Đề tài Sinh sản vô tính

i đã biệt hóa hình thành nên các lá phôi, lúc này xác suất cho một cơ thể trọn vẹn khó được đảm bảo, thông thường thai bị chết trước khi sinh. Hình 11. Cắt phôi làm đôi a. cắt phôi giai đoạn phôi dầu già b.cắt phôi giai đoạn blastocys sớm Thao tác kỹ thuật Quan điểm thứ nhất: chỉ cắt nhân, sau đó trả nửa phôi đó vào màng ZP trước khi nuôi cấy. Quan điểm thứ hai: sau khi tách (thường là phôi già) đem phôi đi cấy ngay, không cần đưa vào màng ZP. Có hai cách để cố định phôi, thứ nhất: cho các phôi bám vào đáy đĩa thao tác (như trình bày ở trên); cách thứ hai: sử dụng hai holding pipette cố định hai phôi cùng một lúc tại vị trí gần nhau sao cho thuận tiện thao tác. Chú ý cách nhận biết (tốt nhất là đánh dấu) để tránh nhầm lẫn trong thao tác giữa phôi tốt (lấy nhân) và phôi còn lại chỉ để lấy vỏ. Thao tác phôi theo quan điểm thứ nhất (a) (b) Dao cắt Dao cắt Pipette giữ Màng ZP Khoảng không quanh noãn tương Lá nuôi Khoang phôi Tế bào gốc phôi Khi phôi được cố định, dùng lưỡi dao cắt màng trong suốt, mở rộng vết cắt bằng pipette gạt, dùng micropipette hút nhân phôi (mầm phôi) ra ngoài. Cố định nhân phôi để cắt làm hai phần. Hút một nửa đưa trở lại màng trong suốt vừa cắt, còn nửa kia đưa vào màng trong suốt khác của trứng đã loại nhân trước đó. Các màng trong suốt sẽ tự chúng hàn gắn lại sau đó để bảo vệ phôi (Ozil và vs, 1982). Theo Elsdel và Seidel (1983) không cần đưa nhân phôi ra ngoài. Sau khi cố định phôi, cắt mở màng trong suốt và tiến hành chia ngay nhân phôi khi chúng còn ở trong màng. Hút một nửa nhân ra ngoài cấy vào một màng khác của trứng đã loại nhân, nửa nhân còn lại đã có sẵn màng của chính nó. Hai nửa phôi nói trên sẽ phát triển bình thường thành hai phôi mới. Thời gian tiến hành càng nhanh càng tốt, cố gắng trong khoảng 20 phút cho một phôi (Vlanov và cs, 1987). Cần chú ý khi chuyển phôi vào vỏ trứng, tránh không để tế bào sót, rơi rụng. Hình 12. Cắt phôi theo quan điểm thứ nhất Thao tác phân tách phôi theo quan điểm thứ hai - Gắn dao cắt vào hệ thống vi thao tác sao cho mũi dao thẳng góc với đáy đĩa Petri. - Đưa phôi vào đĩa có chứa sẵn 200-300 ml dung dịch nuôi cấy, đợi 3-5 phút, phôi sẽ bám xuống đáy của đĩa. - Sau khi phôi đã cố định và được quan sát rõ (dưới kính hiển vi phóng đại nhỏ), di chuyển bộ phận dao cắt xuống gần phôi, tăng độ phóng đại lên dần. - Lưỡi dao cho thấp xuống từ từ và đặt vào đúng giữa khối tế bào (giữa phôi), nếu là phôi nang phải cân đối để có thể chia 1/2 lá phôi cho mỗi nửa. - Cho dao thấp xuống nữa hướng tới đáy đĩa; khi dao đã chạm tới đáy: phôi đã được cắt (điều khiển lưỡi dao chuyển động nhanh, dứt khoát). - Chuyển phôi sang dung dịch nuôi cấy khác. Hạn chế mọi tác động mạnh, không cần thiết vì phôi sau khi cắt rất mỏng manh và đã bị tổn thương. Yêu cầu cả hai phương pháp trên phải đảm bảo mỗi nửa phôi có được ít nhất từ 40 đến 45% khối tế bào phôi còn nguyên vẹn. Điều này cần lưu ý người thao tác về việc lựa chọn dụng cụ cắt. Sử dụng các dao cắt có chất lượng không tốt có thể phá vỡ từ 20-30% các tế bào phôi, với các loại dao tốt, tỷ lệ này có thể chỉ 10-15%. Sau khi cắt, phôi được nuôi cấy trong môi trường mới từ 2-3 giờ trước khi đem cấy Khả năng sống của phôi nửa (half-embryo) Nhìn chung, nếu cắt phôi làm đôi và chuyển vào mẹ nhận thì số lượng con non tạo ra cao hơn so với cấy phôi nguyên (do số lượng được tính chung tăng gấp đôi), nhưng rõ ràng, khả năng sống của mỗi phôi nửa thấp hơn phôi nguyên, lý do chưa được tìm hiểu kỹ. Có thể vì sinh khối tế bào phôi nửa ít hơn phôi nguyên nên tín hiệu tạo ra kháng với hoàng thể yếu hơn. Tín hiệu này rất cần thiết cho sự duy trì, phát triển của thai sau này. Hình 13. Cắt phôi theo quan điểm thứ 2 Sau khi được tạo ra, các phôi nửa có thể được chuyển vào mẹ nhận của cùng loài ở dạng tươi hay đưa vào đông lạnh để bảo quản. Lưu ý rằng những tổn thương của đông lạnh, giải đông càng làm khả năng sống của phôi nửa giảm đi hơn nữa (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật) III.2.2.1.2 Tách phôi thành từng tế bào riêng rẽ Giới thiệu Đây là kỹ thuật sử dụng hệ thống vi thao tác để tách rời các tế bào của phôi giai đoạn sớm (thường là 2-4 hay 8 tế bào) và mỗi tế bào sẽ phát triển (trong một vỏ trứng mới- nếu là động vật hữu nhũ) thành một cơ thể hoàn chỉnh với điều kiện thích hợp bởi chúng có tính toàn thế. Đó chính là cơ sở có tính nguyên tắc của kỹ thuật này. Những thí nghiệm tạo dòng động vật bằng tách phôi thành các tế bào riêng rẽ đầu tiên được bắt đầu từ thế kỷ XIX. Năm 1891, Hans Diresch đã tách rời các tế bào phôi giai đoạn hai tế bào của nhím biển (sea urchin) bằng cách lắc với nước biển, những tế bào rời đã phát triển thành những cá thể riêng biệt. Hơn mười năm sau, một thí nghiệm tương tự với kết quả cũng tương tự được lập lại bởi Hans Spemann, nhưng trên đối tượng kỳ giông. Các thí nghiệm thời đó chưa kiểm soát được nhiệt độ cũng như hệ thống thao tác, hóa chất chưa tốt, nên kìm hãm sự ứng dụng của phương pháp này trên động vật hữu nhũ. Thành công tách phôi đầu tiên trên gia súc với mục đích nhân nhanh những loài có giá trị được tiến hành bởi Willasden (1979) và Ozil và cs (1982). Đến nay, kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công ở chuột nhà, chuột cống, thỏ, cừu, bò, heo và khỉ Rhesus. Quy trình Tạo phôi: Chọn phôi ở giai đoạn sớm, các phôi này có thể được thu nhận bằng cách gội rửa tử cung con vật hay tạo ra trong phòng thí nghiệm. Tách rời các tế bào: Các tế bào giai đoạn này liên kết với nhau khá yếu nên để tách rời chúng, có thể dùng enzyme trypsin hoặc lắc nhẹ trong môi trường ổn nhiệt, đồng thời không có các ion Ca2+ và Mg2+. Đóng gói tế bào phôi: Để các tế bào phát triển thành phôi, chúng được bao bởi lớp ZP. Các ZP có thể được tạo ra bằng cách hút bỏ noãn bào của tế bào trứng cùng loài hay khác loài, hoặc ZP nhân tạo Nuôi cấy: Nuôi phôi in vitro đến giai đoạn blastocyst và cấy truyền vào mẹ nhận đã gây động dục đồng pha. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật) III.2.2.1.3 Ý nghĩa Việc tăng số lượng phôi bò từ một phôi ban đầu giúp cho người chăn nuôi có nhiều bê hơn, đặc biệt là những bê giống nhau về di truyền. Điều này rất có lợi cho việc đánh giá chính xác kiểu di truyền hoặc một yếu tố nào đó của điều kiện ngoại cảnh, ảnh hưởng đến năng suất hay kiểu hình (phenotype) của vật nuôi nói chung. Một cặp sinh đôi cùng trứng có giá trị bằng cả nhóm đối chứng 10-25 hoặc nhiều hơn các bê bình thường khác. Tách phôi giúp cho việc xác định giới tính sớm của vật nuôi. Giúp cho các vấn đề nghiên cứu cơ bản và ứng dụng khác phát triển. Tuy nhiên, số lượng phôi tăng lên từ kỹ thuật tách, cắt không nhiều. Một chiến lược thao tác khác được đưa ra là chuyển nhân tế bào (nuclear transfer) hay cấy nhân tế bào (nuclear transplantation). Hình 14. Ảnh chụp thao tác tách phôi chuột giai đoạn hai tế bào bằng micropipette (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật) Chuyển Nhân (Nuclear Transfer) Chuyển nhân (2n) – Nuclear transfer (khác với chuyển gen - gene transfer ) là một phương thức điển hình của vi thao tác trong tạo dòng vô tính. Khác với vi tiêm tinh trùng, nhân tế bào sinh dưỡng của cơ thể trưởng thành (hay của tế bào phôi) được thu nhận và chuyển vào trứng trưởng thành (đã loại bỏ nhân). Kỹ thuật này giúp tạo các dòng tế bào mới, và nếu tiếp tục phát triển, một ” phôi ” mới sẽ hình thành để cho ra một cá thể mới thông qua cấy phôi. Cá thể con ra đời có một ” bản sao ” DNA chính xác của chính cơ thể mẹ đã cung cấp nguồn tế bào sinh dưỡng ban đầu nói trên. Ngoài vi tiêm, thao tác chuyển nhân có thể còn được kết hợp hỗ trợ bằng các kỹ thuật xung điện khác. Chuyển nhân là một trong các kỹ thuật quan trọng của công nghệ tạo dòng vô tính, nhưng không là phải kỹ thuật duy nhất. Chẳng hạn có thể tiến hành tách phôi (còn gọi là sự chia phôi), hay trinh sản để tạo dòng vô tính động vật. Giới thiệu Chuyển nhân là kỹ thuật then chốt của công nghệ tạo dòng động vật mà trong đó biểu hiện đỉnh cao là các sản phẩm của nhân bản (cloning) vô tính. Ở một số động vật, đã có những tế bào phôi sớm chưa biệt hóa và cả các tế bào đã biệt hóa với mức độ cao của cơ thể trưởng thành được sử dụng chuyển nhân thành công. Trong những năm gần đầy, công nghệ chuyển nhân của tế bào phôi được ứng dụng trên chuột khi sử dụng những tế bào gốc phôi thu nhận từ lớp ICM, phôi giai đoạn blastocyst. Sau đó, nhiều kiểu tế bào đã biệt hóa thu nhận từ phôi, thai hay tế bào của cơ thể trưởng thành (Wilmut và cs, 1997) được khai thác và sử dụng để chuyển nhân Hình 15. Quá trình chuyển nhân tạo cừu Dolly Sự ra đời của cừu Dolly như là một thuyết về tính toàn năng của tế bào sinh dưỡng trưởng thành đã mở ra nhiều cơ hội mới và hướng mới trong nghiên cứu. Từ đó ra đời các thuật ngữ “ Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng ” (Somatic cell nuclear transfer_SCNT) và “ Chuyển nhân tế bào phôi ” (embryonic cell nuclear transfer_ESNT). Theo trình tự thời gian, sau cừu Dolly, những động vật khác lần lượt được tạo dòng vô tính bằng chuyển nhân tế bào: chuột nhắt (Wakayama và cs, 1998), bò thuần (Kato và cs, 1998), dê (Polejaeva và cs, 2000), cừu rừng (Loi và cs, 2001), bò rừng minh–gaur (Hammer và cs, 2001), thỏ (Chesné và cs, 2002), mèo (Shin và cs, 2002), bò benteng (CBS News Stories, 2003), la (Woods và cs, 2003), ngựa (Galli và cs, 2003), chuột (Zhou và cs, 2003)… Ngoài ra, phôi blastocyst cũng đã được tạo dòng vô tính từ tế bào sinh dưỡng như trâu Bubalus bubalis (Saikhun và cs, 2002), Syncerus caffer (trâu Châu Phi) (Matshikiza và cs, 2004), linh dương Taurotragus oryx (Matshikiza và cs, 2004). Thai cũng được tạo dòng vô tính từ tế bào sinh dưỡng ở các loài linh trưởng (không phải người) (Ng và cs, 2004). Báo cáo về thành công trong tạo dòng ở chó đầu tiên vào tháng 4 năm 2005 ở Hàn quốc. Trong kỹ thuật tạo dòng vô tính chó, vai trò của tế bào trứng và chu kỳ kinh nguyệt có ảnh hưởng rất lớn và tiến trình chín của trứng có đôi chút khác biệt với các loài khác. III.2.2.2.2 Nguyên lý và quy trình cơ bản Chuẩn bị truớc đĩa vi thao tác có chứa vài vi giọt môi trường được bao phủ bởi dầu paraffin để ngăn cản sự bay hơi và nhiễm khuẩn. Những vi giọt cho phép kiểm soát các nhóm tế bào riêng rẽ dễ dàng hơn khi nhiều trứng cùng nằm trong đĩa đầy môi trường. Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp vi giọt có thể chứa nhiều loại môi trường, hóa chất khác nhau trong cùng một đĩa thao tác (chẳng hạn môi trường với những thành phần bổ sung: thuốc nhuộm huỳnh quang, hóa chất ức chế hình thành vi sợi, hóa chất rửa đầu tip… giúp việc vi thao tác dễ dàng và nhanh hơn Trứng trưởng thành in vivo cũng được sử dụng để tạo cytoplast trong các quy trình chuyển nhân, nhưng so với trứng trưởng thành in vitro , chúng quá khan hiếm. Do vậy nhiều quy trình gần đây đều sử dụng các tế bào trứng chưa trưởng thành và nuôi cấy chín in vitro. Một số nghiên cứu cho thấy có sự tương tự giữa hai loại trứng này trong hiệu quả tạo dòng. Tuy nhiên, trên thực tế ở một vài quy trình khác, việc sử dụng trứng chín in vivo cho kết quả phôi phát triển đến blastocyst cao hơn khi dùng trứng chín in vitro. Chẳng hạn Ono và cs (2001) đã coi việc sử dụng trứng chín in vivo làm cytoplast như một gải pháp để cải thiện sự phát triển của heo và chuột tạo dòng vô tính. Hình 16. Loại nhân tế bào trứng Nếu nguyên liệu di truyền (nhân) được chuyển từ một tế bào này sang tế bào khác, trước hết DNA của tế bào nhận phải được tách ra. Trong trường hợp trứng còn được bao bọc bởi màng zona pellucida, nên loại bỏ nhân ở kỳ nghỉ MII, bởi lúc này, NST đang được nén chặt và tập trung ở mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc. Quy trình chuyển nhân được khái quát gồm năm bước sau: Bước 1 - chuẩn bị cytoplast: Các tế bào trứng chưa thụ tinh được sử dụng như là tế bào nhận nhân mới, sau khi loại bỏ nhân của chính chúng. Các trứng này thường được thu nhận bằng phương pháp chọc hút buồng trứng, sau đó, nuôi trưởng thành in vitro và cuối cùng loại bỏ nhân. Quá trình bao gồm việc loại bỏ các NST ở kỳ metaphase và đẩy ra thể cực thứ nhất. DNA ty thể của trứng vẫn phải còn trong nguyên sinh chất. Bước 2, chuẩn bị tế bào cho nhân: Các tế bào cho có thể lấy từ nhiều nguồn khác nhau với nhiều mức độ biệt hóa khác nhau. Ngoài trường hợp sử dụng tế bào tuyến vú tạo cừu Dolly như đã biết, còn rất nhiều các tế bào khác đã được dùng để lấy nhân cho mục đích tạo dòng. , ví dụ: tế bào mô cơ (Vignon và cs, 1998), tế bào gốc biểu mô (Kato và cs, 1999), tế bào thần kinh vỏ não (Yamazaki và cs, 2001), tế bào tử cung (Cho và cs, 2002), tế bào máu (Panelli và cs, 2004)... Các tế bào cho nhân có thể nuôi cấy in vitro trong thời gian ngắn hay dài (điều này rất quan trọng) trước khi chuyển nhân vào trứng đã loại nhân. Sự phù hợp giữa chu kỳ tế bào cho nhân và trạng thái nguyên sinh chất của trứng luôn có ảnh hưởng lớn đến sự thành công trong tạo dòng vô tính. Do đó, ở vài trường hợp, tế bào cho nhân nên bị bỏ đói để đưa chúng về chu kỳ mong muốn. Năm 2002, lần đầu tiên, Pasqualino Loi và cs đã thực hiện thành công việc sử dụng nhân của tế bào đã ” chết ” để tạo dòng. Các tế bào granulosa bị bất hoạt bằng nhiệt từ 550 C- 750 C (cao hơn nhiệt độ sinh lý), nhân của chúng được sử dụng để chuyển tạo ra bê. Bước 3, chuyển nhân: Phương pháp thông thường để chuyển nhân của tế bào cho ( karyoplast ) vào tế bào trứng là dung hợp màng hai tế bào trên. Ba kỹ thuật phổ biến: kích thích xung điện, xử lý hóa chất (polyethylene glycol_PEG), dùng virus Sendai. Thành phần của môi trường dung hợp thông thường gồm: 0,3 M mannitol, 0,1 mM MgSO4 và 0,05 mM CaCl2 . Áp suất thẩm thấu có thể được làm thấp bằng cách điều chỉnh nồng độ mannitol 0,25–0,28 M. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng đến kết quả dung hợp, do vậy phải duy trì ổn định. Ngoài ra, cần lưu ý tới các thông số lý hóa khác (áp suất, độ keo...). Mg cần thiết cho quá trình dung hợp để cung cấp nguồn cation hóa trị hai, giúp duy trì tốt sự tiếp xúc màng giữa hai tế bào. Thêm vào môi trường 0,1 mg/ml các đại phân tử (như albumin huyết thanh bò, polyvinyl alcohol hay PVP) để ngăn cản trứng không dính vào dụng cụ. Tuy nhiên, nếu dùng các đại phân tử, chúng phải đủ lớn để không thể xuyên qua màng ZP gây ảnh hưởng đến sự tiếp xúc của hai màng cần dung hợp. Hầu hết các nhà nghiên cứu đều 239 không dùng hệ thống đệm cho môi trường dung hợp, mặc dù nếu sử dụng đệm 0,5 mM HEPES thì cũng cho kết quả tốt (Wells và cs, 1999). Để tiến hành dung hợp bằng xung điện , cặp trứng-tế bào được đặt vào môi trường nhược trương nhẹ, nồng độ ion thấp giữa hai điện cực song song. Phát xung điện một chiều với điện áp cao sẽ làm vỡ cấu trúc phospholipide trên màng, do đó tạo ra những lỗ hổng. Trong quá trình hàn gắn, các màng sẽ dung hợp với nhau. Điện áp quá cao và thời gian dài sẽ làm ly giải tế bào, nhưng điện áp thấp và thời gian ngắn, khó dung hợp. Do vậy, cần điều chỉnh sao cho thích hợp, các thông số sử dụng là1,25–1,5 kV/cm trong 50 µgiây. Có nhiều buồng chứa chuyên biệt khác nhau cho việc dung hợp trứng với tế bào, chúng có thể được điều chỉnh kích thước và vị trí các cực điện. Thông thường, các buồng dung hợp đều có hướng dẫn phương pháp tính toán lực điện trường và cách thức vận hành. Cũng có thể vi tiêm tế bào cho nhân vào bên dưới màng zona pellucida, cạnh với màng của cytoplast rồi dung hợp chúng bằng xung điện. Bằng cách này, thông tin di truyền từ tế bào cho sẽ đi vào cytoplast. Thường ngay sau đó, tế bào khởi động hiện tượng “ tái thiết lập chương trình ” nhờ sự tương tác giữa các nhân tố bên trong cytoplast với NST của tế bào cho. Ở bò, tỷ lệ thành công với dung hợp điện thường 36%-89%, tỷ lệ này ở heo là 59% và ở cừu là 63% - 85% ((Wilmut và cs, 1997; Wells và cs, 1998). Dung hợp bằng virus Sendai đã bị bất hoạt thường cho hiệu quả thấp (43% - 69%) nên ít được sử dụng. Nếu sử dụng kết hợp giữa dung hợp xung điện và virus Sendai thì kết quả cao hơn. Chẳng hạn khi sử dùng xung điện để chuyển nhân tế bào fibroblast (thu nhận từ thai và cơ thể trưởng thành) của ngựa vào trứng, tỷ lệ dung hợp từ 20%-67%; nhưng nếu kết hợp với virus Sendai, tỷ lệ dung hợp tăng lên tới 82%. Sau khi dung hợp, tiến hành hoạt hóa trứng và nuôi phôi. Có nhiều cách để hoạt hóa trứng và phôi, cũng như nhiều thuyết đưa ra về thời gian tối ưu giữa dung hợp và hoạt hóa. Sự lựa chọn phương pháp luôn phụ thuộc vào các yếu tố chủ quan và khách quan. Chuyển nhân được hỗ trợ xung điện: Wakayama và cs (1998), là những người đầu tiên sử dụng xung điện để hỗ trợ chuyển nhân (gọi tắt là kỹ thuật chuyển nhân xung điện). Phương pháp này được biến đổi từ kỹ thuật ICSI và thử nghiệm đầu tiên trên chuột. Trứng được loại bỏ nhân bằng một pipette khác có gắn với bộ phận khoan điện (Piezo drill) (xem phần kỹ thuật vi thụ tinh). Nhiễm sắc thể kì giữa và thể cực thứ nhất được hút vào pipette để loại bỏ. Sau đó ủ vỏ trứng với môi trường có chứa sẵn 5 µg/ml Cytochalasin B trong 15-30 phút, vỏ trứng sẽ lắng xuống đáy giọt môi trường. Chuyển nhân tế bào sinh dưỡng vào giọt môi trường đã chứa sẵn vỏ trứng nói trên (rửa sạch đầu pipette trong giọt môi trường để loại PVP tụ bám bên ngoài trước khi lấy nhân chuyển vào vỏ trứng). Vỏ trứng được định vị sao cho pipette chuyển nhân đi vào cùng lỗ đã được tạo trước đó trên màng zona khi loại nhân của trứng. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp có thể tạo ra một lỗ khác. Một biến tấu khác của kỹ thuật này là chuyển tế bào vào trứng trước khi loại nhân (Munsie và cs, 2000); sau đó, hút nhân nội sinh ra khỏi tế bào. Ngoài các phương pháp nói trên, có thể sử dụng kỹ thuật vi tiêm để trực tiếp đưa nhân của tế bào cho (đã được bóc màng) vào cytoplast mà không cần tạo lỗ trước. Tế bào sinh dưỡng được đặt trong môi trường 10% PVP. Màng của chúng rất yếu so với màng tế bào trứng, do đó có thể phá vỡ bằng cách dùng pipette hút vào, đẩy ra liên tiếp nhiều lần (chú ý: pipette này có đường kích trong nhỏ hơn kích thước tế bào, nhưng lớn hơn một chút so với nhân để tránh làm hư nhân). Việc làm trên tạo lực cơ học mạnh khi tế bào cọ sát nhiều lần với miệng ống pipette, khiến màng sinh chất tổn thương, lỏng lẻo và vỡ, giải phóng nhân. Hút và thu nhận nhân 2n . Tiêm nhân vào trứng có thể được tiến hành bằng phương pháp cổ điển hay dùng xung điện. Ở ngựa, với phương pháp vi tiêm cổ điển, tỷ lệ các tế bào tái thiết lập chương trình 240 là13%-30%, nếu kết hợp xung điện, tỷ lệ này tới 80% (Choi và cs, 2002), thậm chí cao hơn cả với phương pháp dung hợp bằng điện 20%- 48%. Tương tự, ở chuột, khi tiêm nhân tế bào cho vào trứng bằng phương pháp có hỗ trợ xung điện, tỷ lệ nhân được cấu trúc lại trong trứng cao tới 79%-95 (Wakayama và cs, 2001), thậm chí cao hơn cả phương pháp dung hợp bằng xung điện hay virus Sendai (Ogura và cs, 2000). Một kỹ thuật mới bỏ qua bước dung hợp hay tách nhân tế bào cho, được đưa ra bởi Jang-Won Lee (2003): sử dụng tế bào cho nguyên vẹn (không tách riêng nhân), để tiêm thẳng vào trứng nhận đã loại nhân. Quy trình này được áp dụng để tạo dòng heo với nhân cho là cumulus và thu được tỷ lệ thành công cao. Các tế bào cumulus sau khi thu nhận được ly tâm ở tốc độ 800 g trong 5 phút để rửa sạch môi trường nuôi và làm cô đặc. Huyền phù cặn bằng môi trường thao tác và đặt các tế bào vào giọt thao tác (đã chứa sẵn các trứng bị loại bỏ nhân). Có thể hút vài tế bào vào pipette chuyển để tăng nhanh quá trình. Tiến hành chuyển tế bào (thực hiện dưới kính vi thao tác ở độ phóng đại X 200). Tế bào được chuyển vào khoảng không quanh hoàng thể của trứng. Trước khi đâm thủng màng zona pellucida, tế bào cần được định vị gần với đầu pipette để làm giảm lượng môi trường đưa vào trứng. Nên đưa pipette vào trứng tại vị trí lỗ có sẵn trước đó (tạo ra trong quá trình loại nhân). Tế bào được chuyển vào khoang trứng, sử dụng bộ phận vi tiêm để đẩy ra khỏi pipette khi đã đặt chúng tiếp xúc với màng trứng ở vị trí hoàng thể và sau đó rút nhẹ nhàng pipette ra. Bước 4, hoạt hóa phôi: Phôi một tế bào hình thành được hoạt hóa bằng các tín hiệu hóa học hay xung điện để khởi động quá trình phát triển tiếp theo. Các tín hiệu hóa học nói chung, thường dùng để hoạt hóa trinh sản, ICSI cũng như trong tạo dòng động vật là ionomycin, ethanol, thimerosal, inositol 1,4,5-triphosphate và calcium ionophore A23178. Một trong các tín hiệu hóa học khác được sử dụng để hoạt hóa trứng khá thành công là dịch chiết tinh trùng (nhiều thí nghiệm cho thấy tế bào trứng có thể được hoạt hóa trinh sản từ dịch chiết của tinh trùng cùng loài. Trong tạo dòng vô tính ngựa, tỷ lệ hoạt hóa trứng bằng cách nói trên đạt tới 72%. Ngoài ra, các nhà khoa học cũng cho thấy dịch chiết từ tinh trùng của một loài khác cũng có thể kích hoạt trứng, chẳng hạn dịch chiết tinh trùng từ heo hoạt hóa trứng bò chuyển nhân có kết quả tốt (Jason G. Knott và cs, 2002). Bước 5, nuôi và cấy phôi: Phôi sau khi đã hoạt hóa, được nuôi cấy in vitro với môi trường thích hợp (đối với bò là bảy ngày). Sau thời gian này, phôi sẽ phát triển tới blastocyst (khoảng 120 tế bào), đây là giai đoạn thích hợp cho cấy truyền. (Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, 2006, Công nghệ sinh học người và động vật) III.2.2.2.3 Một số kỹ thuật chuyển nhân được ứng dụng phổ biến Kỹ thuật tạo dòng vô tính Roslin Dolly ra đời tại Viện Roslin (Scotland)–nơi mà Wilmut làm việc, nên cách thức tạo ra cừu Dolly được gọi là kỹ thuật tạo dòng Roslin. Trong thí nghiệm, Wilmut đã làm đồng bộ chu kì của tế bào cho nhân và trứng. Không có sự đồng bộ của chu kì tế bào, nhân sẽ không thể đạt được trạng thái phù hợp để được phôi chấp nhận “ sống chung ” . Bằng mọi cách, tế bào phải được đưa về trạng thái Gap Zero (G0) hoặc trạng thái nghỉ, tương ứng với trứng. Trước hết, nguồn nhân được thu nhận từ tế bào tuyến vú của cừu Finn Dorset (động vật 1), tiến hành nuôi cấy in vitro để chúng phân chia. Bước này rất hữu dụng khi cần có sự thay đổi hoạt động trong bộ gen tế bào cho nhân. Các tế bào cho nhân (và cả tế bào trứng) đều cùng được bỏ đói (starve), tức nuôi chúng trong môi trường dinh dưỡng tối thiểu, không cho phát triển. Việc này làm cho các tế bào bắt đầu “ đóng khóa ” tất cả các gen hoạt động và cùng đi vào trạng thái nghỉ G0. Trứng của cừu Blackface (động vật 2) được loại bỏ nhân và đặt cạnh tế bào cho nhân. Dùng một xung điện để dung hợp hai tế bào với nhau và đồng thời hoạt hóa sự phát triển phôi. Kỹ thuật này “ bắt chước ” sự hoạt hóa của tinh trùng một cách không hoàn toàn. Sau khi kích thích, thường chỉ một vài tế bào sống sót và phát triển thành phôi. Nếu phôi sống sót, tiến hành ủ trong tử cung (hay ống dẫn trứng) của cừu 6 ngày, giúp phôi sống và phát triển mạnh hơn so với ủ trong ống nghiệm. Cuối cùng, phôi được đặt vào tử cung của mẹ thay thế (động vật 3) đến khi sinh con (bản sao của động vật 1). Ngày 24-7-1997, tiếp tục với kỹ thuật Roslin, Ian Wilmut và đồng nghiệp báo cáo tạo dòng hai cừu cái mang gen người như đã nói ở trên. Sau đó, tháng1-1998, Đại học Massachusetts và Tập đoàn Advanced Cell Technology cùng thông báo thành công trong việc tạo ra ba con bê cũng bằng phương pháp Roslin. Hình 17. Kỹ thuật tạo dòng Roslin Kỹ thuật tạo dòng Honolulu Kỹ thuật này được đưa ra bởi Teruhiko Wakayama và Ryuzo Yanagimachi của Đại học Hawaii. Khi đó (tháng 7 năm 1998), Teruhiko Wakayama là người đứng đầu nhóm nghiên cứu Honolulu, do vậy, tên gọi kỹ thuật tạo dòng Honolulu ra đời với sự thành công rực rỡ: hơn 50 con chuột giống nhau về di truyền được tạo dòng hoàn hảo. Có ba khác biệt chính trong kỹ thuật Honolulu so với Roslin: Thứ nhất: các nhà nghiên cứu sử dụng cumulus (các tế bào bao xung quanh trứng) làm tế bào cho nhân. Các tế bào hạt này đang ở pha nghỉ, không phát triển do đó dễ dàng tái thiết lập chương trình trong trứng (đã loại bỏ nhân) mà không cần phải bỏ đói trong dung dịch đặc biệt như trong trường hợp các tế bào tuyến vú. Thứ hai: thay vì dùng dòng điện để dung nạp, ở đây nhân đã được vi tiêm vào trong vỏ trứng. Kỹ thuật này ít làm hư hại trứng hơn là việc dùng xung điện, do vậy tạo nhiều thuận lợi để phôi phát triển khỏe mạnh. Không giống như ở Roslin đã có tiến trình đồng bộ hóa (bỏ đói) hai tế bào trước đó, kỹ thuật Honolulu đòi hỏi việc nuôi cấy trung gian được tiến hành tối thiểu một giờ sau khi tiêm nhân. Việc này giúp cho các tế bào trứng tự lựa chọn nhân phù hợp và chấp nhận nhân mới. Sau năm giờ tiếp theo, trứng mới được chuyển vào trong môi trường nuôi có chất kích hoạt sự phát triển giống như trong thụ tinh tự nhiên. Wilmut sử dụng các tế bào tuyến vú nên cần phải đưa chúng về trạng thái G0. Wakayama đã sử dụng các loại tế bào Sertoli, não và cumulus... Tế bào Sertoli và tế bào não luôn ở giai đoạn G0, tế bào cumulus hầu như ở giai đoạn G0 và G1 (tế bào cumulus cho nhân có hiệu quả cao hơn các tế bào còn lại, do vậy chúng rất được ưa dùng). Trong nuôi cấy (kể cả Roslin và Honolulu), một hóa chất được thêm vào đó là Cytochalasin B, có chức năng làm ngưng sự hình thành thể cực thứ hai (trong tự nhiên, sự hình thành thể cực thứ hai của trứng sẽ chia DNA của tế bào chỉ còn một nửa để sẵn sàng nhận nửa còn lại từ tế bào tinh trùng). Do thể cực thứ hai không được hình thành, nên trứng sẽ không chia đôi bộ nhân mới 2n vừa được chuyển vào. Điều đó có nghĩa trứng coi bộ nhân mới 2n như