Đề tài Sản xuất sinh khối nấm men bánh mì

t amon (chứa 20% - 21% hàm lượng nitơ) hoặc các muối photphat amon, các muối nitrat và đôi khi cả ure. Tuy nhiên trong trường hợp này lượng biotin trong dịch lên men phải được tăng cường vì rằng enzym phân giải ure của nấm men, ure amidoliase, có thể đòi hỏi một lượng lớn biotin. Photpho có thể được bổ sung dưới dạng, một loại muối thích hợp hoặc dưới dạng axit orthophotphoric. Như đã thấy trong bảng 4, hàm lượng K của rỉ đường đủ cao để thỏa mãn nhu cầu của nấm men. Đối với canxi và các nguyên tố vết cũng như vậy (trừ kẽm), song với magie thì không, nguyên tố này cần phải được bổ sung dưới dạng muối sulfat. Biotin cũng cần được bổ sung trong trường hợp chỉ dùng rỉ đường củ cải. Cũng có thể dùng một chất của biotin là desthiobiotin để bổ sung, chất này rẻ hơn và có thể được nấm men chuyển hóa thành biotin. Trong một số trường hợp cần bổ sung một số vitamin khác, như tiamin là chất có tiềm năng kích thích khả năng làm nở bột mì của nấm men. Vì rằng ngày nay rỉ đường qua các kỹ thuật sản xuất mới hầu như không còn chứa các chất sinh trưởng cho nấm men nên việc bổ sung các chất sinh trưởng vào cơ chất lên men là cần thiết. Điểm đáng chú ý là trong rỉ đường mía có lượng biotin nhiều gấp 20 lần so với rỉ đường củ cải và đáp ứng được nhu cầu biotin của nấm men (160 - 200 mg/1 tấn rỉ đường). Ngoài những thành phần có ích cho sự tăng trưởng của nấm men, rỉ đường còn chứa nhiều chất có hại. Những chất này phần lớn hình thành trong quá trình kết tinh đường hay trong quá trình bảo quản rỉ đường, chằng hạn như : canxi (Ca), sulfurơ (SO2) dùng để làm nước mía trong lại, hydroxylmethyl furfural hình thành trong quá trình nấu, kết tinh đường. Đồng thời, nếu lượng chất khô trong rỉ đường ít hơn 75% và độ pH nhỏ hơn 7, rỉ đường rất dễ bị nhiễm vi sinh vật. Các chất dinh dưỡng bổ sung: Sulfat amon (NH4)2SO4 : là nguồn đạm cho tế bào nấm men, chứa ít nhất 21% nitơ, độ ẩm không quá 1,5%. Vì sulfat amon thường được sản xuất từ axit sulfuric có thể còn lẫn FeS và FeSO3 độc đối với tế bào nấm men. Có thể xử lí bằng cách để sulfat amon ngoài không khí đến khô, 4 giờ trước khi cho vào hệ thống lên men thì pha thành dạng dung dịch. Dung dịch amoniac : dùng để chỉnh độ pH và là nguồn đạm cho nấm men, có chứa 25% nitơ Axit photphoric : nguồn photpho, nồng độ không ít hơn 70% có thể thay thế DAP. DAP : có chứa P2O5 hơn 50,5%. MgSO4 loại kỹ thuật, dễ tan trong nước, lượng MgO < 16,3%, arcenic không hơn 0,0003% H2SO4 Hóa chất chống nhiễm : clorua canxi, NaOH (xút kỹ thuật) từ 0,5-1% để chống nhiễm thiết bị và đường ống. Nước sản xuất : Để nuôi nấm men cần loại nước mềm và mềm trung bình (10 cứng tương ứng với 10mg CaO/1 lít) có độ cứng lần lượt từ 4-80 và 8-120, nước sạch, trong, không màu, không mùi, hàm lượng các muối sau đây (không hơn mg / lít) Cl- = 0.5, SO42- = 80, As = 0.05, Pb = 0.1, Zn = 5, Cu = 3, FeO = 3, hàm lượng vi sinh vật không hơn 20 vi khuẩn E.coli/ lít Dầu phá bọt : Có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt dung dịch, áp suất khí cacbonic (CO2) làm vỡ tung bọt thoát ra ngoài. Có thể dùng axit oleic hay dầu lạc, dầu cám, dầu thầu dầu, nồng độ từ 0,005 - 0,01% so với dung dịch cần phá bọt Không khí : Lượng không khí dùng trong các cơ sở nấm men có thể chứa một số lượng vi sinh vật đáng kể (đến vài ngàn/1m3). Luồng khí này cần được qua lọc trước khi dùng để sản xuất. II). Qui trình công nghệ : 1) Quy trình tổng quát trong nuôi cấy nấm men : Hình 2 : Quy trình tổng quát nuôi cấy nấm men 2) Sơ đồ khối quy trình sản xuất sinh khối nấm men bánh mì: Nhân giống Lên men Ly tâm lắng Định hình Bảo quản nhiệt độ thường Bao gói Sấy Xử lí rỉ đường Lọc thùng quay Rỉ đường Nấm men giống Men khô Hình 3: Sơ đồ khối quy trình sản xuất nấm men bánh mì Thanh trùng môi trường Chuẩn bị môi trường 3) Thuyết minh quy trình : 3.1). Xử lý rỉ đường : Mục đích : chuẩn bị cho quá trình lên men. Xử lí rỉ đường cần loại bỏ : Các chất độc hại. Hệ keo. Các chất màu. Rỉ đường trước khi được dùng để nuôi nấm men cần được xử lý để loại bớt chất keo, chất lơ lửng (huyền phù) và một số chất có hại cho sự tăng trưởng của nấm men. Hệ keo có trong mật rỉ được hình thành bởi protein và pectin. Hệ keo thường tạo ra độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của nấm men. Nếu hệ keo không bị phá hủy sẽ gây ra hiện tượng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém. Hiệu suất sinh khối thu được rất thấp. Nếu không loại bỏ hết hệ keo nói trên, sản phẩm sinh khối nấm men thu nhận được sẽ bám đầy keo này, do đó có màu vàng đậm đặc trưng của mật rỉ, không phải màu tự nhiên của nấm men. Vì vậy cần lọai bỏ các chất tạo màu trong mật rỉ trước khi làm môi trường nuôi cấy. Các biến đổi : Vật lý : + Khối lượng riêng dung dịch giảm. + Sự thay đổi màu. + Độ nhớt dung dịch giảm. Hoá học : + Hảm lượng tạp chất giảm, pH dung dịch giảm. + Các phản ứng keo tụ xảy ra. Hoá lý : Các hợp chất keo đông tụ hoặc kết tủa. Sinh học : Vi sinh vật giảm. Hoá sinh : Không có biến đổi đáng kể. Thiết bị : tháp bằng thép không rỉ (chiều cao của tháp này thường cao hơn đường kính đáy là tốt nhất) có lắp hệ thống cánh khuấy với tốc độ 30-35 vòng / phút và bộ phận lọc, gạn cặn. Loại bỏ chất keo trong rỉ đường : Có thể làm trong rỉ đường bằng 2 phương pháp : ù Phương pháp hoá học : Thường sử dụng axit sunfuric, kết hợp với vôi tôi có khả năng làm đông tụ, kết tủa chất keo. Đồng thời axit sunfuric còn liên kết với muối của rỉ đường, cạnh tranh với axit hữu cơ, phân ly protein tạo ra axit hoạt động, thích hợp cho sự sinh sản của nấm men. + Pha loãng rỉ đường (0.73 m3 nước cho 1 tấn rỉ đường). Trộn đều, thêm clorua canxi, khuấy trộn và để yên. Thêm vào axit Sunfuric, khuấy tiếp tục, sau đó để lắng. Dùng bơm hút dịch trong bên trên. + Pha loãng rỉ đường như trên. Thêm 1% vôi tôi (tính theo nồng độ rỉ đường) khuấy đều, cho sôi 10 phút. Sau đó để lắng trong 7 giờ, loại bỏ lớp dày màu đen ở đáy bồn. Bơm phần trên vào bồn chứa khác, bổ sung axit đến 0.25o axit. Cũng có thể bổ sung axit sunfuric đến 1o axit vào rỉ đường không pha loãng, cho sôi 30 phút, sau đó pha loãng rỉ đường bằng nước lạnh và xử lý vôi như trên. ù Phương pháp cơ học : Dùng máy ly tâm loại chất bẩn, chất keo + Có ưu điểm hơn so với phương pháp hóa học về kinh tế và thời gian + Giảm thất thoát so với phương pháp hóa học từ 2% còn 0.14%. + Trước khi ly tâm, pha loãng rỉ đường với nước. Thông số công nghệ: ù Phương pháp hoá học: + Thêm clorua canxi (0.9 kg vôi hoạt động/ 1 tấn rỉ đường) . Thời gian khuấy trộn và để yên : 60 phút + Acid sunfuric (6 lít axit Sunfuric cho 1 tấn rỉ đường. ). Thời gian khuấy 30 phút. Sau đó lắng từ 6 đến 12 giờ. ù Phương pháp cơ học: + Pha loãng rỉ đường với nước theo tỉ lệ 1,1:2,1:3,1:4 tùy thuộc thành phần muối Ca trong rỉ đường. Nếu lượng muối Ca trong rỉ đường <0.5% thì pha loãng 1:1, nếu là 0.6% thì pha loãng 1:2, hơn 1% thì pha loãng 1:4. Ngoài phương pháp cổ điển như trên, ngày nay người cũng có thể dùng màng polyme tích điện để tinh sạch rỉ đường. Bảng 5 : Xử lí rỉ đường nhiễm vi sinh vật, loại màu và các chất độc hại: Loại Phương pháp và thời gian xử lý Rỉ đường chứa vi khuẩn tạo nitric Rỉ đường có SO2 Axit bay hơi cao Độ màu cao( 2ml dung dịch Iốt 0,1 N) Canxi cao > 1% Chlotetracycline: từ 1-5g trên 1 m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để làm trong đường, thời gian 1 giờ Clo 11g/ 110g SO2 trong 60 phút Dùng H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường Pha loãng ít nhất 20 lần Pha loãng với nước theo tỷ lệ 1/3, hạ pH đến 4,5 để 4h, ly tâm loại kết tủa 3.2).Chuẩn bị môi trường : Mục đích : Chuẩn bị cho quá trình lên men Bổ sung chất dinh dưỡng cần thiết trong rỉ đường là nguồn thức ăn cho tế bào nấm men phát triển (nguồn N, C, khoáng,..), tạo môi trường thích hợp cho nấm men phát triển Các biến đổi: Hóa học : bổ sung thêm thành phần các chất dinh dưỡng. Bảng 6:Thành phần nguyên tố của nấm men và của rỉ đường củ cải 100g rỉ đường củ cải hàm lượng 50% saccaroza chứa trung bình : C N P K Mg Ca 33g 1,5-2g 0,03g 6g 0,025g 0,3g 100g men ép (27% chất khô) chứa trung bình : 12,3g 2,3g 0,28g 0,54g 0,03g 0,01g Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê. Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat… Nguồn nitơ và phôtpho được bổ sung với tỉ lệ phù hợp (tỉ lệ P2O5/N tổng số khoảng 1/3). Trong sản xuất thường dùng superphosphate hoặc ammonphosphate làm nguồn cung cấp phôtpho. Các nguyên tố khoáng khác nói chung trong rỉ đường đã cung cấp đủ cho nấm men phát triển ngoại trừ Mg là phải bổ sung dưới dạng MgSO4. Khi sử dụng đường mía cũng cần bổ sung thêm K và các muối ammon như (NH4)2SO4, ure, NH4OH hoặc (NH4)2HPO4. Dung dịch muối khoáng cần bổ sung tăng dần trong suốt quá trình lên men thành phẩm nhưng cần phải bổ sung hết trước khi kết thúc lên men 3 - 4 giờ. Nấm men bánh mì còn cần một số vitamin để tăng sinh khối nhanh như biotin, inositol, acid pantotenic ... (thông thường rỉ đường mía có đủ biotin). Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men + Phospho : có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn. + Lưu huỳnh : tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme. + Magiê : tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men. + Sắt : tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác. + Kali : chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic. + Mangan : đóng vai trò tương tự như magiê. Bảng 7: Ảnh hưởng của một số chất hóa học lên sự tăng trưởng của tế bào nấm men CHẤT Nồng độ làm nấm men chậm hay ngừng phát triển(%) Nồng độ làm nấm men chết(%) Sunphurơ( SO2) Natrifluo Axit nitric Formalin Karamen Axit acetic Axit formic Axit oxalic Axit sunphuric Axit photphoric Axit clohydric Ethanol 0,0025 0,002 0,0005 0,001 0,1 0,02 0,17 0,001 0,39 0,30 0,14 12 0,004 0,09 3,0 0,34 1,3 2,0 0,72 25 + Hóa sinh : có thể nhiễm vi sinh vật trong quá trình này. 3.3).Thanh trùng môi trường: Phương pháp : Hiện nay phương pháp thanh trùng trong công nghệ vi sinh phổ biến là dùng hơi nước quá nhiệt do nồi hơi cung cấp. Trong lên men từng mẻ các thiết bị sau khi làm vệ sinh được khử trùng bằng hơi nóng tới 120 – 1300C, sau đó mới cho môi trường lỏng vào các nồi lên men khử trùng môi trường cùng với cả hệ thống khuấy và các đoạn đường ống, van tiếp cận. Việc gia nhiệt cao có thể dẫn đến sự phá huỷ các thành phần dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt và caramen hoá các nguồn đường cũng như xảy ra các phản ứng melanoid giữa đường với aminoacidhoặc các vitamin bị phá hỏng. Những thành phần mẫn cảm với nhiệt có khi phải khử trùng riêng, sau đó mới trộn lẫn hoặc khử trùng theo phương pháp khác như lọc qua phin vô trùng. Ngoài cách khử trùng theo phương pháp hơi nước gián đoạn này, người ta còn dùng phương pháp khửtrùng bằng hơi liên tục bằng cách cho môi trường chảy qua thiết bị khử trùng chuyên dùng ở nhiệt độ 1400C trong vài phút. Ở đây ta sử dụng phương pháp thanh trùng bản mỏng Mục đích : chuẩn bị cho quá trình nhân giống và lên men Biến đổi : -Vật lý : nhiệt độ tăng -Sinh học : tiêu diệt vi sinh vật nhiễm Thông số công nghệ : -Nhiệt độ : 60-750C -Thời gian :10 phút Thiết bị : thanh trùng bảng mỏng Hình 4 : Thiết bị thanh trùng bản mỏng 3.4).Nhân giống : Phương pháp : Cũng giống như trong phòng thí nghiệm và qui mô pilot, muốn thực hiện một quá trình lên men ở qui mô công nghiệp phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lí đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men. Nhân giống ở đây có thể phải qua 2 - 3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3 v.v... tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Việc nhân giống thường diễn ra bằng cách nuôi chìm. Các điều kiện nuôi được lựa chọn sao cho chỉ xảy ra sự sinh trưởng chứ không xảy ra sự tạo thành sản phẩm. Khi sử dụng nấm sinh bào tử và xạ khuẩn, trước khi nuôi chìm, người ta thực hiện nhân bào tử trên môi trường đặc như môi trường cám, bột ngô... Nhân giống cấp 1 được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tuỳ thuộc vào nồi nhân giống (tương tự nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Tỷ lệ nhân giống từ ống nghiệm vào bình tam giác có thể chỉ một vòng que cấy hoặc cả dịch huyền phù của một ống giống. Từ nhân giống cấp 1 sang cấp 2 (hoặc từ cấp 2 sang cấp 3) tỉ lệ giống thường là 1- 10% thể tích dịch lên men hoặc là cao hơn, từ dịch nhân giống cuối cùng vào nồi lên men khoảng 0,5-10% Thành phần môi trường nhân giống và môi trường lên men gần giống nhau. Thông thường thì hàm lượng carbon ở môi trường nhân giống thấp hơn môi trường lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt là các chất sinh trưởng để phục vụ cho sinh sản và phát triển của giống vi sinh vật. Chế độ nuôi đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng khác nhau (nếu cùng chế độ nhiệt độ thì không cần phải quan tâm lắm). Nhưng nếu nhiệt độ lên men thấp (như lên men bia) thì cần phải nhân giống với nhiệt độ giảm dần để khi vào lên men, giống không bị choáng sốc. Chế độ sục khí ở các công đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhu cầu về ôxy cao như trong pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn. Nói chung một chủng vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men đảm bảo các yêu cầu công nghệ như sau: - Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể (Bacteriophage). - Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lí ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao nhất, thường là nữa sau của pha chỉ số. - Các thông số kĩ thuật như OD, pH, màu sắc, mùi vị... đúng như quy định của từng dây chuyền công nghệ. Mục đích : - Chuẩn bị cho quá trình lên men - Khai thác Các giai đoạn trong phòng thí nghiệm, thường dùng môi trường tổng hợp như nước mạch nha, nước cà chua cà rốt, dịch tự phân của nấm men, đường glucose,maltose làm nguồn cacbon và nito, vitamin cho nấm men. Giai đoạn sản xuất men mẹ trong phân xưởng giống sạch tuy không vô trùng triệt để nhưng nguyên liệu, nước đều được hoặc khử trùng ở 100oC trong 60 phút,hoặc được xử lí ở hypocloric. Các biến đổi : sự tăng sinh khối nấm men. Thông số công nghệ : Giai đoạn nhân giống thường tiến hành trong điều kiện vô trùng, hệ thống nuôi men kín,nguyên liệu được khử trùng hoặc triệt để trong nồi hấp áp suất ở 100oC trong 60 phút Bảng 8 : Các bước nhân giống 3.5).Lên men: Mục đích : khai thác Các yếu tố ảnh hưởng : Môi trường lên men không khác nhiều so với môi trường nuôi cấy trong quá trình nhân giống. Tuy nhiên, thành phần môi trường phải tuyệt đối ổn định để chất lượng nấm men đồng đều ở tất cả các mẻ nuôi trong suốt quá trình sản xuất và môi trường nuôi cấy phải vô trùng a. Lượng đường trong môi trường lên men : Lượng đường trong môi trường khoảng 4-5% , không nên nhiều hơn và cũng không nên ít hơn. Nếu lượng đường cao sẽ vừa lãng phí vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gấy ức chế ngược đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lượng đường quá nhỏ sẽ không đủ nguồn cacbon cần thiết cho sự tạo thành sinh khối. Nồng độ đường là nhân tố cơ bản quy định sự sinh trưởng và tốc độ lên men của nấm men. Sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae trong một môi trường chứa glucoza được thông khí cần được xem như một sự sinh trưởng kép (diauxi) trên glucose-etanol. Glucose trước hết được chuyển hóa thành etanol trong pha sinh trưởng logarit thứ nhất trong đó tế bào có tốc độ sinh trưởng cao (độ dài thế hệ là 1,7 giờ). Pha sinh trưởng thứ hai bắt đầu khi đường trong môi trường gần như bị tiêu thụ hết. Pha này được tách bịêt với pha đầu bằng một thời kỳ quá độ, một pha lag khá rõ. Tốc độ sinh trưởng của tế bào trong pha thứ hai (độ dài thế hệ 5-8 giờ) thấp hơn trong pha lên men và thể hịên trên một đường cong sinh trưởng ít dốc hơn. Ngược lại, tốc độ sinh trưởng trong pha hô hấp phụ thuộc rõ rệt vào mức độ thông khí. Trong sản xuất công nghiệp men bánh mì người ta đã quan sát thấy một độ dài thế hệ là 3-4 giờ khi rượu được tạo thành nhiều và 5-6 giờ trong môi trường không có rượu. Trong nuôi cấy tĩnh cường độ thông khí chỉ gây hiệu quả nhỏ hoặc không gây hiệu quả gì lên giai đoạn lên men hoặc lên vị trí của pha lag quá độ. Hình 5 : Độ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của nấm men Trong pha sinh trưởng logarit đầu tiên, chu trình TCA họat động chỉ để tạo ra bộ khung cacbon cho các mục đích sinh tổng hợp. Hoạt tính của các enzym thuộc chu trình oxi hóa là thấp, họat tính này sẽ tăng lên trong pha thứ hai của sinh trưởng diauxi vì rằng sự tạo thành các enzym của trao đổi chất oxi hóa đã tăng lên trong pha lag trung gian. Nếu nồng độ glucose vượt quá một mức độ nhất định (khỏang 250-300mg/L) thì các enzym này sẽ hòan tòan không được tạo thành hoặc chỉ được tạo thành ở mức độ rất thấp. Oxi kiểm sóat sự trao đổi glucose trong hiệu ứng Pasteur và vì rằng ở đây glucose kiểm sóat sự trao đổi chất oxi hóa nên hiện tượng được gọi là “hiệu ứng Pasteur ngược” hay “hiệu ứng glucose” và thậm chí “hiệu ứng Crabtree” (theo tên người báo cáo dầu tiên). Do cơ chế của hiện tượng ngày càng được hiểu rõ hơn nên thuật ngữ “kiềm chế dị hóa” ngày càng được dùng nhiều hơn. Có thể tránh hiện tượng kiềm chế dị hóa bằng cách nuôi nấm men theo phương thức sao cho nồng độ đường được duy trì ở một mức độ rất thấp như là trong một hệ thống nuôi cấy liên tục. Nấm men chứa các enzym họat động cho trao đổi chất oxi hóa sẽ chuyển trao đổi chất của nó từ oxi hóa sang lên men khi nồng độ đường vượt quá một giới hạn nhất định. Song điều này không thể chỉ được mô tả theo nghĩa tổng hợp enzym, tức là theo cùng cơ chế với sự kiềm chế dị hóa. Ngòai khả năng ức chế sự tạo thành các enzym oxi hóa (kiềm chế dị hóa), glucose cũng có khả năng (theo một cách nào đó còn chưa biết rõ) kiềm chế họat tính của các enzym này . b. Oxy Việc cung cấp oxy cho quá trình tạo sinh khối rất cần thiết. Oxy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men Saccharimyces cerevisiae. Vi sinh vật nhất là nấm men không thể sử dụng oxy ở dạng hòa không tan trong môi trường lỏng. Do đó, quá trình nuôi cấy nấm men thu nhận sinh khối bắt buộc phải được cung cấp oxy liên tục Khi số vòng quay của cánh khuấy và tốc độ thổi khí tăng thì độ hòa tan của oxy vào dung dịch môi trường sẽ tăng theo. Đồng thời làm tăng sự xáo trộn môi trường, thúc đẩy quá trình trao đổi chất và sinh sản tăng nhanh. Tuy nhiên, việc tăng tốc độ khuấy và tốc độ thổi khí chỉ đạt đến một giới hạn nhất định. Nếu tốc độ của hai yếu tố này quá cao sẽ làm tăng nhanh hiện tượng tự phân của tế bào và bọt sẽ tạo ra nhiều. Độ hòa tan của oxy bị chi phối bởi nhiệt độ của môi trường. Khi nhiệt độ của môi trường tăng thì độ hòa tan của oxy sẽ giảm. Nhiệt độ thấp thường làm tăng tốc độ hòa tan của oxy. Nếu trong quá trình lên men, nhiệt độ môi trường tăng nhanh (do quá trình hô hấp của vi sinh vật) thì ngay lập tức phải thổi khí mạnh để làm giảm nhiệt của môi trường. Nếu không làm hạ nhiệt, độ hòa tan của oxy sẽ giảm và năng suất sinh khối sẽ giảm. Trong trường hợp phải dùng những chất hoạt động bề mặt, chất phá bọt hay một số chất chống nhiễm trùng cũng làm giảm độ hòa tan của oxy. Sự tổng hợp xitocrom ở Saccharomyces cerevisiae phụ thuộc vào oxi. Ở nồng độ oxi hòa tan 0,05 µM/L hoặc thấp hơn, các xitocrom a-a3, b và c-c1 sẽ vắng mặt trong hệ thống các xitocrom.Vì vậy lượng oxi cung cấp có ý nghĩa đặc biệt. Tuy nhiên, nấm men bánh mì là lọai vi sinh vật có khả năng sinh trưởng cả khi vắng mặt lẫn khi có mặt oxi. Khi sinh trưởng trong điều kiện có mặt oxi, men bánh mì cần biotin, trong khi nhu cầu về inozitol và axit pantothenic thay đổi tùy chủng. Việc bổ sung các vitamin khác như tiamin, mặc dù có thể có ích song không tuyệt đối cần thiết. Ngòai các nhu cầu này, nấm men khi sinh trưởng trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt còn cần các thành phần khác như các axit béo chưa bão hòa và ecgosterol và một số chủng còn cần cả axit nicotinic. Thiếu các thành phần này trong môi trường, sinh trưởng chỉ diễn ra trong một vài thế hệ và sau đó dừng lại hòan tòan. Nguyên nhân của việc nấm men đòi hỏi mạnh mẽ trong điều kiện kị khí là vì sự sinh tổng hợp các axit béo chưa bão hòa và các sterol bao gồm một số bước enzym cần có sự tham gia của oxi phân tử. Sự sinh tổng hợp axit nicotinic diễn ra qua tritophan, kinurenin và axit quinolinic, và oxi phân tử cần cho cả ba bước. Các lipid không phải là nhân tố không thể thiếu khi môi trường chứa oxi. Có nghĩa là môi trường chứa oxi có thể không có lipid. Thay cho việc nói rằng nhu cầu về các nhân tố sinh trưởng tăng lên trong điều kiện sinh trưởng kị khí chúng ta cũng có thể nói rằng các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng của nấm men bao gồm cả oxi phân tử. Theo phương trình sinh trưởng đã nêu ở trên, nhu cầu về oxi nằm vào khoảng 5,5 mg oxi/ chất khô nấm men được tạo thành. Con số này tương đương với nhu cầu về magie, vì vậy oxi không thể đơn giản chỉ là một nguyên tố vết. Quan hệ của nấm men đối với oxi là một quan hệ phức tạp, điều này được thể hiện qua nhiều “hiệu ứng” kiểm soát sự trao đổi oxi ở nấm men. Ngòai “hiệu ứng Pasteur”, còn có “hiệu ứng Pasteur ngược” (đồng nghĩa với “hiệu ứng Crabtree”, “hiệu ứng glucose” hay “sự kiềm chế dị hóa”) và “hiệu ứng Pasteur âm”. Một điều đáng ngạc nhiên là mặc dầu môi trường sinh trưởng của nấm men có thể được thông khí mạnh song sản lượng vẫn thấp và hầu hết đường cơ chất bị lên men thành etanol. Hiện tượng này được mô tả vào năm 1934, được biết khá rộng rãi vào những năm 1950, song những nhà sản xuất men bánh mì đã đề ra các phương pháp nuôi cấy thích hợp (phương pháp bổ sung định kỳ) để khắc phục hiệu ứng có hại này, thu được sản lượng cao về men bánh mì và loại bỏ được sự tạo thành etanol. Nghiên cứu ảnh hưởng của oxy hòa tan đến sự phát triển của saccharomyces cerevisiea cho thấy: năng suất tạo thành sinh khối tăng dần khi tăng hàm lượng oxy hòa tan. Năng suất sinh khối nấm men đạt cao nhất khi lượng oxy hòa tan tăng từ 0.5 – 1 milimol / L / phút. Khi lượng oxy hòa tan tăng đến 4 milimol/l/phút, sinh khối giảm. Nếu tăng lượng oxy lên nữa, sinh khối sẽ giảm nhanh. Điều đó cho thấy sự tăng oxy hòa tan không phải tỷ lệ thuận với sự tăng sinh khối. Nhu cầu cung cấp oxy cho quá trình phát triển của nấm men không phải lúc nào cũng giống nhau. Do đó, ta phải thay đổi mức độ cung cấp oxy theo đúng nhu cầu thực của nấm men. Không khí trước khi đưa vào thiết bị lên men, phải được làm sạch khỏi vi sinh và các tạp chất. Các biến đổi: + Vật lý : nhiệt độ tăng. + Hoá học : hàm lượng chất khô trong dịch lên men giảm, hàm lượng oxy hoà tan giảm + Sinh học : tế bào nấm men phát triển + Hoá sinh : enzym tham gia phản ứng sinh tổng hợp tế bào Thông số công nghệ : Nấm men phát triển tốt ở pH 4,5 - 5,5. pH = 4 : tốc độ tích lũy sinh khối giảm pH = 3,5 hay pH = 3 sẽ làm sự sinh sản của nấm men bị dừng lại. Mức độ hấp thu chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzym tham gia vào sự tổng hợp protein, tạo vitamin đều tùy thuộc vào độ pH, pH ngoài 4,5-5,5 làm chất lượng nấm men giảm đi. Trong công nghiệp sản xuất men bánh mì thường lên men ở pH 4,2 - 4,5 để hạn chế vi khuẩn tạp nhiễm Duy trì pH = 4.5 - 5.5 bằng cách dùng ammoniac với liều lượng thích hợp vừa có tác dụng chỉnh pH vừa cung cấp nguồn đạm cho nấm men Nhiệt độ thích hợp cho nấm men thích hợp sinh sản là 29-31oC. Trên 43oC và dưới 28oC sự sinh sản của nấm men bị chậm hay ngừng lại. Nếu lên men ở nhiệt độ cao 35-400C thì bột nhào rất chóng chua vì khoảng nhiệt độ này thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn lên men acid lactic Thực tế ở nước ta trong mùa nắng nhiệt độ trong quá trính sản xuất có thể lên 31-34oC, làm cho sự tăng trưởng của nấm men chậm lại. Nếu hệ thống nuôi men kín, có hệ thống nước để điều hòa thì tốt,nếu không, khi theo dõi có sự dao động nhiệt trong quá trình sản xuất có thể xử lí bằng axit sorbic, hay chlortetracycline, hydrochlorid ... như đã trình bày để hạn chế sự phát triển sinh vật gây nhiễm Nuôi trong khỏang thời gian từ 8 – 16 giờ. Tối đa là 16 giờ. Nồng độ đường có thể lên đến 5 – 6 %. Hiện nay, để gia tăng hiệu suất và chất lượng men thành phẩm các nước phát triển chủ yếu khai theo những hướng dưới đây : Nuôi nấm men trong môi trường có nồng độ chất khô cao, trong đó rỉ đường có nồng đô chất khô 75 % được pha loãng từ 7-14 lần, gia tăng hiệu suất đến 140 %, chi phí cho 1 tấn nấm men giảm 50 %, chi phí năng lượng thong khí giảm 35 %. Men thành phẩm thu được có nồng độ chất khô cao, nhất là trehalose, làm tăng độ bền vững của men trong quá trình bảo quản. Giảm sự tạo thành ethanol bằng cách sục khí men mẹ trong môi trường chỉ có nguồn đạm, khoáng, sau đó 1 giờ mới bổ sung rỉ đường Số lượng nitơ hấp thụ được trong môi trường : cứ mỗi giờ lấy 10 ml dịch men (không lọc) pha với 90 ml nước cất và nhỏ từ từ dung dịch