Đề tài Shikonin và phương pháp thu nhận Shikonin từ cây Lithospermum Erythrorhizon

gelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày.Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. @ Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 7 @ Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcoholvà b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. II. Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon 1. Giới thiệu Shikonin Shikonin,được biết đến như một chất kháng khuẩn,chống viêm,chữa lành vết thương và khối u hoạt động,nó trở thành cây thuốc đầu tiên được sản xuất với quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.Shikonin có trong rễ của cây Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 8 Lithospermum erythrorhizon. Cây này trồng 5-7 năm, chiết rễ lấy được 1-2% chất khô, giá 1 kg là 4.500 USD. Nhu cầu tiêu thụ shikonin cao. Ở Nhật Bản phải nhập thêm của Trung Quốc, Triều Tiên. Một đoạn rễ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để làm bài thuốc nhân gian và ngày nay được sử dụng làm thuốc mỡ chữa bỏng.Nó có công thức cấu tạo như sau: Chuỗi phản ứng tổng hợp một dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao từ shikonin Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạchtới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin. Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 2.1.Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ Những vấn đề tồn tại trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ. Cơ sở khoa học của giải pháp : Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 9 Việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa thành rễ. Vi khuẩn này chuyển DNA của nó vào trong bộ gen của tế bào thực vật và khiến cho những gen tạo chất điều khiển sinh trưởng của rễ hoạt động.Rễ tơ có thể được nuôi cấy trong môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng thực vật và có thể sản xuất các hợp chất thứ cấp với một sản lượng lớn hơn khi không chuyển plasmid Ri. Hệ thống rễ đa bội bào là nơi lý tưởng để sản sinh ra hóa chất thực vật và chúng rất ổn định về di truyền, sinh trưởng nhanh (từ một đầu rễ nuôi cấy rễ lông có thể tăng trọng lượng từ 2500 - 5000 lần trong 3 tuần) mang lại cho nuôi cấy tế bào khá nhiều ưu điểm trong đó đáng kể là khả năng tránh nhiễm khuẩn. Các công ty Nhật Bản đã sử dụng kỹ thuật này để mở rộng nuôi cấy rễ nhân sâm, loại nuôi cấy này tỏ ra dễ điều khiển hơn. Công ty Escagenetics (California, Mỹ) cũng đã thông báo thành công trong việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy rễ lông. Taxol là chất tách chiết từ vỏ và lá kim của cây thủy tùng (Taxus brerifolia) đang được dùng thử có kết quả trong điều trị nhiều loại ung thư. Việc cung cấp taxol gặp khó khăn vì bản thân cây thủy tùng khan hiếm và hàm lượng taxol trong chúng rất thấp. Escagenetics đã có thể sản xuất taxol với nồng độ cao hơn nồng độ tự nhiên thấy trong vỏ và lá cây thủy tùng. Hiện nay, hãng Phyton Catalytic (New York, Mỹ) đã mua bản quyền sản xuất toxol hoặc chất đồng đẳng của taxol ở qui mô pilot. Giá bán taxol hiện nay được xác định là 200.000 - 300.000 USD/kg. Theo Escagenetics việc sản xuất vanillin bằng nuôi cấy tế bào công nghiệp đã là bệ phóng tốt để họ đi tới nuôi cấy tế bào taxol. Thông qua mối quan tâm về sản xuất taxol hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp dược chất được mở rộng. Tới nay mới có 10 trong số các dược chất có nguồn gốc thực vật đang được sử dụng rộng rãi (khoảng 300.000 loài) được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm, số còn lại đều được chiết trực tiếp từ cây cỏ. Thế nhưng mới đây Văn phòng thương mại và bản quyền Mỹ đã cấp quyền tác giả cho ĐH Quốc gia Florida về qui trình công nghệ bán tổng hợp thuốc chống ung thư. Công nghệ này kết hợp một chất gọi là baccatin III và một chuỗi tổng hợp để thu được một chất có cấu trúc giống chất taxol tự nhiên. Baccatin III được tách chiết từ thủy tùng nước Anh, họ hàng với thủy tùng Địa Trung Hải. Công ty dược Bristol-Myers Squibb, nơi cung cấp taxol tự nhiên chính vừa ký hợp đồng bản quyền với ĐH Quốc gia Florida để đưa công nghệ sản xuất taxol vào sản xuất. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 10 Srinivasan và cs. (1997) đã nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của 2 loài thuỷ tùng là Taxus chinensis và T. baccata trong hệ thống nuôi cấy mô hình (model system) nhằm chứng minh khả năng tương tự trong tích lũy sinh khối (biomass) và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp (taxane) thu từ nuôi cấy trong các đĩa polystyrene 6 ngăn (six-well polystyrene plates) và các bình thủy tinh (loại 25 ml và 125 ml, lắc 120 vòng/phút). Merkli và cs. (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum với sự gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040% trọng lượng khô (trên môi trường nuôi cây thích hợp nhất-McCown’s woody plant medium có 1% sucrose) gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024%). Các tác giả này cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Bổ sung 40 mg/l chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ nâng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Sevón và cs. (1997) đã tái sinh cây từ protoplast của rễ cây Hyoscyamus muticus được gây nhiễm Agrobacterium rhizogenes và sau đó phân tích hóa học trên 34 cây riêng rẽ đã trưởng thành. Kết quả nghiên cứu cho thấy các cây này có sản xuất hyoscyamine, scopolamine, và nhiều loại calystegin, và điều đáng kể là đã tìm thấy các biến dị dòng soma trong các cây này. Tuy nhiên, sự có mặt của các gen rol (A, B và C) của A. rhizogenes gây bất lợi cho việc tích lũy các alkaloid trong các cây chuyển gen ngược lại với ưu điểm của nuôi cấy rễ tơ. Sikuli và cs. (1997), đã nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi mô nuôi cấy đến sự tích lũy sinh khối và sản lượng alkaloid của rễ tơ thu được sau khi gây nhiễm cây Datura stramonium với chủng Agrobacterium ATCC 15834. Hàm lượng hyoscimine ở rễ đạt cực đại sau 6 tuần nuôi cấy khoảng 100mg/l. Bên cạnh đó, các tác giả này còn nghiên cứu ảnh hưởng của sự cân bằng ion ( -3NO , -24SO , - 42POH , K +, Ca2+ và Mg2+) đến sản lượng sinh khối và sự tích lũy hyoscyamine. Nồng độ -3NO và K+ cao cho sinh khối cao nhất, còn sản lượng hyoscyanine cao nhất khi -24SO và K+ cao. 2.2.Vi khuẩn Agrobacterium và cơ chế gây nhiễm của chúng trên thực vật. Agrobacterium là một loại vi khuẩn đất ,hiện nay đang được dùng rất nhiều trong trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp.Các plasmid của Agrobacterium có thể được sử dụng chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật hoặc dùng như một Báo cáo môn công nghệ tế bào phương tiện trung gian đ pháp sử dụng Agrobacterium đ cấp thu được. Gồm các loài Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens này có ở họ Rhizobiaceae có kh dài vào khoảng 120 bắt nguồn từ chữ Agrobacterium rhizogenes (hairy root) và g inducing tức là sinh r Cơ chế gây nhiễm trên th Trên plasmid Ti của vi khu ADN. Vùng này có kích thư tổng hợp auxin,cytokinine,opine giới hạn hai bên bằng b việc tái sinh plasmid,cho kh tiêu hóa opine. Vùng vir là vùng ADN ph động của các gene nằm trong vùng vir đư chất phenol tiết ra từ v GVHD :Lê Th ể chuyển gen khác vào trong tế bào th ã làm tăng một cách đáng kể các h tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes là vi khuẩn đất gram âm, hình que. Vi khu ả năng gây u ở thực vật. Plasmid c -150 kb, có tính chất gây u nên gọi là plasmid Ti. Ti đầu của tumer inducing. mang plasmid có khả năng gây b ọi là plasmid Ri. Ri bắt nguồn từ chữ ễ. Kích thước plasmid này tương tự plasmid Ti. ực vật của Agrobacterium tumerfaciens ẩn Agrobacterium tumefaciens có ch ớc khoảng 25kb ,có chứa gen mã hóa cho s , và các gen gây khối u (oncogene). Nó đư ở phải và trái.Ngoài ra còn có vùng ADN mã hóa c ả năng lây nhiễm (vùng vir),chuyển n ụ trách khả năng lây nhiễm.Các sản phẩ ợc tác động kích thích c ết thương là một loại protein đặc biệt như vir E ị Thủy Tiên Trang 11 ực vật.Phương ợp chất thứ ẩn ủa nó ệnh rễ tóc đầu của root ứa vùng T- ự sinh ợc ho ạp,cho việc m phẩm hoạt ủa các hợp 2, vir B, Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 12 vir D, vir D2, vir C1….Protein này có nhiệm vụ bảo vệ vùng ADN này để nó tiếp cận với hệ gen vật chủ an toàn bằng cách nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây 2 lá mầm), kích thích sinh sản ra các đoạn T- DNA bao bọc che chở các đoạn DNA này. Các Agrobacterium có đặc tính sẵn có trong tự nhiên là chuyển được gene của chúng vào cây cối thông qua một phần T-DNA của plasmid Ti hoặc Ri. Chính T-DNA của vi khuẩn được gắn vào bộ gene của thực vật sẽ làm xuất hiện khối u hoặc rễ tóc vì chúng chứa oncogene. Nhưng nếu phần T-DNA bị cắt thì plasmid Ti này vẫn giữ nguyên khả năng chuyển gene lạ vào thực vật. Do đó, plasmid Ti hiện nay trở thành một công cụ sắc bén theo đặc tính gây u vào các cây trồng. Các bước tiến hành để chuyển gen lạ vào tế bào thực vật sử dung plasmid Ti F Tách plasmid Ti từ vi khuẩn A. tumefaciens F Cắt bỏ phần T-DNA của plasmid đi F Chuẩn bị gene lạ chứa di truyền mong muốn, chẳng hạn gene độc tố của Bacillus thuringiensis để tiêu diệt sâu bọ hại cây trồng. F Chuẩn bị gene đánh dấu để theo dõi việc chuyển gene lạ vào thực vật có thành công hay không? Chẳng hạn, gene mã hóa cho một enzyme có phản ứng màu mà ở thực vật ít có như gene mã hóa enzyme - glucuronidase gọi tắt là GUS-A tạo ra màu xanh da trời đặc trưng với cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, -galactopyranoside được kí hiệu là X-gluc. Đôi khi người ta sử dụng khả năng đánh dấu của gene mã hóa luciferase - một enzyme của Đom đóm phát sáng trong tối ở các mô được chuyển gene. Cũng có khi sử dụng những gene kháng kháng sinh kanamycine - một chất ức chế sinh trưởng thực vật. F Gắn gene lạ và gene đánh dấu vào plasmid Ti thay thế vào chỗ T- DNA đã bị cắt bỏ rồi đưa vào vi khuẩn Agrobacterium. F Chuẩn bị tế bào vật chủ tiếp nhận vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmid có gene lạ như chuẩn bị các protoplast từ các thể mô, các đĩa lá. F Nuôi cấy chung vật chủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid Ti gắn gene lạ một thời gian vài ngày ở nhiệt độ ánh sáng thích hợp. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 13 F Loại bỏ vi khuẩn bằng dùng các kháng sinh đặc hiệu như carbenicilline. F Chuyển nguyên liệu thực vật vào môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tế bào và mô để tái sinh có thêm những chất kích thích sinh trưởng như 2,4 D, auxin khác v.v. F Cây tái sinh được nuôi trong vườn ươm và cuối cùng trồng ra đất. F Theo dõi các đặc tính của gene lạ biểu hiện ở cây trồng. Cần chú ý: - Cây được biến đổi di truyền cần phải được trồng trong vài vụ; - Cây chủ của vi khuẩn Agrobacterium có thể làm hạn chế sự biến đổi trong nhiều vụ thu hoạch. Sơ đồ khái quát Cơ chế gây nhiễm trên thực vật của Agrobacterium rhizogenes Cơ chế hoàn toàn tương tự như Agrobacterium tumefaciens chỉ khác ở chỗ trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ có gene sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tóc khi bị nhiễm bệnh. Plasmid Ti Cắt bỏ T-ADN Gen cần chuyển vào có gắn gen đánh dấu Agrobacterium Vật chủ Thay vào T-ADN Nuôi cấy chung Loại bỏ vi khuẩn Nuôi cấy Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 14 2.3. Thu nhận hợp chất shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon được gây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes . 2.3.1. Giới thiệu về phương pháp. Như đã giới thiệu,Shikonin là hợp chất thứ cấp đầu tiên được thu nhận với quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào rễ tơ của cây Lithospermum erythrorhizon. Để đưa shikonin vào sản xuất với quy mô công nghiệp,các nhà khoa học Nhật bản đã nghiên cứu và tạo ra dòng tế bào có khả năng tăng hàm lượng shikonin lên nhiều lần. Trong bài báo được trên Plant Molecular Biology 39: 683–693, 1999, Susanne Sommer, Annegret Köhle1, Kazufumi Yazaki, Koichiro Shimomura3, Andreas Bechthold1 and Lutz Heide đã đưa ra một phương pháp nhằm tăng lượng shikonin thu được bằng cách gây nhiễm quá trình nuôi cấy tế bào cây Lithospermum erythrorhizon với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm nhờ vi khuẩn này đưa vào tế bào của cây gen UbiC của Escherichia coli (Genetic engineering of shikonin biosynthesis hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon transformed with the bacterial ubiC gene ) 2.3.2. Nguyên liệu và phương pháp Hóa chất F Chorismate được mua dạng muối bari từ Sigma,Deisenhofen,Đức và acid shikimic được tổng hợp như miêu tả (2). 2-Aminoindan-2-phosphonic acid (AIP) nhận được từ N. Amrhein, ETH Zürich, Switzerland. Vi khuẩn,plasmids,cây,lông rễ nuôi cấy và môi trường F Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 15834 có nguồn gốc ATCC. F Cấu trúc các vector nhị phân p35S-TP ubiC và TOP-TPUbiC được mô tả bởi Siebert et al và Sommer et al.pTOP được đăng ký trong cơ sở dữ liệu dưới mã số Z37515 và mô tả bởi Gatz et al.pROK1 theo thuật ngữ của Siebert et al và Sommer et al gọi là p35S. F Chồi non của Lithospermum erythrorhizon được nuôi cấy như mô tả trong Shimomura et al. ,và sử dụng cho sự chuyển đổi gen. F Lông rễ Lithospermum erythrorhizon được nuôi cấy trong môi trường MSV hoặc M-9,môi trường dùng nuôi cấy để thu nhận shikonin . F Thành phần môi trường MSV : 4.46g muối MS 30g đường 100mg inositol 0.1mg thiamine –HCl 0.5mg pyridoxine-HCl 0.5ma nicotin acid và 2mg glycine. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 15 Môi trường được điều chỉnh tới pH 6.2-6.5 trước hấp tiệt trùng.Môi trường rắn thêm vào 10g/l agar Bacto. Việc nuôi cấy được duy trì trong tối tại 25oC,tốc độ lắc của nuôi cấy huyền phù là 50 vòng/phút. Phương thức chuyển gen F Agrobacterium rhizogenes được chuyển đổi bằng phương pháp làm tan đông. F Nuôi cấy chồi non của Lithospermum erythrorhizon được chuyển đổi nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes theo Shimomura et al. (Có nghĩa nuôi cấy tế bào Lithospermum erythrorhizon chung với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes để gây nhiễm ,gen từ vi khuẩn chuyển vào tế bào làm phát sinh rễ tơ theo cơ chế như trình bày phần vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ) F Sau khi rễ tơ phát triển,lấy các chóp rễ và duy trì trong môi trường rắn MSV,bổ sung 1g/l Carbenicilin để loại bỏ bi khuẩn. F Các cá thể chóp rễ được tách ra và chuyển sang môi trường tương tự,có thêm có thêm 100mg/l kanamycin (dòng 35S-TP ubiC ) hoặc 15mg/l hygmomycin (dòng TOP-TpubiC ).Chóp rễ nuôi cấy phát triển trong bóng tối ở 250C trong 4 tuần và kết quả của quá trình chuyển đổi này là dòng kháng kháng khuẩn được xác nhận bởi PCR.Môi trường nuôi cấy được duy trì dưới áp lực liên tục trong điều kiện có các kháng khuẩn. F Chóp rễ nuôi cấy trong môi trường agar được chuyển qua môi trường lỏng và cấy chuyền thường xuyên 2-3 tuần một lần trong bình chứa loại 300ml có chứa trung bình 75ml môi trường.Rễ này được nuôi cấy trong phòng tối ở 25 oC và tốc độ lắc 50 vòng /phút. F Dòng kháng kháng sinh kanamycin hoặc hygromycin được lựa chọn để nhận biết sự hiện diện của gen UbiC. 2.3.3. Kết quả và thảo luận Sau hai đến 3 tuần gây nhiễm,rễ tơ bắt đầu xuất hiện ,chúng được tách và cấy vào môi trường có chứa carbenicillin cho loại bỏ các vi khuẩn. Mặc dù xử lý bằng carbenicillin gây ra sự hình thành mô sẹo nhưng rễ tơ sẽ được phục hồi từ mô sẹo sau khi chuyển đến môi trường không có carbenicillin. Lông rễ (rễ tơ )phát triển là do các T-DNA của plasmid Ri của A. rhizogenes 15834. Biểu hiện của gen UbiC trong nuôi cấy lông rễ Gen UbiC có thể được nhận biết trong nuôi cấy lông rễ kháng kháng khuẩn bằng phương pháp PCR với một đoạn gen mồi đặc biệt. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 16 Kĩ thuật Southern hybridization, với ubiC là một đoạn thăm dò, cho thấy sự tiếp hợp của gen ubiC vào DNA (hình 2) và cho phép để ước tính số lượng bản sao gene đã được tiếp hợp Rễ tơ tăng trưởng là do các T-DNA của plasmid Ri của A. rhizogenes 15834. Biểu hiện của gen UbiC trong nuôi cấy lông rễ Gen UbiC được nhận thấy trong nuôi cấy lông rễ nhờ gen kháng kháng sinh. Kĩ thuật Southern hybridization, với ubiC là một đoạn thăm dò, cho thấy sự tiếp hợp của gen ubiC vào DNA (hình 2) và cho phép để ước tính số lượng bản sao gene đã được tiếp hợp. Phiên mã và dịch mã các gen ubiC dẫn đến sự hình thành các CPL hoạt động có thể được phát hiện trong chất chiết xuất cell-free. Đóng góp của phản ứng CPL đến 4HB glucoside trong Lithospermum erythrorhizon Tạm dừng nuôi cấy các mẫu L. erythrorhizon trong môi trường sản xuất Shikonin M9. Tuy nhiên, với sự hiện diện các ion amoni (ví dụ: trong MS hoặc môi trường MSV) hoặc dưới sự chiếu xạ với ánh sáng sự hình thành shikonin bị ức chế và glucose 4HB bị tích tụ. Cùng một hiện tượng được theo dõi trong nuôi cấy rễ tơ trong nghiên cứu. Nuôi cấy rễ tơ phát triển trong môi trường M9 ,tuy nhiên, vẫn còn tích tụ một số 4HB glucoside ngoài shikonin. Để cung cấp bằng chứng rõ ràng rằng phản ứng CPL đã đưa ra góp phần vào việc sự hình thành các 4HB trong nuôi cấy L.erythrorhizon đã được chuyển gen ubiC, thử nghiệm với axít [1,7-13C2] shikimic đã được thực hiện. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 17 Hai con đường có thể sinh tổng hợp 4HB, thông qua các hợp chất phenylpropanoid hoặc thông qua các phản ứng CPL khác nhau các nhóm cacboxyl trong shikimate. Sự biểu hiện của các gen ubiC trong nuôi cấy lông rễ của L .erythrorhizon giống như mong muốn đã dẫn đến sự hình thành của 4HB trong plastid. Ngược lại, vị trí gốc của 4HB và sự hình thành shikonin trong trao đổi chất thứ cấp của L. Erythrorhizon là tế bào chất và các lưới nội chất và glucozit 4HB được tích lũy trong các không bào. Việc đưa CPL-dẫn xuất từ 4HB thành 4HB glucozit và shikonin được vận chuyển bằng cách khuếch tán qua màng plastid hoặc bằng một phương tiện vận chuyển. Bản chất của quá trình vận chuyển này vẫn còn đang được làm rõ. Biến đổi của L. erythrorhizon với ubiC đã không làm thay đổi hoạt động của quá trình trao đổi chất thứ cấp.Ví dụ tác dụng ức chế của các ion amoni hoặc của ánh sáng trên sự sinh tổng hợp shikonin cho thấy những ảnh hưởng này không tác động nhiều vào các phenylpropanoid. Phản ứng của CPL vừa được giới thiệu đóng góp khoảng một phần năm trong toàn bộ quá trình sinh tổng hợp các dẫn xuất của 4HB trong nuôi cấy biến đổi gen,được thể hiện trong thí nghiệm. Khi các con đường có nguồn gốc là 4HB bị chặn bởi một trong các chất ức chế,dòng trao đổi chất thông qua phản ứng CPL đã dẫn đến những tích lũy làm thay đổi. 75% của sự tích tụ glucozit 4HB quan sát được khi không có mặt của các chất ức chế. Điều này cho thấy sự gia tăng các dòng trao đổi chất thông qua các phản ứng CPL khi các con đường có nguồn gốc 4HB bị chặn, nhưng cũng có thể được giải thích bởi sự giảmcác quá trình dị hóa của 4HB glucozit. Việc chuyển đổi với ubiC không gia tăng shikonin hình thành trong môi trường M9 .Theo thí nghiệm trước đây cho thấy 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA reductase(HMG-CoA-reductase) và 4HB geranyltransferase có tầm quan trọng trung tâm đối với cơ chế sinh tổng hợp shikonin. Sự gia tăng trong thu nhận shikonin có thể không đạt được nhờ một enzyme duy nhất mà cần sự phối hợp đồng thời của một số hoạt động, chẳng hạn như CPL,HMG-CoA reductase và geranyltransferase 4HB. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 18 2.4. Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon