết kế một số thiết bị sử dụng trong kỹ thuật thẩm thấu ngược đã cho dòng nguyên liệu đi vào khoảng không gian trống giữa các sợi membrane. Khi đó, một số cấu tử sẽ chui qua mao dẫn membrane để vào bên trong sợi và tạo nên dòng permeate. Ưu điểm của mô hình sợi là thiết bị ít chiếm diện tích nhà xưởng dù diện tích membrane sử dụng rất lớn, ít tốn năng lượng cho quá trình. Tuy nhiên, trong quá trình vận hành, một số sợi membrane dễ bị tổn thương và việc thay thế chúng sẽ tốn kém và phức tạp. Để hạn chế hiện tượng tắc nghẽn mao quản membrane trong quá trình sử dụng, người ta dùng khí nén để thổi ngược định kỳ, kết hợp với quá trình rửa ngược (backwash) nhằm tách bỏ các cấu tử bám trên bề mặt của membrane. Ngoài ra, sau mỗi 4÷6 tuần sử dụng, người ta dùng hóa chất để vệ sinh membrane. Hình 8: Cấu tạo mô hình sợi Hình 9: Cấu tạo mô hình sợi (A bề mặt, B thành phần theo chiều ngang, C thành phần theo chiều dọc, D nguyên lý lọc) Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 28 2.3.2 Hệ thống thiết bị phản ứng sinh học membrane Trong một hệ thống membrane với việc cung cấp liên tục môi trường sạch, các tế bào được giữ lại trong thiết bị phản ứng sinh học bằng một màng vi lọc hoặc siêu lọc, trong khi các phân tử nhỏ khuếch tán thông qua các lỗ trên membrane theo kích thước của nó. Do đó, trong một thiết bị phản ứng có membrane, những sản phẩm chuyển hóa có tính kiềm hãm quá trình lên men bị loại ra trong dòng permeate, trong khi đó các tế bào được cô lại trong dòng retentate. Phân đoạn tế bào cô đặc có thể được thu gom tốt nhất là theo mẻ hoặc liên tục cùng với việc không hoặc có xử lý lại tối thiểu đối với nồng độ tế bào trước khi làm đông hoặc đông khô. Lượng tế bào B. bifidum (5.109 cfu/ml) và năng suất (2.1011 cfu/lh) cao được thực hiện trên môi trường dựa vào whey là chính và một thiết bị phản ứng có membrane (Corre và cộng sự, 1992). Taniguchi và cộng sự (1987) cũng đã đưa ra kết quả về nồng độ cuối B. longum cao hơn 7 lần khi thực hiện trong thiết bị phản ứng có membrane so với kết quả đạt được khi lên men tế bào tự do theo mẻ. Tuy nhiên, một giới hạn quan trọng của thiết bị membrane và việc tái sử dụng tế bào có thể xảy ra là những tế bào không ở trong tình trạng độ nhớt cao làm giảm hoạt tính chuyển hóa, điều này được cho là gây stress đột ngột bởi những tế bào trong suốt quá trình bơm qua màng membrane (Bibal, Vayssier, Goma và Parceilleux, 1991). Thêm vào đó, việc ứng dụng thiết bị phản ứng có membrane bị hạn chế vì chi phí đầu tư cao, bảo dưỡng thiết bị và tắc nghẽn màng (Tejayadi và Cheryan, 1995; Musale và Kulkarni, 1998) Hình 10: Thiết bị phản ứng sinh học có màng membrane 2.4 Rửa và bổ sung phụ gia Canh trường sau khi qua hệ thống vi lọc thì đem rửa với nước nguyên liệu đồng thời bổ sung phụ gia chủ yếu là phụ gia chống đông. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 29 Bảng 7: Một số phụ gia chống đông có thể được sử dụng Adonitol Bột sữa gầy α-tocopherol Maltodextrin β-glycerophosphate Dịch chiết malt Bovinine albumin Mannitol Calcium alginate Chất béo sữa Calcium carbonate m-Inositol Casein hydrosylate Na-alginate Carnithine Na-glutamate Dextran Pectin Dimethylsulphoxide Polyethylenglycol Gelatine Sucrose Glucose Sorbitol Glycerol Trehalose Glycogen Tween Lactose Xathangum L – acid ascorbic Dịch chiết nấm men L – asparigine Bột whey L – cysteine 2.5 Hình thành sản phẩm 2.5.1 Môi trường dạng lỏng Chỉ sử dụng trực tiếp và dự trữ trong thời gian ngắn. Sau khi rửa và bổ sung phụ gia (hoặc không cần bổ sung) đem vào sản xuất ngay, thường bổ sung ở quá trình phối trộn trong các quy trình sản xuất sản phấm có chứa probiotic. 2.5.2 Môi trường dạng lạnh đông • Freeze – drying đã được sử dụng để sản xuất probitic dạng bột qua nhiều thập niên, dựa trên cơ sở của sự thăng hoa, xảy ra ba giai đoạn: freezing, primary và secondary drying. Tế bào được làm lạnh ở –1960C, sau đó sấy thăng hoa dưới áp suất chân không (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2007). Do điều kiện nhẹ nhàng hơn spray – drying nên tỷ lệ sống sót của probiotic cao hơn trong freeze-dried powders • Trong quá trình làm lạnh tế bào sẽ bị vô hoạt (Tsvetkov & Brankova, 1983). To và Etzel (1997) đã chứng minh rằng 60 – 70% tế bào sống sót qua bước làm lạnh sẽ vượt qua được giai đoạn dehydrate hóa. Trong suốt quá trình làm lạnh, sự hình thành lớp băng ngoài tế bào làm tăng hơn áp suất thẩm thấu và tế bào bắt đầu mất nước. Nồng độ dung dịch nội bào và ngoại bào sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm dưới điểm eutectic. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 30 • Có hai cách thức làm lạnh là làm lạnh chậm và làm lạnh nhanh. o Làm lạnh chậm, quá trình khử nước tế bào diễn ra từ từ khi sự đóng băng xảy ra chậm ngoài tế bào ảnh hưởng lớn đến tế bào. o Làm lạnh nhanh có thể tránh ảnh hưởng đến chất tan và sự co tế bào quá mức (Fowler & Toner, 2005). • Các báo cáo cũng chỉ ra rằng diện tích màng tế bào càng lớn thì càng nguy hiểm hơn khi hình thành tinh thể băng bên ngoài tế bào trong quá trình làm lạnh (Fonseca, Beal, & Corrieu, 2000). Do đó, kích thước tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại probiotic trong freeze – drying, với tế bào hình cầu có kích thước nhỏ chống chịu freezing và freeze-drying tốt hơn tế bào hình que có kích thước lớn hơn (Fonseca và cộng sự., 2000). • Nước mất đi từ tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy sẽ gây hư hại bề mặt protein, thành tế bào, màng tế bào. Nước tại bề mặt có vai trò quan trọng trong việc tạo ổn định cấu trúc và nguyên vẹn các chức năng của đại phân tử vi sinh. Do đó, nước mất đi trong sấy khô có thể làm mất sự ổn định cấu trúc, tính toàn vẹn các thành phần tế bào làm giảm hoặc mất đi các chức năng (Brennan, Wanismail, Johnson, & Ray, 1986). Người ta dự đoán rằng trong quá trình sấy vị trí các phân tử lipid trên màng tế bào là nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất do các phân tử lipid rất dễ bị oxy hóa. Thêm vào đó, cấu trúc của RNA và DNA mất ổn định, dẫn tới giảm hiệu quả sự sao chép của DNA, phiên mã, giải mã. Vì thế, để đạt được kết quả tốt nhất trong việc làm khô probiotic, phải tập trung chú ý đến phương pháp để giảm đến mức tối thiểu hư hại thành phần tế bào. • Sản phẩm thương mại từ canh trường freeze-dried là kết quả của quá trình tốn kém nhiều chi phí nhưng thu lợi thấp. 2.5.3 Môi trường sấy khô • Quá trình sấy phun đòi hỏi sự phun với tốc độ cao tại nhiệt độ trên 2000C, mà sau đó luồng hơi xuyên qua bộ phận tạo thành dạng bột. Do đó kết quả của quá trình này dễ nhận thấy rằng: trong môi trường sấy ở nhiệt độ cao với thời gian ngắn, nó có thể bất lợi tế bào vi khuẩn sống. • Trong quá trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác dụng của nhiệt, sự mất nước, áp suất thẩm thấu,... (Brennan et al., 1986; Teixeira, Castro, Mohacsi- Farkas, & Kirby, 1997). Sấy phun có thể làm màng tế bào bị biến đổi, và có thể làm lọt vài thành phần nội bào từ tế bào ra môi trường xung quanh (Teixeira, Castro, & Kirby, 1995a). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 31 • Màng tế bào chất là phần nhạy cảm nhất trong tế bào vi khuẩn khi sấy phun, trong khi đó thành tế bào, DNA và ARN cũng dễ bị ảnh hưởng, giảm hoạt động trao đổi chất. Việc mất đi các liên kết hydro với nước, làm gia tăng liên kết nội phân tử các nhóm phospholipid và xúc tiến các liên kết đóng vòng. Thành phần lipid có thể bị chuyển từ trạng thái lamellar (màng mỏng) sang trạng thái gel phase (khối bán rắn), có thể xem như là sự dehydrate lamellar phase trong đó các chuỗi trở nên cứng và mở rộng hoàn toàn. Hơn nữa, các phân tử phospholipid sẽ có sự biến đổi lớn từ dạng lamellar sang dạng hexagonal phase ngay khi nước mất đi (Crowe et al., 1988; Leslie, Israeli, Lighthart, Crowe, & Crowe, 1995). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 32 3. Tiêu chuẩn chất lượng Bảng 8: Những tiêu chuẩn mong muốn và then chốt trong việc lựa chọn những probiotic trong ứng dụng thương mại (Trích từ Shah, 2006 ; Morelli, 2007) Tổng quát Tính chất Nguồn gốc Không sở hữu mầm bệnh và sự lây nhiễm Tiêu chuẩn an toàn Không có các thành phần độc hại – chất độc, hoạt tính trao đổi, đặc tính bên trong, nghĩa là kháng antibiotic Những chủng bền vững về hệ gen Khả năng sống sót mong muốn trong suốt quá trình chế biến và dự trữ. Những đặc tính cảm quan tốt. Kháng lại các phage. Tiêu chuẩn kỹ thuật Ứng dụng sản xuất trên quy mô lớn. Chịu đựng được acid trong dạ dày và dịch vị. Chịu đựng được mật. Khả năng bám chặt vào bề mặt niêm mạc, màng nhầy. Tiêu chuẩn chức năng Ảnh hưởng tốt đến sức khỏe. Khả năng miễn dịch Hoạt tính đối kháng với những chất độc trong ruột như là Helicobacter pylori, Candida albicans. Chuyển hóa cholesterol. Chuyển hóa lactose. Tiêu chuẩn sinh lý học mong muốn Những đặc tính chống đột biến và chống ung thư. Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 33 4. Thành tựu công nghệ 4.1 Đánh giá chủng Bifidobacterium spp trong việc sản xuất các probiotic tiềm năng trên môi trường đồ uống malt-base 4.1.1 Giới thiệu Chất thủy phân malt, mà bắt chước thành phần của cái được sản xuất trong nhà máy bia bắng phương pháp pha trộn, được đánh giá là cơ chất tiềm năng cho việc lên men bifidobacteria nhằm mục đích sản xuất một thức uống có bổ sung probiotic đầy tiềm năng. Những thử nghiệm ban đầu chỉ ra nhu cầu bổ sung các chất hỗ trợ sự phát triển đối với các chất thủy phân malt, và dịch chiết nấm men có nồng độ 10 gl–1 được chọn. Sự phát triển của bốn chủng Bifidobacterium spp trong chất thủy phân malt với 10 gl–1 dịch chiết nấm men được theo dõi trong 24h ở nhiệt độ 37oC. Kết quả thu được chỉ ra rằng có sự gia tăng số lượng vi khuẩn giữa 1.5 và 2.0 log10 với tỷ lệ phát triển tối đa khoảng 0.2 h–1. Lượng lớn đường và các amino nitrogen tự do vẫn còn hiện diện ở đầu pha tĩnh của quá trình phát triển. Kết thúc pha mũ được cho là giai đoạn tích tụ các chất trao đổi gây độc kết hợp với pH giảm xuống. Nấu malt là quá trình bảy mầm có kiểm soát của lúa, thóc. Nó co thể áp dụng cho bất kỳ ngũ cốc nào, nhưng barley là ngũ cốc được sử dụng nhiều nhất cho việc nấu malt. Trong suốt quá trình malt hóa, hạt bị thủy phân và giải phóng các hormone mà kích thích việc tiết các enzyme thủy phân bao gồm, amylase, pentosanase, glucanase, và proteinase. Những enzyme này chịu trách nhiệm cho việc phá việc phá vỡ những phân tử lớn trong hạt, điển hình là tinh bột, β-glucan, arabinoxylan và các protein. Sau khi hạt đã đạt được sự thay đổi tối ưu về mặt hóa sinh thì sau đó được sấy khô để ngừng quá trình nảy mầm và đem lại những đặc tính về màu và mùi. Mặc dù malt được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, nấu bia và chưng cất là những hướng sử dụng chính của malt. Sản xuất thức uống dựa trên malt là ý tưởng mới lạ có thể mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp malt và bia. Nhiều nỗ lực đã được thực hiện để sản xuất thức uống từ malt sử dụng công nghệ nấu malt hiện nay, nhưng trong những trường hợp này, việc lên men được thực hiện với vi khuẩn acid lactic hơn là với bifidobacteria. Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm đạt được môi trường từ malt nhằm hỗ trợ sự phát triển của các chủng bifidobacterium và đạt được các thông số động lực đặc trưng cho sự phát triển này. Những đặc tính lên men khác như sự tiêu thụ các chất dinh dưỡng và việc sản suất các acid hữu cơ được được đánh giá. 4.1.2 Hệ vi sinh vật Bốn chủng được sử dụng trong nghiên cứu này đều có nguồn gốc từ con người: Bifidobacterium adolescentis NCIMB 702204 (ruột người lớn), B. infantis NCIMN 702205 (ruột trẻ vị thành niên), B. breve NCIMB 702257 (ruột trẻ vị thành niên) và B. longum NCIMB 702259 (ruột người lớn). Tất cả chúng đều được lấy từ The National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Aberdeen, Scotland). Quá trình lên men thu nhận probiotic bifidobacteria . - - 34 4.1.3 Chuẩn bị giống Ống đông lạnh đem làm tan chảy thành 20ml Reinforced Clostridial Medium (Oxoid) và được ủ ở 37oC trong 24 – 36h. Giống vi sinh vât được nuôi cấy nhân giống trong Reinforced Clostridial Medium (RCM) hoặc chất thủy phân dịch chiết nấm men và dịch chiết malt trong 16 – 24h. 4.1.4 Lên men 134 g/l malt sấy khô (Muntons plc.) được hòa tan trong nước cất cùng với các chất hỗ trợ sự phát triển thiết yếu (dịch chiết nấm men hay peptone) tiệt trùng ở 121oC, áp suất 1 bar trong 20 phút. pH canh chỉnh khoảng 6.7 sau khi ly tâm. Môi trường được ủ với 1% v/v chủng và lên men thực hiện trong 24h ở 37oC. 4.1.5 Các phương pháp phân tích • Đếm số tế bào: sự phát triển của vi khuẩn được theo dõi thông qua mật độ quang tại 600 nm hoặc đếm tế bào nhìn thấy được. • Phân tích hóa học: nồng độ của đường (fructose, glucose, maltose và maltotriose) và những acid hữu cơ (lactic, acetic, acid formic) trong mẫu được phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Amino nitrogen tự do được phân tích bằng phương pháp cột ninhydrin và pH được đo bằng máy đo pH hiệu Jenway đã được hiệu chỉnh bằng dung dịch chuẩn (Fisher) ở pH 4.0 và 7.0. • Phân tích thống kê: sử dụng hàm Microsoft Excel. 4.1.6 Kết quả • Sự phát triển của môi trường thích hợp cho lên men o Ảnh hưởng của sự canh chỉnh pH lên sự phát triển của các chủng Bifidobacterium trong chất thủy phân malt. o Ảnh hưởng của việc bổ sung các chất hỗ trợ phát triển. • Những đặc điểm phát triển và lên men. o Thông số động lực lên men. Bảng 9: Các thông số động lực cho sự phát triển của Bifidobacteria spp o Sản sinh đường và amino nitrogen tự do. o pH và sự sản sinh acid hữu cơ Quá trình lên men thu nhận pro