Đề tài Sự cải thiện tính di động tinh trùng của cá hồi cầu vòng - Oncorhynchus mykiss đực đã được chuyển đổi giới tính (XX), bằng cách ủ tinh dịch trong môi trường nhân tạo có pH cao

Sự cải thiện tính di động tinh trùng của cá hồi cầu vòng-Oncorhynchus mykiss đực đã được chuyển đổi giới tính (XX), bằng cách ủ tinh dịch trong môi trường nhân tạo có pH cao. Tóm tắt Thay đổi thời gian di động của tinh trùng được thu thập từ tinh hoàn và ống dẫn tinh bình thường và cá hồi cầu vòng đực chuyển đổi giới tính(XX) trong dung dịch muối sinh lý cân bằng đã được kiểm tra sau khi ủ trong môi trường nhân tạo có pH cao. Mặt dù không được xử lý trong môi trường pH cao các tinh trùng trong ống dẫn tinh di động 60s -90s trong dung dịch muối cân bằng. Trong suốt thời gian ủ trong môi trường nhân tạo có pH=7 thì các tinh trùng khó di chuyển giống như các tinh trùng trong môi trường muối cân bằng. Bằng cách trì hoãn và ủ trong môi trường nhân tạo có pH=9.9 trong 2h ở 40C, tỉ lệ tinh trùng có thể di động tăng từ mức 0-5% đến 80%. Các tinh trùng vẫn di động sau khi ủ dài hạn (12h) ít nhất là 2 phút. Khi trứng đủ điều kiện thụ tinh với tinh trùng không được xử lý hay được xử lý với môi trường pH cao trong 2h, thì tỉ lệ sống tăng từ 5.5% đến 53.8% ở giai đoạn mắt trong môi trường có pH cao. Tinh trùng được ủ ở môi trường có pH cao sẽ tăng khả năng di động đặc biệt đối với những trường hợp mất ống dẫn tinh thì khả năng di động của tinh trùng rất kém. Bằng cách này, có thể tăng hiệu quả rõ rệt cho sản xuất số lượng lớn cá toàn cái hay tất cả cá tam bội không có khả năng sinh sản ở thế hệ con. Lời mở đầu Cá toàn cái hay cá không có khả năng sinh sản là mong muốn ngăn chặn những tác động bất lợi cho sự trưởng thành của cá hồi và cá hồi cầu vòng (Donaldson&Hunter 1982,Lincoln&Scott 1983, Lincoln & Bye 1984, Bye & Lincoln 1986,Benfey et al. 1988, Quillet et al. 1988, Olito & Brock1991, Johnstone et al. 1991, McGeachy et al. 1995,Ojolick et al. 1995). Các chi nhánh kinh tế đã ảnh hưởng đáng chú ý đến quản lý cá giống. Giới tính được xác định phần lớn ở các mô hình cá hồi là XY (Johnstone et al.1978, Donaldson & Hunter 1982, Yamazaki 1983,Devlin&Nagahama 2002). Vì vậy để thế hệ con là cá toàn cái thì trứng cần được thụ tinh với tinh trùng chỉ mang một nhiễm sắc thể X (Donaldson et al. 1993). Cho mục đích này, các phương pháp được phát triển để đảm bảo giới tính cho con cá đực chuyển giới tính(XX), bằng cách tổ hợp di truyền của các cá thể, như vậy cá đực giữ nhiệm vụ là sản xuất còn cá cái giữ nhiệm vụ là di truyền ở các thế hệ tiếp theo bằng cách kiểm tra di truyền chéo hoặc lấy con cái làm di truyền và chuyển đổi giới tính của nó (Purdom1983, Thorgaard 1983,1986, Tsumura et al. 1991). Kích dục tố nam được sử dụng trong trường hợp thay đổi giới tính này là 17α-methyltestosterone (Okada 1979, Nakamura 1994, Piferreret al. 1994). Tuy nhiên, bất thường về cấu trúc và chức năng xảy ra trong quá trình phát triển tinh hoàn khi tập trung hormone và nhiệt độ dịch hormone là không phù hợp. Nhiệt độ quy ước cho nước nuôi để sản xuất con cháu, đặc biệt là nhiệt độ nước ở mùa xuân không thấp hơn 12oC, trong mùa đông đó là thời kì sự khác biệt giới tính của cá hồi. Tần số của loài cá có tinh hoàn hướng về phía trước và không có ống tinh hoàn tăng lên đáng kể ở con cá đực. (Bye & Lincoln 1986). Mặc dù là tinh hoàn có thể sinh tinh và sự sinh tinh khi sử dụng 17α-methyltestosterone ở nhiệt độ nước cao. Để sản xuất thế hệ cá con bằng sử dụng cá đực chuyển đổi giới tính (XX) với tinh hoàn bất thường, tinh hoàn phải được chọn ra từ con cá đực chuyển đổi giới tính, và trứng được thụ tinh với tinh trùng X lấy từ tinh dịch ở tiểu thùy trong tinh hoàn cách làm nhân tạo dễ hư hỏng.Tuy nhiên, các tinh trùng không di động trong tinh hoàn, các roi không hoạt động dẫn đến khả năng thụ tinh kém. Với nền tảng như vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi cố gắng nâng cao hiệu quả sản xuất cá toàn cái bằng cách cải thiện tính di động của tinh trùng của cá hồi đực chuyển đổi giới tính (XX). Vật liệu và phương pháp: Tinh trùng được lấy từ tinh hoàn của chính con đực chuyển đổi giới tính, những con cá này phát triển trong môi trường có chứa 17α-methyltestosterone, phần phát triển của con đực mở bụng của 5 con cá. Tinh trùng được lấy ra từ ống dẫn tinh trùng bằng cách bóp dưới bụng.Tinh dịch nhân tạo (ASP) cho họ cá hồi gồm có: 7,6g NaCl, 2,98g KCl, 0,37g CaCl2.2H2O, 0,31g MgCl2.6H2O, 0,21g NaHCO3, 1000ml nước cất. Điều chỉnh pH bằng cách thêm NaOH 1N. Để so sánh những biến đổi (biến hóa) giữa tinh trùng trong tinh hoàn và ống dẫn tinh, kiểm tra sự ảnh hưởng của những giá trị pH khác nhau lên mỗi loại tinh trùng, hai loại tinh trùng này được pha loãng 100 lần với ASPs pH 8.0 và pH 10.5 (ASP 8.0 và ASP 10.5). Sau khi ủ khoảng 10 phút, lấy 0.02 ml dung dịch đã huyền phù cộng với 0.05 ml dung dịch muối sinh lý hòa tan (BSS; 7.5g NaCl, 0.2g KCl, 0.2g CaCl2.2H2O, 0.02g NaHCO3 và 1000ml nước cất). Thời gian di động của tinh trùng được quan sát trực tiếp dưới kính hiển vi. Ngay khi BSS tác động thì được quy ước như là thời gian khởi đầu, và thời gian di động kết thúc khi tất cả tinh trùng dưới kính hiển vi ngừng di chuyển. Sau đó, tinh trùng lấy từ tinh hoàn được huyền phù trong ASPs với 3 giá trị pH khác nhau (ASP 7.4, ASP 8.4, ASP 9.9) và ở nhiệt độ 40C. Những dung dịch huyền phù này được dùng để kiểm tra thời gian di động và phần trăm tinh trùng di động như nhân tố quyết định sự di động của những tinh trùng ngay sau khi pha loãng và ủ trong khoảng thời gian 10, 20, 40, 60, 90, 120, 150 phút. Tính di động của tinh trùng được ghi nhận khoảng 12 giờ trong APS tại một giá trị pH nào đó để kiểm tra ảnh hưởng dài hạn. Để xác định ảnh hưởng của pH trong ASP, dung dịch mà tinh trùng được ủ trên tỷ lệ sống sót trong giai đoạn mắt, tinh trùng được lưu trữ khoảng 2 giờ trong ASPs 7.0 và 9.9 (ASP 7.0, ASP 9.9) được thụ tinh vào full-sib eggs và giai đoạn mắt và tỷ lệ sống sót trong swim-up được so sánh. Tất cả các số liệu được trình bày có ý nghĩa +- SEM. t- test được sử dụng để so sánh các giá trị theo yêu cầu. Kết quả: So sánh ảnh hưởng của pH lên tính di động của tinh trùng lấy từ tinh hoàn và tinh trùng lấy từ ống dẫn tinh của cùng một loài cá Thời gian di động của tinh trùng lấy từ tinh hoàn và tinh trùng lấy từ ống dẫn tinh được ủ trong ASP 8.0 và ASP 10.5 ở BSS được trình bày ở bảng 1. Mặc dù, tinh trùng lấy từ tinh hoàn được ủ ở ASPs 8.0 thì không di chuyển trong BSS, những tinh trùng được ủ ở ASP 10.5 thì di chuyển với thời gian di chuyển là 35s. Ngược lại, tinh trùng lấy từ ống dẫn tinh di chuyển khoảng 3 phút và 33 giây sau khi ủ trong ASP 10.5, mặc dù khi tinh trùng được ủ trong ASP 8.0 thời gian di động được ghi nhận khoảng 1 phút. Thời gian lưu trữ và tính di động của tinh trùng Kết quả thu được của tính di động bằng cách ủ tinh trùng lấy từ tinh hoàn trong ASPs với những giá trị pH khác nhau được trình bày ở bảng 2. Các tinh trùng lấy từ tinh hoàn ủ trong ASP 7.4 thì không di chuyển từ khi bắt đầu ủ cho đến 150 phút sau khi ủ. Tinh trùng lấy từ tinh hoàn ủ trong ASP 8.4 di động khoảng 10 giây sau khi ủ khoảng 40 phút và 28 giây sau khi ủ khoảng 2 tiếng, mặc dù chúng không di chuyển trong khoảng thời gian 20 phút đầu tiên. Tỷ lệ tinh trùng di động là 11.5%. Tinh trùng lấy từ tinh hoàn ủ trong ASP 9.9 thì không di động trong 10 phút đầu. Tuy nhiên, 20 phút sau đó tinh trùng di chuyển khoảng 3.2 giây và bắt đầu di động ở khoảng thời gian này. Hơn nữa, 150 phút sau tinh trùng di động khoảng 48.8 giây và tỷ lệ tinh trùng di động là 80%. Bởi vậy, có thể xác định rằng ASP 9.9 thích hợp hơn cho tinh trùng lấy từ tinh hoàn di động. Kết quả của các thí nghiệm tương tự như sử dụng tinh trùng lấy từ tinh hoàn ở giai đoạn cuối của spermiation của một con cá đực đã được chuyển đổi giới tính được trình bày ở bảng 3. Những tinh trùng lấy từ tinh hoàn tiếp tục di chuyển 20-60 giây sau khi đặt vào ASP. Bên trong tinh hoàn nơi tốt nhất để tinh trùng sản xuất ra với số lượng lớn và môi trường của tinh trùng bên trong tinh hoàn tương tự như trong ống dẫn tinh. Kết quả như vậy thường thu được cho tinh trùng lấy từ tinh hoàn vào giai đoạn cuối spermiation. Ở đây không có sự khác biệt đáng kể trong tíh di động của tinh trùng trong ASP 9.9, 8.4 và 7.0 tại 0 thời gian ủ. Tại thời gian ủ 120 phút trong ASP 8.4, thời gian di động của tinh trùng trở nên ổn định ở 30-40 giây, và sự thay đổi thì không đáng kể. Tuy nhiên, tinh trùng ủ ở ASP 9.9. di động với thời gian dài hơn tinh trùng ủ ở ASP 8.4 với thời gian ủ là 40 phút. Tương tự, thời gian di động được ghi nhận khi ủ ở ASP 8.4. Tinh trùng ủ trong ASP 7.4 chỉ ra rằng giảm mạnh thời gian di động và dừng lại ở thời điểm 60 phút sau khi ủ. Ảnh hưởng của sự bảo quản lâu dài lên tính di động của tinh trùng. Tinh trùng được bảo quản 12 giờ trong ASP 8.4 hoặc ASP 9.9 đã có thời gian di động 2 phút và 70% tinh trùng di động sau khi cho SSB vào. Tinh trùng bảo quản trong ASP 7.4 thì không di động ở tất cả thời gian thậm chí 12 giờ sau khi bắt đầu ủ. Ảnh hưởng của tính di động của tinh trùng lên kết quả sản xuất thế hệ con từ giai đoạn mắt và giai đoạn swim-up. Sự khác biệt trong các kết quả của giai đoạn mắt và swim-up do sự khác biệt về pH của ASP trong thụ tinh được trình bày ở bảng 4. Giai đoạn mắt và giai đoạn swim-up thhu5 tinh trong ASP 7.0 được 5% và 3%, và cấy trong ASP 9.9 chúng được 53.8% và 47.5%. pH của ASP sử dụng để thụ tinh ảnh hưởng đáng kể đến kết quả đời con. Do đó, nó đã được xác định rằng tính di động của tinh trùng ảnh hưởng đến việc sản xuất và chất lượng trứng. iii-Thảo luận Nói tóm lại, tính di động tinh trùng cá khác nhau giữa các loài. Tinh trùng của hầu hết cá nước mặn hay nước ngọt đều không hoạt đông trong môi trường tinh dịch có áp suất thẩm thấu bằng nhau. (Morisawa 1985, 1997, Billard & Cosson 1992). Tuy nhiên tinh trùng bắt đầu chuyển động khi nó được pha loãng là giải pháp cho cá xương ở nước ngọt cũng như cá ở biển. (Lahnsteiner et al. 1992, 1996, Ohta & Tsuji 1998, Detweiler & Thomas 1998). Roi của tinh trùng thuộc họ cá hồi bắt đầu chuyển động ngay khi tinh dịch được pha loãng là một giải pháp tập trung hạ nồng độ ion k+, mặt dù chúng không di chuyển trong trường hợp đã được pha loãng cho phù hợp với nồng độ k+.(Lahnsteiner et al. 1993, 1997, 1998). Hiện tượng giống như vậy ở shishamo smelt Spirinchus lanceolatus (Ohta et al. 1995), zebrafish Brachydanio rerio (Takai & Morisawa 1995), Japanese eel Anguilla japonica (Ohta et al. 1997) and ayu Plecoglossus altivelis (Ohta et al. 2001). Tuy nhiên, ngay lập tức sau đó tinh trùng không còn khả năng di động (Morisawa & Morisawa 1986, Miura et al. 1992, Lahnsteiner et al. 1999). Sau đó các tình trùng trong tinh hoàn di chuyển đến ống dẫn tinh. Tiềm năng di động của tinh trùng được phát triển trong than lưu trữ trong rãnh nang và ống dẫn tinh (Morisawa & Morisawa 1986). Tinh dịch bán thương phẩm, đã được khôi phục tính di động. Những tinh trùng đang di động trong nước sau khi chúng được lấy ra bằng cách nhấn vào bụng của cá. (Morisawa 1985, Miura et al. 1992; Lahnsteiner et al. 1993, 1998). Tuy nhiên, có nhiều trường hợp tinh trùng của con cá hồi đực chuyển giới có biểu hiện bất thường về cấu trúc, chẳng hạn như chỉ có một tuyến sinh dục, không có ống dẫn tinh, hoặc tinh hoàn nghiêng về hướng khoang bụng (Bye & Lincoln 1986, Tsumura et al.1991, Piferrer et al. 1994). Trong những con không có ống dẫn tinh, thu nhận tinh trung hầu hết là ép lấy. Việc thu nhận tinh từ những con cá chuyển đổi giới tính có tỉ lệ thấp 20-30%, bởi vì dịch tinh được thu thập bằng cách chọn tinh hoàn và bóp ra tinh dịch. Các tinh trùng đã được sử dụng trong thử nghiệm này chưa được hoạt hóa trong nang tinh hoàn, và do đó nó chưa có khả năng di động. Được biết, pH và nồng độ HCO3 huyết tương là cao hơn trong các ống dẫn tinh (Morisawa & Morisawa 1986, Morisawa 1987, Boitano & Omoto 1991, Miura et al. 1992). Particularly, it is suggested that 17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17,20-DP) các hormon tăng trưởng của cá hồi làm tăng pH(Miura et al. 1992, Nagahama, 1994). 17,20-DP nâng cao pH của huyết tương, và số lượng CAMP tinh trùng tăng lên rõ rệt.CAMP hoạt động như một kích hoạt trực tiếp làm tăng tính di động của tinh trùng và số lượng của nó ảnh hưởng đến thời gian di động của tinh trùng. (Morisawa 1985,Morisawa & Ishida 1987, Cosson et al. 1995) Trong việc khôi phục tính di động của tinh trùng, khác nhau giữa các cơ quan phản ứng kích thích, như protein hay sự chuyển tiếp (FMP) và15-kDa, là rất phức tạp (Morisawa&Hayashi 1985, Hayashi et al. 1987). Theo đó, có thể với nồng độ cao ion K và cao độ pH ủa ASP có thể khôi phục khả năng di động và kéo dài thời gian di động.Tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng không được xử lý là 20-30%. Tuy nhiên tỉ lệ này đã được tăng lên 70-80% khi tinh trùng được xử lý.. Việc xử lý này không chỉ cho con đực chuyển đổi giới tính mà cho con cái sản xuất, nhưng cũng như giống cá hồi chấm hồng Nhật Bản, Salverinus pluvius, trong đó chỉ có một lượng nhỏ tinh dịch được thu thập bằng cách bóp bụng. Chúng tôi giới thiệu phương pháp này để sản xuất giống cá hồi chấm hồng trong những năm gần đây và thu được tỷ lệ rất cao 70%.ItwAs chứng minh rằng những điều chỉnh khả năng di động của tinh trùng ảnh hưởng đến cả các kết quả sản xuất, và trứng chất lượng trong sản xuất, ngay cả cho thế hệ con cháu. Các mẻ tỷ lệ trứng thụ tinh của tinh hoàn không xử lý tinh trùng là 29-30%.Tuy nhiên cũng phải cần điều tra yếu tố huyết tương và môi trường ngoài của tinh trùng một cách tinh tế. Morisawa (1987) chỉ ra rằng pH trong cá hồi cầu vòng phổ biến là 7,8-8,0. Miura et al.(1992) báo cáo rằng tính di động cao nhất thu được khi các ASP pH 8,5-9,0 đã được sử dụng, khi họ khôi phục tính di động cho cá hồi anh đào, Oncorhynchus masou.Ở từng vị trí và giai đoạn khác nhau thì độ pH khác nhau, các pH của ASP tối ưu để khôi phục khả năng di động phải được duy trì. Nó có thể giảm thiểu thiệt hại do pH đột ngột thay đổi bằng cách sử dụng giải pháp đệm như vậy. Gần đây môi trường nước sông đang dần chuyển sang acid do mưa acid chứa nhiều cacbon dioxide. Mật độ nitơ oxit trong không khí tăng, hoặc một số chất gây ô nhiễm môi trường(Rurangwa et al. 2002).Đây là báo cáo môi trường bên ngoài có ảnh hưởng đến pH của nội môi trường bên trong cá, và thay đổi về tổ chức và độ pH của các chất dịch thể bên trong của nó.(Wood et al 1998). Nếu pH của huyết tương có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng di động của tinh trùng thì vấn đề này càng khó khăn hơn rất nhiều vì môi trường càng lúc càng tồi tệ. Trong nghiên cứu này chúng tôi xác nhận việc sử dụng ASP ủ tinh trùng đạt kết quả cao, độ pH cải thiện tính di động tăng hay cải thiện khả năng di động của tinh trùng cá chuyển giới tính. Tuy nhiên, những ảnh hưởng của nhiều nhân tố như sự hiện diện của glucose, trigriceride, và FMP khôi phục lại môi trường xấu của tinh trùng, ngoài việc tăng pH , không thể xem thường (Lahnsteiner et al 1999).Nếu được phân tích các yếu tố này sẽ được thực hiện.