Đề tài Sử dụng bức xạ gamma và chỉ thị phân tử liên kết với tính chịu hạn để tạo giống lúa chịu hạn

ếu xạ là hạt khô). Bảng 2. Liều tới hạn và liều chiếu xạ ở một số cây trồng chính Cây trồng Liều tới hạn (krad) Liều chiếu xạ (krad) Lúa mỳ 10-15 5-10 Lúa nước 30-35 15-20 Ngô 10-15 10-15 Đậu tương 12-15 5-8 1.5. Một số chỉ thị phân tử sử dụng Trong chọn dòng chịu hạn ở lúa 1.5.1. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase), được Kary Mullis & Cs phát minh vào năm 1985. Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo ADN với sự tham gia của các thành phần chính bao gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR. Phản ứng được thực hiện trong máy chu trình nhiệt hay còn gọi là máy PCR. Đoạn khuôn có vai trò rất quan trọng trong kỹ thuật nhân gen qua PCR. Đoạn khuôn có thể là ADN mạch kép, mạch đơn hoặc ARN được tách chiết từ đối tượng cần nghiên cứu. PCR chỉ cần một lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20-100 ng, phản ứng lại rất nhạy nên đòi hỏi ADN khuôn có độ nguyên vẹn cao và không bị lẫn tạp. Mồi PCR là những đoạn oligonucleotid mạch đơn kích thước từ 6-70 bazơ, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự ở hai đầu mạch khuôn. Để đảm bảo hiệu quả PCR, cần thiết kế các mồi xuôi và ngược có trình tự không bổ sung cho nhau, với hàm lượng G, C từ 40-75%, và phải đảm bảo Tm (nhiệt độ nóng chảy) không chênh lệch nhau quá lớn. Hơn nữa khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược không nên quá 1kb. Enzym DNA polymerase thường sử dụng là Taq polymerase, một loại enzym chịu nhiệt được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao (70-750C). Taq polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt độ cao, làm cho phản ứng PCR xảy ra chính xác và đặc hiệu. Nồng độ Taq tối ưu cho phản ứng khoảng 0,5 UI/25μl. Nồng độ các loại nucleotid khoảng 20-200 μM mỗi loại. Sự mất cân bằng trong hỗn hợp dNTPs sẽ làm giảm độ chính xác của Taq polymerase. Nồng độ các ion trong dung dich đệm, đặc biệt là ion Mg++, có vai trò rất quan trọng trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hưởng đến hoạt độ của Taq polymerase, nồng độ thích hợp là khoảng 0,5-5 mM. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn chính: Giai đoạn biến tính, phân tử ADN được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của ADN khuôn một ít, thường là 94-950C trong 30 giây đến 1 phút, nếu ADN khuôn có tỉ lệ G C cao, chuỗi GC liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp. Giai đoạn gắn mồi, mồi bắt cặp với ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung, nhiệt độ gắn mồi khoảng 300C đến 650C tuỳ thuộc vào độ dài của mồi, thời gian từ 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn tổng hợp, được tiến hành ở 720C là nhiệt độ tối ưu cho Taq polymerase hoạt động, giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 5 phút. Kết thúc mỗi chu kỳ lượng ADN tăng lên gấp đôi và ADN được nhân lên sẽ trở thành ADN khuôn cho những chu kỳ sau. Thông thường đặt khoảng 30-60 chu kỳ. Tuy nhiên số chu kỳ quá lớn sẽ làm tăng sự sai lệch trong quá trình tổng hợp. Vì theo lý thuyết enzym Taq có thể tổng hợp nhầm nucleotid với tỷ lệ 1/106 và tỷ lệ này sẽ tăng dần theo số chu kỳ. Đồng thời số chu kỳ tăng nhưng sản phẩm lại không tăng, do sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, số các bản sao tạo ra quá nhiều nên các bản sao không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998). Nhờ tính đặc hiệu và nhanh chóng mà kỹ thuật PCR từ khi ra đời đã có những ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong sinh học phân tử và công nghệ gen. Nó đánh dấu sự ra đời của hàng loạt các chỉ thị phân tử khác dựa trên phản ứng PCR như: RAPD, AFLP, SSR, STS… 1.5.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụng Phương pháp RAPD (RADNom Amplified Polymorphic DNAs) được William & Cs đề xuất năm 1990, thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên. Các mồi này sẽ bắt cặp với ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào có trình tự bổ sung với nó. Mồi ngẫu nhiên là các đoạn nucleotid từ 9-12 bases. Phương pháp này tạo ra từ 1-10 đoạn từ một mồi đơn qua phản ứng PCR (Reiter et al, 1992) [38]. Cho sự đa hình cao và có thể được xác định dễ dàng bằng nhuộm EtBr các băng trên gel agarose. Các đoạn nhân lên bởi RAPD có kích thước từ nhỏ hơn 100 bp đến lớn hơn 2 kb. Và chỉ thị RAPD được xem như là yếu tố trội trong di truyền Mendel ở một cơ thể lưỡng bội vì nó không phân biệt được cây dị hợp tử với cây đồng hợp tử trội. ưu điểm của RAPD là chỉ cần một lượng ADN nhỏ từ 25-100 ng cho một phản ứng. Các mồi ngẫu nhiên không đòi hỏi trình tự ADN trong cơ thể nghiên cứu và bộ mồi có thể được sử dụng cho nhiều loài khác nhau. Mỗi mẫu cung cấp số liệu của nhiều locus trong hệ gen. Vì vậy những đa hình hiếm trong các cá thể có quan hệ gần gũi có thể được phát hiện nhanh chóng. RAPD thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) và phân tích dòng gần đồng gen (near isogenic line) là các dòng chỉ khác nhau ở một tính trạng. Trong phản ứng RAPD đoạn mồi gắn với ADN khuôn ở nhiệt độ không cao (30-400C) và các mồi ngẫu nhiên, ngắn nên khả năng tìm điểm gắn trên phân tử ADN là tương đối dễ dàng. Nhưng do mồi ngắn nên dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện gắn mồi, vì thế kết quả nhiều khi không đồng nhất. Và đôi khi hai đoạn ADN có kích thước như nhau từ hai cá thể cùng loài có thể không được tạo ra từ cùng một vị trí trên hệ gen (Brown, 1996) [23]. 1.5.3. Kỹ thuật SSR và ứng dụng SSR (Simple Sequence Repeats) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, còn gọi là phương pháp vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (Microsetllite). Bộ gen của Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài từng giống. Ví dụ ở lúa có khoảng gần 1000 lần lặp lại trình tự AC/TG, khoảng trên 300 lần lặp lại trình tự GATA/CTAT. Nhiều loài cây một lá mầm như ngô, lúa lặp lại đoạn CGG/GGC. Các đoạn ADN thường nằm gần tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể, có vai trò giữ tính ổn định của bộ nhiễm sắc thể qua quá trình phân bào [16]. Do sự sai khác về kích thước các đoạn lặp lại, nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. SSR là chỉ thị đồng trội nên đuợc sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử trong quần thể F2. Mồi SSR thường dài khoảng 18-20 bases. Mỗi mồi có từ 1-12 locus được tổ hợp trong một phản ứng PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều locus nên tiết kiệm được đáng kể thời gian và hoá chất. Hạn chế của SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR. Tuy nhiên nhiều thành công đạt được đã khiến giá thành của nó giảm đi (Brown, 1996). Sản phẩm PCR sau đó được xác định chính xác bằng điện di trên gel acrylamide và nhuộm bạc. ở lúa các chỉ thị SSR được xác định là liên kết chặt với một số tính trạng hình thái đã được sử dụng để đánh giá khả năng chịu hạn như: RM104 liên kết với tính trạng chiều cao cây; RM250, RM270 liên kết với độ dài rễ; RM156 liên kết với tính trạng số lượng rễ; RM263 liên kết với tỷ lệ khối lượng khô của rễ trên thân; RM221, RM242, RM228 liên kết với tỷ lệ khối lượng khô của rễ sâu trên thân (Nguyễn Đức Thành, 2001) [18]. Đặc biệt là các locus RM221 trên NST số 2, RM242, RM288 trên NST số 9 có ảnh hưởng lớn đến khả năng chịu hạn của các dòng lúa chọn lọc và có thể sử dụng như một chỉ tiêu trong chọn dòng chịu hạn (Nguyễn Thị Kim Liên, 2003) [9]. Các locus kiểm soát rễ dài, rễ dày như RM29 trên NST số 1;RM234, RM248 trên NST số 7 cũng được xem là những chỉ thị chuẩn trong chọn lọc các cá thể chịu hạn (Shen & Cs, 1999) [37]. 1.5.4. Kỹ thuật STS và ứng dụng Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) tức điểm trình tự được đánh dấu, do Olson & Cs đề xuất năm 1989. STS có thể xem như là một kỹ thuật thay thế RFLP và RAPD. Nguyên lý của STS là: Xác định trình tự các nucleotid ở hai đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong RFLP hay sản phẩm RAPD. Sau đó dựa vào trình tự đã biết thiết kế mồi PCR có chiều dài 18-20 nucleotid. Với những mồi như vậy có thể tổng hợp những đoạn ADN nằm trong vùng sản phẩm RFLP và RAPD. Cuối cùng điện di sản phẩm PCR và phân tích tính đa hình. Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật dựa vào so sánh kích thước các băng ADN. Mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN có thể không khác nhau về kích thước nhưng lại khác nhau về trình tự nucleotid. Từ đó các nhà khoa học đã sử dụng enzym giới hạn để cắt sản phẩm STS, SSR, RAPD… và kỹ thuật này được gọi là CAPs (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences). Một chỉ thị khác dựa trên STS là SCARP (Sequence Charracterised Amplified Regions) là chỉ thị bậc hai phát triển từ chỉ thị RAPD đã được xác định trên bản đồ di truyền và liên kết với một tính trạng nào đó. Chỉ thị này dựa trên sự tách dòng và đọc trình tự các đoạn RAPD được quan tâm. Từ đó thiết kế mồi dài khoảng 25 mer bổ sung với trình tự đầu và cuối của đoạn RAPD ban đầu. Do đó mỗi mồi SCARP sẽ xác định được một locus đơn tương ứng với đoạn ADN ban đầu. STS là chỉ thị đồng trội, được ứng dụng trong đánh giá và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS, ngoài ra còn được ứng dụng trong đánh dấu gen, nhận dạng giống… Hiện nay có một số chỉ thị STS được sử dụng trong chọn dòng lúa chịu hạn như: RZ19, RG690, RZ730 và RZ801 trên NST số 1; RG171, RG157, RZ318 trên NST số 2; RZ978, RZ288, RZ12 trên NST số 9 được xác định là liên kết chặt với các locus kiểm soát hình thái rễ dài, rễ dày (Shen & Cs, 1999). Các locus RG140 liên quan đến điều hoà áp suất thẩm thấu trên NST số 1; RG404, RG650 liên quan đến độ sâu của rễ trên NST số 7… (Zhang & Cs, 1999) [40]. Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu - 4 giống lúa: Chí chùa 1, Chí chùa 2 là hai giống lúa nương địa phương xin từ Lào Cai, Yên Bái; R2021, RDB09 là hai giống lúa cạn do Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam cung cấp. - Các hoá chất đặt mua từ các hãng USB, Sigma, Amersham; các mồi RAPD, đặt mua tại hãng Operon (Mỹ); Các mồi SSR mua từ hãng New England Biolabs. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp xử lý phóng xạ Chiếu xạ các giống lúa Chí chùa 1, Chí chùa 2, với 6 liều 10, 15, 20, 25, 30, và 40 Krad, tại Trung tâm chiếu xạ - Viện Khoa học và Kỹ thuật hạt nhân, nguồn Co60, máy TTR-150 của Liên Xô, mỗi liều 200 hạt. Các dòng chiếu xạ và đối chứng của 3 giống được ngâm trong nước ấm (3 sôi, 2 lạnh) trong hai ngày để hạt hút nước đạt độ ẩm 25-30%, sau đó chắt hết nước đi để vào tủ ấm 370C cho hạt nảy mầm được thuận lợi. Khi cây mạ được 10 ngày tuổi, loại bỏ những cây có đột biến có hại quan sát được như bạch tạng, lùn cây, xoăn lá, cuốn lá, không thoát ngọn… Những cây còn lại cho xử lý PEG, đồng thời chọn ngẫu nhiễn 50 cây từ mỗi dòng chiếu xạ và đối chứng của từng giống, đo chiều cao cây và độ dài rễ để xác định ảnh hưởng của phóng xạ lên khả năng sinh trưởng và phát triển của cây mạ. 2.2.2. Phương pháp xử lý hạn PEG với các cây M0 Polyethyleneglycol (PEG) là một chất có ái lực lớn với nước. Cùng với PEG các chất khác như manitol, sorbitol, sachcharose… được dùng như tác nhân gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy. Adkin và Cs (1995) đã sử dụng PEG 8000 làm tác nhân gây mất nước trong môi trường nuôi cấy mô sẹo, kết quả là chọn được dòng lúa chịu hạn từ mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105. Trong đề tài này chúng tôi đã sử dụng PEG 8000 để gây hạn nhân tạo ở giai đoạn mạ [31]. Chúng tôi sử dụng môi trường Hoangland 1/2 có bổ sung 1% đường, 30% PEG 8000, PH 5,6-5,8 để làm môi trường xử lý hạn các cây M0. Thành phần môi trường Hoangland được trình bày trong bảng 2.1. Bảng 2.1. Môi trường Hoangland STT Thành phần Dung dịch mẹ (g/100 ml) Hàm lượng (ml/l) 1 MgS04.7H20 24,4 1,0 2 Ca(N03)2.4H20 23,6 2,3 3 KH2P04 13,6 0,5 4 KN03 10,1 2,5 5 Micronutrients 10,1 0,5 6 Fe.EDTA 10,1 20 Tiến hành xử lý hạn trong 10 ngày sau đó ngâm nước 1ngày rồi rửa sạch rễ và cho môi trường phục hồi là môi trường Hoangland 1/2 không chứa PEG. Một tuần sau khi cho môi trường phục hồi, tính tỷ lệ cây hồi (cây xanh trở lại) để xác định khả năng phục hồi sau hạn của các dòng chiếu xạ so với dòng đối chứng. 2.2.3. Phương pháp tách chiết ADN hệ gen Các cây phục hồi được trồng ở nhà lưới, sau 3-4 tuần có thể thu lá để tách chiết ADN. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết ADN hệ gen của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm. Các hoá chất để tách chiết ADN hệ gen như sau: - Đệm CTAB 100 ml gồm: 55 ml H20; 15 ml Tris HCl 8,0; 30 ml NaCl 5 M; 4,5 ml EDTA; 250 μl β- Mercapto ethanol; 2,25 g CTAB. - Đệm TE pH 8,0 gồm: 10 mM Tris HCl 8,0; 1 mM EDTA 8,0. - RNase 10 μg/ml - Cồn tuyệt đối, lạnh - Hỗn hợp: Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) - Hỗn hợp: Chloroform/Isoamylalcohol (24:1) - Dung dịch rửa: Cồn 70% Sau đây là các bước tách chiết ADN từ lá lúa bằng phương pháp CTAB Bước 1: Nghiền 1 gam lá lúa trong nitơ lỏng bằng chày cố sứ. Bột đã nghiền cho vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650C trong 10 phút. Bước 2: ủ các ống ở 650C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả. Bước 3: Chuyển các ống từ tủ ấm ra, để nguội ở nhiệt độ phòng 5 phút, thêm 0,7 ml dung dịch Chloroform/Isoamylacohol (24:1), lắc nhẹ nhàng 15-20 phút. Bước 4: Ly tâm 15 phút tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bước 5: Dùng pipetman hút lớp trên cùng sang ống mới, thêm 0,75 ml Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1), xoay ống nhẹ nhàng trong 10 phút. Bước 6: Ly tâm 12 phút tốc độ 10.000 vòng/phút. Bước 7: Hút lớp trên sang ống mới thêm 0.75 ml dung dich Chloroform / Isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ nhàng 10 phút. Bước 8: Ly tâm 12 phút tốc độ 10.000 vòng/phút. Bước 9: Hút lớp trên sang ống mới, tủa bằng cồn tuyệt đối lạnh (1-1,2 ml) cộng thêm 15 μl NaCl 5 M, xoay ống nhẹ nhàng trong vài phút. Nếu ADN tủa nhiều thì có thể câu ra ống mới. Nếu tủa ít thì để tủ -200C trong 30 phút. Bước 10: Ly tâm 7 phút tốc độ 10.000 vòng/phút để thu tủa. Bước 11: Rửa tủa (2 lần) bằng cồn 70%, ly tâm, thu tủa. Bước 12: Hoà tan ADN bằng TE 8,0 lượng TE tuỳ vào lượng tủa. Sau đó thêm 10 μl Rnase đã đun sôi 15 phút rồi ủ ở 370C qua đêm. ADN sau khi tinh sạch theo phương pháp trên được đo nồng độ trên máy quang phổ 8452 Hewllet và dựa vào đó để pha loãng ra nồng độ 25 ng/μl bằng nước cất 3 lần để chuẩn bị cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.4. Phương pháp phân tích RAPD 2.2.4.1. Phản ứng PCR với các mồi RAPD Kỹ thuật chạy PCR của hệ gen với các mồi RAPD được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc, Mỹ). Bảng 2.2. Các mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu STT Mồi Trình tự mồi 1 OPB 16 5’-TTTGCCCGGA-3’ 2 OPB 17 5’-AGGGAACGAG-3’ 3 OPC 18 5’-TGAGTGGGTG-3’ 4 OPC 19 5’-GTTGCCAGCC-3’ 5 OPC 20 5’-ACTTCGCCAC-3’ Thành phần của mỗi phản ứng như sau: ADN mẫu : 3 μl Nước cất : 13,5 μl Đệm PCRx10 : 2,5 μl MgCl2 (50 mM) : 1,0 μl dNTP (2,5 mM) : 2,0 μl Mồi (primer) : 2,0 μl Taq-polymerase : 1,0 μl Tổng thể tích : 25 μl Trộn đều hỗn hợp trên rồi chuyển vào máy PCR, chạy theo chương trình RAPD-CT đã cài đặt sẵn với 45 chu kỳ gồm các bước: 1. 940C trong 4 phút 4. 720C trong 2 phút 2. 940C trong 1 phút 5. 45 chu kỳ (2+3+4) 3. 340C trong 1 phút 6. 720C trong 7 phút Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose nồng độ 1%. Phương pháp điện di như sau: Hoá chất: Agarose Đệm 10xTBE: 54g Tris base; 7,5 g Boric acid; 20 ml EDTA 0,5 M; pH 8,0 Thêm nước cất tới 500 ml. Đệm tra mẫu (loading buffer): 2,5 mg Bromophenol blue; 2,5 mg Xylene cyanol FF; 0,4 g Sucrose; thêm nước cất đến 1ml. Ethidium bromide: 10 mg/ml. Cách tiến hành: Chuẩn bị gel agarose 1%: Cân 0,4 g thạch cho vào 40 ml dung dịch đệm 1xTBE. Đun trong lò vi sóng khoảng 2 phút cho agarose tan hoàn toàn trong dung dịch (lượng agarose và dung dịch TBE tuỳ thuộc vào thể tích của khay điện di). Để nguội còn 50-600C, đổ vào khay điện di đã cài sẵn lược. Đợi khoảng 45-60 phút cho gel đông lại. Đặt khay vào bể điện di sau đó đổ dung dịch 1xTBE ngập gel khoảng 0,5 cm, rút lược khỏi gel. Tra mẫu ADN: Lấy 7 μl ADN trộn với 4 μl loading tra vào các giếng và tra thêm ADN marker 1kb để xác định độ dài của các băng ADN. Điện di ở 76 V trong vòng 1 tiếng (thời gian và hiệu điện thế điện di tuỳ thuộc vào khoảng cách giữa hai điện cực và mục đích của người nghiên cứu). ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cựcdương của điện trường. Dựa vào vị trí của vạch màu để dừng quá trình điện di. Nhuộm gel: Điện di xong ADN được ngâm trong dung dịch Ethidium bromide nồng độ 30 μl/l. Để trên máy lắc trong 25-30 phút, sau đó rửa bản gel và ngâm nước cất 15 phút. Soi gel và chụp ảnh: Gel được soi dưới ánh sang tia tử ngoại ở bước sóng 254-260 nm của máy soi ADN. Sau đó được chụp ảnh bằng máy chuyên dụng Polaroid. 2.2.4.2. Phương pháp phân tích số liệu RAPD Dựa vào vị trí của các băng ADN so với ADN chuẩn ta xác định được sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các dòng nghiên cứu. Nếu có ký hiệu là 1, không có ký hiệu là 0. Các số liệu này sau đó được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu. Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: Jij = a/(n-d) Trong đó: a: số băng ADN có ở hai dòng i và j d: số băng ADN không có ở cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được Jij: Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j Sau đó xử lý tiếp trong NTSYT-SIMQUAL để biểu hiện trên biểu đồ. 2.2.5. Phương pháp phân tích SSR 2.2.5.1. Phản ứng PCR với các mồi SSR Ngoài các mồi RAPD, chúng tôi còn sử dụng các mồi SSR được xác định là có liên kết với một số tính trạng hình thái rễ để xác định khả năng chịu hạn của các dòng nghiên cứu. Các mồi SSR được sử dụng như sau: Bảng 2.3. Các mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu STT Mồi Trình tự mồi xuôi Trình tự mồi ngược 1 RM 250 ggttcaaaccaagctgatca gatgaaggccttccacgcag 2 RM 263 cccaggctagctcatgaacc gctacgtttgagctaccacg 3 RM 221 acatgtcagcatgccacatc tgcaagaatctgacccgg Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 13,5 μl H2O 2,0 μl đệm 10xPCR 1,0 μl MgCl2 (50 mM) 1,0 μl dNTP (2,5 mM) 0,5 μl mồi xuôi (50 ng/μl) 0,5 μl mồi ngược (50 ng/μl) 0.5 μl Taq-polymerase (5 UI/ μl) 1 μl ADN (25 ng/ μl) Chương trình chạy như sau: 1. 940C trong 5 phút 4. 720C trong 2 phút 2. 940C trong 1 phút 5. 35 chu kỳ (2+3+4) 3. 550C trong 1 phút 6. 720C trong 5 phút Sản phẩm PCR với cá mồi SSR được chạy điện di trên gel polyacrylamide có độ phân giải cao và sử dụng phương pháp nhuộm bạc để phát hiện băng. Chuẩn bị các bản kính: Kính chạy gel có hai tấm, tấm kính dẫn điện không bám gel và tấm kính dài để gắn gel. Hai tấm kính được rửa sạch bằng nước cất 2-3 lần sau đó được lau khô bằng giấy lụa mềm, lau lại bằng giấy Kimwipe cho sạch. - Tấm ngắn: Bôi trơn bằng dung dịch Rain X thấm trên giấy Kimwipe, chờ 15-20 phút cho khô. - Tấm dài: Được bôi một lớp dính gồm 1 ml hỗn hợp 95% cồn tuyệt đối; 0,5 % acetic acid và 3 μl Bind silance. Chờ 15-20 phút cho khô rồi dùng giấy Kimwipe lau lại để loại bỏ dịch thừa. Ghép hai tấm kính lại với nhau để tạo khuôn đúc gel có độ dày bằng độ dày của hai thanh spacer nằm giữa hai tấm kính. Chuẩn bị gel chạy điện di: Lấy 55 ml polyacrylamide, bổ sung thêm 55 μl TEMED, và 165 μl APS 10%, trộn đều. Dùng xi-lanh 140 cc hút và bơm từ từ vào khoảng trống giữa hai tấm kính qua một lỗ ở đáy hệ thống của bản gel 19x50 cm, bản gel của máy đọc trình tự Sequen Gen (Biorad Laboratories Inc; Hercules, Calif, USA). Lắp lược vào gel, chờ 2-3 giờ cho gel đông lại. Trong trường hợp giữ gel qua đêm ở nhiệt độ phòng cần bịt đầu có lược bằng màng plastic. Tra mẫu: Sản phẩm SSR được thêm 8 μl dung dịch tra mẫu 3xSSR (0,2 ml 5 M Na0H; 95 ml Formamide 95%; 50 μg Bromophenol blue; 50 μg Xylene cyanol FF; nước cất vô trùng đến 100 ml). Biến tính ở 940C trong 10 phút rồi cho ngay các ống vào nước đá. Lấy 4 μl hỗn hợp đã biến tính tra vào các giếng, để lại giếng đầu để tra marker 100 bp. Để tăng hiệu quả sử dụng của gel, có thể tra mẫu nhiều lần, mỗi gel có thể tra từ 2-4 lần. Quá trình chạy điện di được tiến hành với đệm 0,5xTBE và dòng điện cố định 75 W trong 1-2 giờ. Trước khi chạy gel đã tra mẫu phải chạy gel không có mẫu 30-40 phút (45-500C) ở công suất 100 W. Nhuộm gel bằng bạc: Sau khi điện di, tách các bản kính ra, gel phải được gắn vào tấm dài, quá trình nhuộm theo các bước sau. Cố định gel bằng dung dịch Fix/Stop (acid acetic 10%) trong 30 phút đến khi không còn nhìn thấy vạch màu. Rửa gel 2 lần, mỗi lần 3 phút bằng nước cất. Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm (1 g AgN03; 1,5 ml Formaldehyt 37%; trong 1 l nước) thời gian nhuộm từ 30-60 phút. Tráng gel đã nhuộm bằng nước cất, không quá 10 giây. Cho gel vào dung dịch hiện gồm 30 g Sodium cacbonate; 1,5 ml Formaldehyt; 0,4 ml Sodium thiosunfate 10 mg/μl đã được làm lạnh ở 100C. Lắc nhẹ nhàng cho đến khi nổi rõ băng. Cố định gel bằng dung dịch Fix/Stop trong 3-5 phút. Tráng gel bằng nước cất và để khô ở nhiệt độ phòng. 2.2.5.2. Phương pháp phân tích số liệu SSR Sử dụng các băng được nhân lên bởi mồi SSR của hai giống R2021 và RDP09 làm băng chuẩn để chọn lọc các dòng có khả năng chịu hạn. Nếu các dòng chiếu xạ có băng trùng với RDB09 hoặc R2021 thì dòng đó có thể mang tính chịu hạn. Còn các dòng mang băng khác với dòng ban đầu ( không chiếu xạ) thì dòng đó mang băng đa hình. Chương 3. kết quả và thảo luận 3.1. ảnh hưởng của phóng xạ lên khả năng nảy mầm của hạt Sau bốn ngày nảy mần, quan sát thấy lô ĐC và lô chiếu xạ 10; 15; 20; 25 krad nảy tốt, liều 30 krad nảy kém, liều 40 krad nảy mầm nhưng không phát triển thành cây được có thể là do liều chiếu xạ quá cao. Khi cây mạ được 10 ngày tuổi, đếm và xác định tỷ lệ nảy mầm thành cây bình thường của dòng ĐC và các dòng chiếu xạ ở liều lượng khác nhau. Tỷ lệ này được thể hiện trong bảng 3.1 Bảng 3.1. Khả năng hình thành cây của các dòng lúa thí nghiệm Giống Tỷ lệ nảy mầm (%)/ liều chiếu xạ (krad) ĐC 10 krad 15 krad 20 krad 25 krad 30 krad 40 krad CC1 89,01 82,35 75,91 80,21 96,12 78,14 0 CC2 85,35 75,91 59,75 88.19 83.74 78,63 0 Qua bảng 3.1 ta thấy ngoài liều 40 krad không có khả năng hình thành cây, thì các liều còn lại đều cho tỷ lệ nảy mầm thành cây khá cao. Nhưng lại không có sự chênh lệch rõ ràng khi liều chiếu xạ tăng dần. Nhìn chung ở cả hai giống, tỷ lệ nảy mầm thành cây là giảm so với ĐC nhưng không nhiều. Một số liều chiếu xạ còn cho tỷ lệ cao hơn cả ĐC như liều 25 krad của giống CC1 (96,12%) và liều 20 krad của giống CC2 (88,19%). Và hầu như tỷ lệ này đều lớn hơn 75% trừ liều 15 krad của giống CC2 là cho tỷ lệ thấp nhất (59,75%). Qua bảng trên cũng cho thấy liều tới hạn của hai giống là 40 krad . Để thu nhận được nhiều đột biến ta cần phải chiếu xạ ở liều lượng đủ lớn để gây ra những biến dị di truyền có lợi mà không gây chết nhiều cũng như tăng độ bất thụ của chúng. Thông thường liều chiếu xạ sẽ thấp hơn liều tới hạn 1,5 đến 2 lần và tốt nhất nên sử dụng liều chiếu xạ chỉ làm giảm tỷ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trưởng. Như vậy đối với hai giống CC1 và CC2 khi chiếu xạ ở hạt khô thì liều từ 10 đến 25 krad là thích hợp để tạo vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống. 3.2. ảnh hưởng của phóng xạ lên sinh trưởng và phát triển của cây mạ Để nghiên cứu ảnh hưởng của phóng xạ lên sinh trưởng và phát triển của cây mạ, chúng tôi xác định sự biến động của chiều cao cây mạ ở những liều chiếu xạ khác nhau. Kết qủa được thể hiện trong biểu đồ hình 3.1 Hình 3.1. ảnh hưởng của phóng xạ lên chiều cao cây mạ Thông thường khi liều chiếu xạ tăng dần thì chiều cao cây sẽ giảm dần. Do liều chiếu xạ tăng dần thì tần số đột biến cũng tăng dần (ở một giới hạn nào đó). Mà những biến dị lại tuân theo qui luật về dãy biến dị tương đồng. ở họ Graminae như lúa nước, lúa mỳ, kê… thường xuất hiện đột biến gen lùn. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho thấy chiếu phóng xạ ở liều lượng thích hợp cũng sẽ kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi liều chiếu xạ tăng dần thì chiều cao cây đa số là giảm dần nhưng mức độ giảm lại không rõ rệt. Thấp nhất là liều 30 krad của giống CC1 là 5,88 cm và 7,79 cm của giống CC2 . Đặc biệt ở liều 10 và 25 krad của giống CC1, liều 20 và 25 krad của giống CC2 chiều cao cây còn vượt so với đối chứng. Liều 10 krad của giống CC1 chiều cao vượt so với ĐC 1,23 cm. Liều 20 krad của giống CC2 cao hơn ĐC 0,69 cm. Qua đây chúng tôi rút ra kết luận với ngưỡng liều lượng như trên thì ảnh hưởng lên chiều cao cây mạ là không nhiều. Có nghĩa là ở liều chiếu xạ từ 10 đến 30 krad ít ảnh đến sinh trưởng, phát triển của cây mạ. Hình 3.2. ảnh hưởng của phóng xạ lên khả năng hình thành và chiều cao cây mạ 3.3. Kết quả xử lý PEG Chúng tôi sử dụng 30% PEG 8000 đễ gây hạn nhân tạo ở giai đoạn mạ. Sau thời gian xử lý (10 ngày) chúng tôi cho môi trường phục hồi. Một tuần sau khi cho môi trường phục hồi thì xác định khả năng phục hồi của các dòng lúa thông qua tỉ lệ cây hồi (cây hồi là cây xanh trở lại sau khi được tưới nước). Và khả năng phục hồi sau hạn là một trong những chỉ tiêu để đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng nghi