Đề tài So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. [8] 1.3.2. Cơ sở lý thuyết Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc đồ. [8], [11] 1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký: Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi thành sắc ký đồ( hình 1): Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng Trong đó : to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích. tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to. W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao Wb: Độ rộng đáy pic. 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ [8] Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. 1.3.2.2 Độ chọn lọc a (selectivity - factor) a= (k2' > k1' ) [4], [8] a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức: [4], [8] Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức: [4], [8] Trong đó: W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic. Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuôi càng rõ. Hiện tượng đỉnh kéo đuôi (tailing peak) có thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) có thể do lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7]. 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N Đặc trưng cho hiệu lực cột. N = 16 hay N=5,54 [4], [8] Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng công thức: 1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6 bộ phận chính sau: a/Hệ thống bơm Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất (0 - 400 bar) a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 mm ) và đuổi khí hòa tan. c/ Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu phân tích vào cột. Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động. Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp qua màng lọc 0,45 mm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi thích hợp. d/ Cột sắc ký lỏng HPLC Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp suất cao đến vài trăm bar. - Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 mm). - Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm. e/ Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa. f/ Thiết bị hiển thị kết quả Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới dạng pic. Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2 Bơm Van tiêm mẫu Binh chứa pha động Cột Bộ phận tự ghi Detector Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] * Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao. * Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic (khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định. * Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic. 1.4.Tổng quan PHƯƠNG PHáP QUANG PHổ HấP THụ UV-VIS 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng λ và cường độ Io qua dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi qua dung dịch . Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer. I = Io 10 -εCl Với ε là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer + Chùm tia sáng phải đơn sắc + Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp) + Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang). + Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh sáng (UV-VIS). 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer + Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém. + Sai lệch do hoá học: - Do sự phân ly (ion hoá): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không như nhau. - Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng đơn phân tử. + Do phản ứng các chất lạ: - Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ thiếu chất cần định lượng. - Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng ²tạo màu², phải chú ý tới điều kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng. 1.4.1.4. Một số đại lượng thông dụng[ a/ Độ truyền qua (T-Transmittance): Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt (về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa: T = = 10-εCl Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt. b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance): Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa : A = lg = ε.C.l Đối với một chất xác định (có ε xác định), thường đo trên một loại cốc đo (có bề dày thông thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: A=K.C (K=ε.l) c/ Hệ số hâp thụ phần trăm (): Theo công thức A =ε.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì : A = ε = Vậy chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một λ xác định, là một hằng số. d/ Hệ số hấp thụ phân tử (εμ): Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm. Cũng như , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định (λ, dung môi, nhiệt độ,...) εμ là một hằng số. Giữa và εμ có mối liên hệ εμ = M ở đây M là phân tử gam của chất tan. 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-VIS.[2],[4],[8] 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị biết trước (tra cứu). A = .C.l → C = (với l =1 cm) Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (λ) và mật độ quang A bằng cách: Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác định). Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số. Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị λmax xác định cho trong tài liệu )để kiểm tra lại máy. Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị λmax và tìm Amax . 1.4.2.2. Phương pháp so sánh Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) và của dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết). Ta có: = → Cx = x Cc Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả càng chính xác. Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang, phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ . Phần 2: thực nghiệm và kết quả 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử: 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: . Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp . Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dược cung cấp . Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp 2.1.1.2. Hoá chất, thuốc thử: . Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4) . Heptane sodium sulfonate, triethylamine . Acetonitril dùng cho HPLC (Merk) . Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trường đại học Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC . Một vài hóa chất khác 2.1.1.3. Thiết bị: + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode array- PDA 100 + Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg + Máy đo pH JENWAY của Anh + Máy cất nước 2 lần + Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức + Máy lọc hút chân không Satorius + Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ... + Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500 + Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh. + Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 mm... 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: . Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV- VIS . Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của hai phương pháp trên . So sánh 2 phương pháp trên 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn phương pháp phân tích Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và rút ra kết luận Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ hấp thụ UV-VIS 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: . Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê - sử dụng công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel . Một số đặc trưng thống kê được sử dụng: - Giá trị trung bình: - Độ lệch chuẩn: - Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% = 100 - Sai số chuẩn : - Sai số tương đối: - Khoảng tin cậy: = ± taSx Trong đó : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định + Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2 phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn = ; trong đó S1 > S2 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê Ftn<Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1 + Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau : T = () với = T < : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê T > : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2 2.2. Kết quả thực nghiệm : 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III * Do cú sẵn berberin, mặt khỏc dự định ỏp dụng phương phỏp này cho cả berberin trong cỏc dạng bào chế nờn chỳng tụi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn. Cách tiến hành : + Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hoà tan trong 200 ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy 10 ml dung dịch này pha loãng với nước đến 100 ml (C = 20g/ml) + Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối chiếu berberin clorid + Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện tại bước sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày 1 cm. * Cách tính kết quả : Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo công thức : C% = C Trong đó : C% : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu thử. C : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn At : Độ hấp thụ của dung dịch thử. Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử. mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã cân để pha dung dịch chuẩn. Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 . Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C% 1 0,1971 0,269 86,50 2 0,2010 0,272 85,76 3 0,2062 0,280 86,06 4 0,2090 0,285 86,42 5 0,2030 0,277 86,48 Chuẩn 0,2001 0,263 83,30 Theo kết quả ở bảng 1, ta có: Giá trị trung bình: = 86,24% Độ lệch chuẩn : S = 0,324 Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): ∆X(%) = 0,40 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37% Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24%0,40%. 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III 2.2.2.1./Tính chính xác : Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1 Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là chính xác 2.2.2.2 Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Cách tiến hành tương tự 2.2.1 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch STT 1 2 3 4 5 C (mg/ml) 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240 A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch - Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013; - Hệ số tương quan: 0,998 - Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009 - Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept: b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042 Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. 2.2.2.3. Độ đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng cân dùng khi định lượng) . Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình . Tính toán kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g Kết quả thu được ghi ở bảng 3 Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS STT Khối lượng cân (g) Lượng hoạt chất có thực a (g) Độ hấp thụ trung bình (A) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại (b/a.100%) 1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88 2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77 3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86 Từ kết quả bảng 3 ta có: - Trung bình % tìm lại: 100,17% - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008 - Hệ số tương quan: r = 0,999 - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019 - Với độ tin cậy 95% ta có: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992 < a < 1,112 Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009 hay - 0,017 < y_intercept < 0,001 Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất có thực Kết luận: - Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. - Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1. - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.2.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng Tiến hành: + Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hòa tan trong 200 ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào 4 bình định mức 100 ml. + Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của berberin clorid đem đo . Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hòa tan trong 20 ml nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml. . Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức 50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml. . Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml không thêm palmatin và thêm nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước sóng 421 nm Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới độ hấp thụ quang của berberin clorid Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4 Berberin clorid 0,2 mg/ml (ml) 10 10 10 10 Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10 Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10 Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266 Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5% palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu có 2% palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả định lượng tăng 0,91% Vậy phương pháp không có tính đặc hiệu. 2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu - Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hóa - Detector UV: 263 nm - Pha động: đệm phosphate [ hỗn hợp KH2PO4 0,05M và heptan Na sulfonate(1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh pH=3,0 bằng H3PO4] – acetonitril (60:40). - Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng thí nghiệm - Thể tích tiêm: 20μl - Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút * Tiến hành: + Dung dịch thử: Cân 0,04 g berberin clorid hòa tan trong nước nóng, cho vào bình định mức 100 ml.Sau đó làm lạnh và thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 μm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch. + Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu berberin clorid + Tiêm lần lượt 10 μl dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, chạy sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Dựa vào diện tích hoặc chiều cao pic trên sắc đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, nồng độ của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) Berberin clorid có trong mẫu thử theo công thức sau: HL% = Trong đó: : Diện tích pic mẫu thử : Diện tích pic mẫu chuẩn (= 12,2646) : Khối lượng cân mẫu chuẩn (0,0405 g) : Khối lượng cân mẫu thử 83,30: Hàm lượng thực của mẫu chuẩn Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%) 1 0,0407 12,6917 85,78 2 0,0402 12,6120 86,30 3 0,0398 12,4224 85,86 4 0,0405 12,7101 86,32 5 0,0400 12,5350 86,20 Chuẩn 0,0405 12,2646 83.30 Theo kết quả ở bảng 5, ta có: - Giá trị trung bình: = 86,09 % - Độ lệch chuẩn: S = 0,254 - Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X (%) = 86,09% 0,315% - Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,295 Vậy theo phương pháp định lượng trên, hàm lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu là: 86,09% 0,315% 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): 2.2.4.1. Tính chính xác: Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.3 Kết quả thử độ chính xác cho thấy độ lệch chuẩn của các kết quả RSD =0,295 % < 2%. Vậy phương pháp là chính xác. 2.2.4.2. Tính tuyến tính: Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic trên chất chuẩn Berberin. Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lượng từ 0,1600g→ 0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lượng) Tiến hành tương tự 2.2.3 Kết quả thu được ở bảng 6 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch STT 1 2 3 4 5 C (μg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48 Diện tích pic (mAU.min) 9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069 Hình 10: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng độ của dung dịch - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002 - Hệ số tương quan: R = 0,9999 - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003 - Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept <0,011 Nhận xét: Hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120% nồng độ làm việc. 2.2.4.3. Tính đúng: . Cân 3 mẫu chất đối chiếu berberin clorid (hàm lượng 83,3%) với khối lượng từ 0,032g → 0,048g (tại các điểm 80%,100%,120% so với lượng cân dùng khi định lượng). . Mỗi mẫu chạy sắc ký 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành tương tự 2.2.3 . Tính toán kết quả khảo sát tính đúng dựa trên diện tích pic của mẫu chuẩn là 12,2646 mAU.min ứng với khối lượng cân 0,0405 g. Két quả thu được ghi ở bảng 7 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC STT Khối lượng cân(g) Lượng Beberin clorid có thực a (g) Diện tích pic trung bình (mAU.min) Lượng tìm lại trung bình b (g) Phần trăm tìm lại %=b/a100% 1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75 2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70 3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75 Hình 11: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương quan giữa lượng hoạt chất có thực và lượng tìm lại - Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 0,997x + 0,001 - Hệ số tương quan: R = 0,999 - Trung bình % tìm lại :100,07% - Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,001 - Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,013 - Với độ tin cậy 95% ta có: Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038 Khoảng tin cậy của y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 < y_intercept <0,004 Kết luận : - Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0. - Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1. - Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,07% nằm trong khoảng từ 98% đến 102%. Như vậy phương pháp là đúng trong khoảng khảo sát. 2.2.4.4. Tính đặc hiệu: Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí nghiệm không có chất chuẩn