Đề tài Sự nhiễm nấm mốc và aflatoxin tự nhiên trên một số giống ngô, lạc trồng ở một số tỉnh và khả năng phòng trừ bằng các chủng Aspergillus aflavus không sinh độc tố

ạc đã tiến hành ở Tây Phi chứng minh ảnh hưởng của thực tiễn nông nghiệp về sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin. Thậm chí những phương pháp nông nghiệp tiến bộ đã cho thấy một thực tiễn là sự nhiễm Aspergillus sản sinh aflatoxin trong lạc ở mức độ thấp là không thể tránh được. 2.4.2. Giảm hàm lượng aflatoxin bằng phương pháp sinh học: Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong các nguyên liệu tự nhiễm tự nhiên như: chlorin, ozon, axit hydrochloric … Đáng tiếc, các hoá chất này mặc dầu chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có tác dụng phụ không mong muốn. Do vậy, việc sử dụng các chủng không có hại cho con người và thực phẩm mà lại có khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Những nghiên cứu để xác định các chủng đối kháng với các chi nấm mốc Aspergillus, Fusarium, Rhizoctonia, Alternaria, Claviceps…đã và đang tiếp tục trong nhiều năm. Biện pháp phòng trừ nấm mốc độc bằng các chủng đối kháng căn cứ vào những đặc điểm di truyền học (trao đổi chất, tự phân đôi nhân, đột biến, tiết enzym có tác dụng thuỷ phân …) tính cạnh tranh sinh thái (nguồn dinh dưỡng, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm …) Một số chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng giảm sự tạo độc tố thì ngoài việc đảm bảo tính an toàn không độc hại đối với con người và thực phẩm được xử lý, đôi khi cần phải thoả mãn một số yêu cầu khác, chẳng hạn với Stretoroccus lactis đòi hỏi nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt, nên không thích hợp đối với việc xử lý trên ngũ cốc và thực phẩm. Gần đây các nhà khoa học đã tìm thấy một số chủng B.subtilis sản sinh iturin A. Iturin A có khả năng ức chế rất mạnh mẽ sự phát triển của các nấm sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin của chúng. Do vậy, người ta sử dụng iturin A trong việc ngăn chặn aflatoxin trên ngũ cốc và các loại hạt. Các nhà khoa học ở Nhật Bản đã tìm ra một số chủng B.subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin của chúng. Các nhà khoa học ở Thái Lan cũng tìm ra 32 chủng vi khuẩn và 7 chủng nấm men được phân lập từ ngô và đất trồng ngô có hoạt tính ức chế sự phát triển của nấm Aspergillus flavus sản sinh aflatoxin và quá trình tổng hợp aflatoxin. Sự cộng sinh của các loài nấm khác (Aspegillus flavus, Aspergillus niger, Tricoderma, Rhizotonia … không sinh độc tố) cũng kìm hãm sự phát triển và khả năng tạo độc tố của nấm mốc Aspergillus flavus [38]. Các giải pháp về di truyền học đã nghiên cứu các chủng đề kháng thí nghiệm và ngoài đồng cho thấy sự khác nhau lớn ở các chủng loại ngô có khả năng đề kháng với Aspergillus flavus và tạo aflatoxin của nó. Mọi lớp vỏ không thấm được của hạt bông gọi là hạt cứng đã được Lillehoj [41] thông báo là có xu hướng ít cho phép Aspergillus flavus phát triển trên nó và tạo aflatoxin ít hơn các hạt giống không có lớp vỏ cứng này. 2.4.3. Biện pháp phân tách vật lý: Vì biện pháp phòng ngừa khó thực hiện trong thực tế, cho nên cần tìm những biện pháp kiềm chế khác có được các thực phẩm và thức ăn gia súc không có aflatoxin có thể ăn được. Các phương pháp sử dụng rộng rãi nhất bao gồm loại trừ chọn lọc các phần bị nhiễm của sản phẩm. Nói rộng ra vấn đề này là khả năng áp dụng phụ thuộc chủ yếu vào tính chất vật lý của sản phẩm. Các quy trình phân loại dựa trên các đặc tính như mầu và kích thước của hạt…đã được sử dụng thành công đối với lạc ăn. những phương pháp này dựa trên sự định vị aflatoxin ở phần tương đối nhỏ của các hạt, với sự thiếu hụt rất dễ nhận ra ở kích thước và hình dạng của hạt. Tuy nhiên do cái gọi là tổn thất “lột vỏ” thì những biện pháp này không thể nói là có hiệu quả 100%. Những biện pháp tương tự dựa trên sự phát quang đã được đề xuất đối với hạt dẻ và hạt bông [24]. 2.4.4. Các quy trình chiết xuất bằng dung môi: Việc chiết xuất aflatoxin bằng dung môi có một số thuận tiện: - Aflatoxin có thể được loại trừ hoàn toàn một cách cơ bản trong điều kiện thuận lợi. - Ít có khả năng tạo từ aflatoxin những sản phẩm khác có hoạt tính sinh lý đa dạng. - Việc chiết xuất có thể tiến hành với việc thu hồi dung môi mà không bị mất mát dinh dưỡng trong nhiều trường hợp. Những điều bất lợi: Cần phải có thiết bị chiết xuất dung môi đặc biệt. Sẽ chiết xuất luôn một số thành phần hoà tan cùng aflatoxin. Giá thành của việc chiết xuất cao. Có thể bị mất mùi của sản phẩm xử lý. Để tìm được dung môi có thể thích hợp cho tất cả các sản phẩm là một nhiệm vụ khó. Các yếu tố khác như giá của dung môi và hiệu xuất thu hồi chúng cũng là vấn đề. Thêm nữa là độc tính của dung môi và dư lượng của chúng và cuối cùng là tính an toàn của quá trình xử lý vì tính dễ cháy, dễ nổ điểm sôi của dung môi. Các aflatoxin có thể được chiết xuất bằng các dung môi như cloroform/nước, axeton/nước. Những hệ dung môi này chỉ loại trừ aflatoxin đơn độc mà không loại trừ dầu. Còn các nhóm dung môi như hydrocacbon dầu hoả/nước loại trừ chủ yếu dầu nhưng cũng có khả năng loại trừ aflatoxin. Những kết quả có nhiều hứa hẹn nhất đã thu được bằng việc dùng hệ thống chiết xuất bao gồm hỗn hợp hexan- metanol, hexan- etanol, hexan-etanol-nước, hexan – axeton – nước. Hệ thống bao gồm 54% axeton, 44% hexan và 2% nước (tính theo khối lượng) đã tìm thấy một trong những hệ thống thành công nhất có thể đồng thời loại trừ dầu từ các bánh ép khô của lạc gồm 12 -15% dầu, dư lượng lipit gần bằng 1% và mức aflatoxin thấp hơn 40 ỡg/kg. 2.4.5. Các phương pháp khử độc tố bằng hoá chất: Nhiều hoá chất có thể phá huỷ aflatoxin tinh khiết hay aflatoxin trong các nguyên liệu nhiễm tự nhiên. những hoá chất này bao gồm: chlorin, ozon, axit hydrrochloric, peroxit benzoic, amoniac, natri hydrrochlorit và etanolamin. Các hoá chất dùng cho việc khử độc tố aflatoxin phải thoả mãn các tiêu chuẩn sau: Phải phá huỷ hay khử aflatoxin. - Nó phải không được tạo hay giải phóng ra bất kỳ các dư lượng độc hay gây ung thư ở sản phẩm cuối cùng. Phải phá huỷ các bào tử và sợi nấm mà dưới điều kiện thuận lợi, chúng có thể tái nhiễm lại ở sản phẩm. Phải giữ được giá trị dinh dưỡng và tính ăn được của nguyên liệu ban đầu. Đáng tiếc, nhiều hoá chất khảo sát đã không thoả mãn tất cả những tiêu chuẩn trên. Mặc dù chúng phá huỷ các aflatoxin nhưng lại làm giảm đáng kể giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu xử lý và tạo nên các sản phẩm độc hay các sản phẩm có các tác dụng phụ không mong muốn. Một số quá trình xử lý bằng hoá chất có hiệu quả trong việc phá huỷ aflatoxin thoả mãn những tiêu chuẩn trên. Những hoá chất này bao gồm hydrogen peroxit hay những chất oxy hoá tương tự, canxihydroxit, canxihydroxit/formaldehyt, natrihydroxit, natrihypochlorit, dimetylamin hay metylamin và amoniac. Trong số này, hydrogen peroxit, natri hydroxit và natri hydroclorit dường như có khả năng trong việc khử aflatoxin từ các sản phẩm giàu protein hay các sản phẩm dùng cho người ăn, trong khi đó dimetylamin, metylamin hay amoniac có thể áp dụng cho việc khử độc tố các hạt có dầu hay ngô. Việc xử lý aflatoxin trên ngô và khô lạc bằng amoniac đã được áp dụng rộng rãi trong việc xử lý thức ăn nhiễm aflatoxin ở nhiều nước. Về cơ chế ở nhiệt độ cao, có thể trong điều kiện áp suất xảy ra sự thoái biến aflatoxin B1 bởi amoniac. 2.5. Vấn đề phòng chống nấm mốc cho lương thực trong quá trình bảo quản: Để phòng chống nấm mốc và độc tố người ta đã áp dụng những biện pháp khác nhau. Để phòng chống nấm mốc người ta áp dụng: Làm khô bằng nhiệt: làm khô tự nhiên (phơi dưới ánh nắng mặt trời). Sấy khô (than, điện) làm cho cơ chất đạt lượng nước cho phép. Ví dụ: ngô cần làm khô tới ≤13% trước khi bảo quản. Phần lớn các loại nấm mốc phát triển tốt ở hàm lượng nước trong cơ chất 18-25%. Chiếu xạ: chiếu xạ tia cực tím, tia ở với mục đích tiêu diệt các loại vi khuẩn, nấm mốc để làm giảm sự thiệt hại do chúng gây ra, các tia này làm biến đổi các cấu trúc chủ yếu của các axit amin, axit nucleotit, protein, làm tác động chuyển hoá tế bào, tác dụng diệt nấm, vi khuẩn. Phần lớn các loài nấm mốc đều bị diệt ở liều 4,5 kGy (1kGy =100 krad = 1kj/kg). Sử dụng các loại khí: Methylbromid ở liều 129 mg/l/h hoặc 40mg/l/h có thể diệt được nhiều loài nấm mốc. Khí ozon ở liều 10mg/m3 không khí được tiếp xúc liên tục trong nhiều ngày có thể ngăn cản sự phát triển của nấm mốc. Khí CO2 được ứng dụng trong bảo quản lương thực trong túi PE kín có thể chống được nấm mốc. Hoá học: được ứng dụng và nghiên cứu do tính chất an toàn của một số hoá chất, đặc biệt là axit hữu cơ: axit sorbic, axit propionic, axit acetic, axit benzoic, các muối Na và Ca của chúng như canxi propionat hay natriropi, ở liều 1 - 3% các axit hoặc muối của axit trên có thể ức chế sự phát triển của nấm mốc trong thời gian dài. Một số hợp chất hữu cơ khác thiosulfit, Na2SO3, KHSO2, NaHSO3, Na2S2O5, thiabendazon diphing, tinh dầu thực vật (tinh dầu cam ở liều 0,2%) có thể ức chế đựoc nhiều loài nấm mốc, mentho liều 1,1%, một số tinh dầu khác: tinh dầu hôi, tinh dầu được chiết từ cây tỏi có tác dụng ức chế nấm mốc. Sinh học: dùng các loại lá cây có sẵn trong thiên nhiên để chống nấm mốc trong thực phẩm. VD: dùng lá cây xoan hoặc lá hoa cúc vàng để xông vì cả hai loại lá cây này đều có tinh dầu, axit formic. Đó là những chất sát khuẩn, kháng khuẩn. Khi xông bằng hai loại lá này thì ngô có độ ẩm 10-13%, có thể kéo dài thời gian bảo quản 30 ngày. Vô hoạt hay mất hoạt tính bằng phương pháp vật lý: ít có hiệu quả vì aflatoxin có thể chịu được nhiệt độ >100-105 0C. Nếu chiếu xạ 10KGy thì sẽ gây ảnh hưởng tới nguyên liệu. Dùng hấp ướt (autoclave) 1,5at trong 60 phút nhưng lại có ít giá trị ứng dụng trong thực tế. Phương pháp hấp thụ: các chất hấp thụ như silicagel, axit nhân silic, than hoạt tính … có tác dụng rất tốt để hấp thụ aflatoxin trong quá trình tiêu hoá, các aflatoxin được hấp thụ sẽ được thải ra ngoài qua phân. Làm mất hoạt tính bằng các hợp chất oxy hoá khử Na2SO4, NaHSO3 1% hoặc 2% có tác dụng vô hoạt aflatoxin. Hiện nay người ta sử dụng NH3 ở dạng khí nén được bơm tuần hoàn vào các thùng chứa ngô bằng thép (Metal silo) hoặc trong các túi P.E có thể chứa tới 20-30 tấn ngô. Ngô có hàm lượng aflatoxin 750ppb sau 13 ngày xử lý, với 1,5 % NH3 ở nhiệt độ 320C dã làm giảm xuống còn 7ppb. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu: 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Trong quá trình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc và độc tố aflatoxin, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trên 30 mẫu ngô, bao gồm: 21 mẫu ngô được lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An. 7 mẫu ngô được lấy tại một số cửa hàng ở thị trường Nghệ An và Hà Nội, 4 mẫu được lấy tại thị trường Đồng Nai 4 mẫu lạc lấy tại các hộ nông dân ở các huyện khác nhau tỉnh Nghệ An và 15 mẫu lấy tại thị trường Đồng Nai 3.1.2. Các môi trường PDA: * Môi trường thạch khoai tây (PDA): 200 g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu và đun sôi 10 phút với 4.500 ml nước. Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu được dịch chiết khoai tây. 1000 ml dịch chiết khoai tây 20 g glucoza 20 g thạch Đun cho tan chạy thạch và glucoza, thử pH, rồi chia vào các bình tam giác, khử trùng 1 at trong 30 phút, pH = 6. 3.1.3. Môi trường Czapex – Dox (g/l): Sacaroza 30 NaNO3 3 K2HPO4 1 MgSO4.7H2O 0,5 KCL 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 Thạch 20 Nước 1lít pH = 5 – 6. Khử trùng 0,8 at/30 phút 3.1.4. Các hóa chất dùng cho phân tích độc tố aflatoxin B1 NaCL tinh khiết (Trung Quốc) Silicagel 60 F245, Merck, Cộng hòa liên bang Đức, cho sắc kí lớp mỏng. NaSO3 khan (Trung Quốc). NaHCLO, Nhà máy hóa chất Việt Trì. H2O2 Công ty dược phẩm Hà Nội. Các dung môi cloroform, hexan, aceton, axetat chì (Trung Quốc). Nước cất (Viện công nghệ sau thu hoạch). Các chuẩn độc tố aflatoxin B1 (Sigma). 3.1.5. Dụng cụ thí nghiệm: Buồng sắc kí lớp mỏng (chromatography tank), Thụy Sĩ. Đèn cực tím sóng dài 254 nm, 366 nm, Camag, Thụy Sĩ. Bản mỏng cho sắc ký 20x20 cm, Đức. Phễu chiết phân tách pha dung môi, Trung Quốc. Máy nghiền đồng thể polytron. ống hút 0,2 ml và 0,1 ml, Trung Quốc. Máy lắc, máy xay. Bình phun dung dịch lỏng có quả roa. Giấy lọc Whatman N01, chemapoli, Tiệp Khắc. Kính hiển vi olympus có gắn máy chụp ảnh, Nhật. Tủ cấy vô trùng tự động, Tủ cấy vô trùng tự động, Sanyo, Nhật Bản Máy có chân không quay, Đức Hộp petri, bình tam giác, ống đong 50ml, 100ml….. 3.2. Phương pháp: 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố aflatoxin: Tiến hành lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu của FAO [32] Cách lấy mẫu ngô bắp: lấy khoảng 50 hạt mỗi giống, ở 3 vị trí của bắp đầu, giữa, cuối, sau đó trộn đều, dàn mỏng thành hình vuông hay chữ nhật. Lấy theo kiểu đường chéo đến khi nào được 50 hạt thì dừng. Cách lấy mẫu lạc: Lạc được lấy từ các hộ nông dân trong tình trạng đã phơi khô và bảo quản trong các bao, lấy 1kg làm đại diện cho mỗi mẫu. Mỗi đại diện của từng mẫu trôn đều rồi chia tư. Từ một phần tư mẫu lại tiêp tục chia tư cho tới khi được 100 làm mẫu phân tích. Đối với các mẫu ngô thu thập từ các chợ, khối hạt ngô được trộn đều lấy 1kg làm đại diện. Một đại diện được xay nhỏ, trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và chia tư lấy 100g làm mẫu phân tích. 3.2.2. Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc bên trong hạt ngô; lạc. Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm từ bên trong hạt lương thục, được tiến hành theo phương pháp phát hiện hệ nấm mốc bên trong hạt lương thực của Christensen [22]. Khử trùng hệ nấm mốc bên ngoài hạt bằng dung dịch H2O2 5% trong 6 - 7 phút (Có thể rửa bằng dung dịch NaClO 3% hoặc AgCl 1% trong 4 phút), lắc mạnh và đều sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng 5-6 lần. Để ráo hạt và đặt hạt vào hộp petri có môi trường PDA đặc để phân lập các loại nấm mốc. Mỗi đĩa đặt 10 hạt, thí nghiệm nhắc lại 3 lần. Đặt đĩa đã cấy vào tủ ấm 300 C, sau 72 giờ lấy ra quan sát. Cho tiếp vào tủ ấm theo dõi 7 - 8 ngày. Đem ra đọc kết quả. 3.2.3. Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc: Dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc để phân loại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau. Nhỏ một giọt cồn: nước theo tỷ lệ 2:1 lên lam kính, dùng que cấy mốc, lấy mốc trong ống thạch nghiêng. Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên, nhỏ một giọt xanh metylen, đậy lá kính lên, để khô, tiến hành soi kính. 3.2.4. Phân loại các loài nấm mốc: Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc: 1:10. Một ml từ hai hay ba độ pha loãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộp petri. Sau đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 450 C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng. Để vào tủ ấm 300 C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạc giới hạn riêng biệt đồng đều. Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng tài liệu của Raper và Fennell [44]. 3.2.5. Phương pháp phân tích aflatoxin: Chúng tôi tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc kí bản mỏng do Doronina và Maksimenko[29] mô tả. Dựa trên cơ sở của phương pháp CB (AOAC)[20] có cải tiến gồm những giai đoạn sau: 25g mẫu được say mịn trên máy xay cà phê, chiết xuất aflatoxin bằng hỗn hợp aceton (100ml) và dung dịch NaCL 10% (50ml). Mẫu được nghiền trên máy nghiền đồng thể Polytron. Lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. Lấy 50ml dịch lọc và tủa bằng Pb(CH3COO)2 10% (50ml) để loại bỏ protein, lọc qua giấy lọc Whatman N0 1. 80ml dịch lọc được chuyển vào phễu chiết để chiết xuất bằng hai pha lỏng – lỏng với 40ml hexan (2lần). Lớp nước axeton được chiết xuất với 40ml cloroform (3lần), loại bỏ lớp nước axeton. Lớp cloroform có aflatoxin được giữ lại. Làm bay hơi toàn bộ lượng cloroform có aflatoxin ở máy cất quay cô chân không. Phần cặn được hòa tan vào 100 ỡl cloroform, giữ ở 40C cho đến lúc tiến hành định tính và định lượng aflatoxin. 25 g Mẫu ngô( lạc) Nghiền nhỏ Ngâm 24 h(trong tủ tối) 25 ml NaCl 10% 100ml acetol Nghiền 5 phút trên máy nghiền đồng thể Lọc lấy 50 ml dịch 50ml chì axetat 10% Lọc 80ml dịch Phễu chiết 40 ml n-hexan Lấy phần dich trong Bỏ phần dịch nổi trên chlorofoom Lấy pha trên cho vào bình cầu Cất quay( cô chân không) lấy 3ml cặn ống nhót, để bay hơi lấy cặn Bọc giấy bạc bảo quản lạnh 40C Na2SO4 khan Nhắc lại 2 lần Nhắc lại 3 lần Quy trình chiết tách aflatoxin được biểu thị qua sơ đồ sau 100 ml chlorofoom Định tính aflatoxin: Dùng bơm tiêm vi lượng (microsyring) nhỏ trên sắc ký lớp mỏng 2ỡl, 6ỡl và 2 lần 10ỡl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào phiến mỏng cách đường thẳng mép 2cm (từ mép dưới của phiến mỏng) và 1,5 – 2cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho các vết nhỏ không có đường kính quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2, 6, 10ỡl chuẩn aflatoxin B1 với nồng độ 0,71 ng/ỡl trên cùng một phiến bản mỏng. Nhỏ 5ỡl chuẩn aflatoxin B1 vào cùng một vết của mẫu phân tích (10ỡl) như chuẩn trong. Hệ dung môi dùng cho sắc ký bản mỏng một chiều là: cloroform : aceton 9:1. Giới hạn độ phát hiện của phương pháp là 4 ỡg aflatoxin/kg sản phẩm, hệ số dao động là 0,3 – 5,0. Phát hiện aflatoxin bằng cách phát hiện sự phát quang của phiến lớp mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (độ phát xạ cực đại 365nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Chọn phần tương ứng thích hợp của mẫu phân tích cho việc định lượng của aflatoxin. Thử xác minh aflatoxin: Thử với axit vô cơ : Phun lên bản mỏng dung dịch axit H2SO4 trong nước, tỷ lệ 1: 2. Nếu như màu phát quang của các vết của mẫu chiết không chuyển sang màu vàng như ở mẫu chuẩn, tức là không có aflatoxin trong mẫu thử. Nhưng nếu màu phát quang của các vết của mẫu thử aflatoxin ứng với độ di động sắc ký cũng chuyển thành màu vàng, điều đó có thể xem như là có aflatoxin trong mẫu thử. Định lượng aflatoxin: Nếu aflatoxin được phát hiện trong mẫu thử, có thể định lượng chúng như sau: Nhỏ 10ỡl chất chiết với đường kính của vết không quá 5mm, ở góc dưới, bên phải của bản mỏng, 1,5 cm cách mép. Ở góc dưới bên trái, 1,2 và 3 cm cách mép và 1,5cm từ mép dưới của bản mỏng, nhỏ 2, 4, 6 ỡl theo thứ tự dung dịch chuẩn aflatoxin. Nhỏ 6ỡl dung dịch chuẩn lên phía bên phải góc trên, 1,5cm cách mép phiến mỏng. Thực hiện sắc ký bản mỏng ở hệ dung môi cloroform : aceton (9:1). So sánh cường độ phát quang của các chuẩn aflatoxin khác nhau trên phiến mỏng với vết của mẫu thử. Bằng mắt thường định lượng aflatoxin ở vết của mẫu thử (nanogram) theo công thức sau: (ng/g hay ppb) C là nồng độ aflatoxin B1 ở mẫu thực phẩm phõn tớch ng/g (ppb) V1 là thể tích hỗn hợp nước – axeton (ml) V2 là thể tích hỗn hợp nước – axeton lấy cho phân tích (ml) V3 là thể tích hỗn hợp nước – axeton và acetate – chỡ (ml) V4 là thể tớch dịch lọc sau khi làm sạch bằng acetate – chỡ (ml) V5 là thể tích dung dịch chiết đó bay hơi làm sạch ở chloroform trước khi làm sắc ký bản mỏng (àl) V6 là thể tớch dung dịch chiết chấm vào bản mỏng (àl) m là lượng aflatoxin ở vết chuẩn trên phiến mỏng (ng) M là trọng lượng sản phẩm lấy để phân tích (g). 3.2.6. Quy trỡnh nuụi cấy nấm mốc Aspergillus flavus cho việc nghiờn cứu khả năng tạo aflatoxin: Các mẫu ngô đó được xác định là không có aflatoxin (theo phương pháp 3.2.5). Cân 25g ngô cho vào bỡnh tam giỏc, chộn với 3ml nước cất, lắc thật đều, khử trùng 1 atm trong 30 phỳt. Điều chế hỗn dịch của chúng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sao cho nồng độ 109 bào tử là tốt nhất.Theo phương pháp pha loóng hàng loạt ở mục (3.2.4). Số khuẩn lạc trên ml được tính theo công thức: Trong đó: C là tổng số khuẩn lạc đếm được trên mỗi hộp Petri giữ lại ở nồng độ có khuẩn lạc từ 30 – 100. n1 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng đầu. n2 là số đĩa giữ lại ứng với độ pha loóng thứ 2. d là hệ số pha loóng ứng với độ pha loóng đầu. Lấy 1ml hỗn dịch trên cấy vào môi trường đó khử trựng, nuụi cấy cỏc chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus ở 28 – 300C trong 9 ngày, mỗi ngày đều lấy ra lắc. Chiết xuất aflatoxin B1 từ cỏc chủng Aspegillus flavus và Aspegillus parasiticus đó nuụi cấy (theo phương pháp 3.2.5). Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. 3.2.7. Thăm dũ khả năng giảm aflatoxin bằng các chủng aflavus không tạo độc tố: Thớ nghiệm 1: Aspergillus flavus sinh độc tố với sản lượng 331ppb được nuôi hỗn hợp với từng chủng của 8 chủng Aspegillus flavus không tạo độc tố (số khuẩn lạc của 2 chủng là 7,1.106 khuẩn lạc), nuụi cấy trên cơ chất ngô đó xỏc định là khụng cú nấm mốc và khụng cú aflatoxin B1, nuôi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20 %, cho aflavus sinh trưởng và phát triển. Sau đó đem chiết để kiểm tra khả năng ức chế của từng chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố đối với chủng sinh độc tố. Thớ nghiệm 2: Aspergillus flavus không sinh độc tố aflatoxin B1(chủng có hiệu quả giảm độc tố cao nhất trong các chủng được thực hiện ở thí nghiệm 1), trộn vào cơ chất ngô đó xỏc định hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb (theo phương pháp 3.2.5), nuôi 7 ngày trong điều kiện nhiệt độ 28 – 300C, ẩm độ 19 – 20%, cho Aspergillus flavus sinh trưởng và phát triển. sau đó đem chiết để kiểm tra khả năng giảm hàm lượng aflatoxin B1 trên cơ chất ngô đó xỏc hàm lượng aflatoxin B1 là 3000ppb. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên một số mẫu ngụ: kết quả về mức độ nhiễm mốc trên một số mẫu ngô được trỡnh bày ở bảng 1 và bảng 2. Kết quả bảng 1 cho thấy ngô sau thời gian thu hoạch đó bị nhiễm mốc bờn trong hạt ngụ ở mức độ cao. 20/21 mẫu (chiếm 95% số mẫu phõn tớch) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh là 69%. 15/21 mẫu (chiếm 64% số mẫu phân tích) đó cú tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 67% - 100%, mức nhiễm trung bỡnh 85%. Cỏc loài nấm mốc nhiễm trờn cỏc mẫu ngụ thuộc cỏc chi mucor, và Aspergillus, Fusarium, penicillium. A.flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đó nhiễm trong 16/21 mẫu (76% số mẫu phõn tớch) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 2% đến 90% mức độ nhiễm trung bình là 17%. Chi Fusarium là chi nấm có rất nhiều loài có khả năng tạo các độc tố như fumonisin, Zearalenone, các trichothecen như deoxynialenol, nivalenol, T2- toxin, zearanone đã nhiễm trên các mẫu ngô khoả sát là 9/21 mẫu (42% số mẫu) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 40%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 12%. Điều này cho thấy các Fusarium có thể có khả năng nhiễm trên các mẫu ngô ngay ở giai đoạn sau thu hoạch và bảo quản không lâu. Chi Penicillium cũng có khả năng tạo độc tố như ochratoxin A, patulin, citrinin, penitrem A… đã nhiễm trong 12/21 mẫu (57% số mẫu phân tích), v ới tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 3% đến 97%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 16%. So sánh mức độ nhiễm mốc giữa các mẫu ngô khảo sát ta thấy: các giống YT1, YT6, YT7, VT3, ĐL1, ĐL2, CS1 có tỷ lệ hạt nhiễm ốc cao, từ 70% đến 100%. Giống YT8 hoàn toàn không bị nhiễm mốc, các giống ĐL4, ĐL5 có tỷ lệ hạt nhiễm mốc thấp, từ 10% đến 27%. Kết quả trên cho thấy rằng những giống này có khả năng đề kháng nấm mốc. Sự nhiễm nấm mốc khác nhau giữa NN1 (tỷ lệ nhiễm 67%) và YT8 (không bị nhiễm) được thấy rõ qua ảnh 1 và 2. Ảnh 1:Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô NN1 Ảnh 2: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô YT8 B ảng 1: Mức độ nhiễm nấm mốc trên ngô ở một số tỉnh Việt Nam STT Ngô nghiên cứu Địa điểm thu thập Tỷ lệ hạt nhiễm mốc (%) Mức độ nhiễm nấm mốc (%) Mucor Aspergillus Fusa rium Penici llium A. flavus A. Niger 01 YT1 Nghệ An 100 100 0 0 0 0 02 YT2 Nghệ An 100 33 13 0 37 97 03 YT3 Nghệ An 100 65 0 0 0 6 04 YT4 Nghệ An 70 30 2 19 0 0 05 YT5 Nghệ An 52 0 22 36 30 0 06 YT6 Nghệ An 90 67 5 0 40 3 07 YT7 Nghệ An 81 10 9 19 40 4 08 YT8 Nghệ An 0 0 0 0 0 0 09 YT9 Nghệ An 92 0 27 37 0 26 10 YT10 Nghệ An 43 0 17* 27 0 0 11 VT1 Nghệ An 67 10 25 25 9 0 12 VT2 Nghệ An 53 0 47 3 0 7 13 VT3 Nghệ An 87 0 20* 0 33 33 14 ĐL1 Nghệ An 100 100 0 0 0 0 15 ĐL2 Nghệ An 100 43 0 0 37 57 16 ĐL3 Nghệ An 70 30 20 25 0 0 17 ĐL4 Nghệ An 10 0 10 3 3 0 18 ĐL5 Nghệ An 27 0 13 13 0 6 19 CS1 Nghệ An 90 0 90 90 0 0 20 CS2 Nghệ An 82 19 20 20 10 30 21 CS3 Nghệ An 71 22 9 17 0 60 Ghi chú:* Asspergilus parasiticus YT: Yên Thành VT: Vĩnh Thành ĐL: Đô Lương CS: Cao Sơn Mức độ nhiễm mốc trên ngô tiêu thụ ở một số tỉnh được trình bày ở bảng 2. Kết quả cho thấy 11 mẫu ngô đã bị nhiễm mốc bên trong hạt ngô ở mức độ cao. 10/11 mẫu (95% số mẫu) đã có tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 100% mức nhiễm trung bình 50%. Các loài nấm mốc nhiễm trên các mẫu ngô thuộc các chi Mucor, Aspergillus, Fusarium, Penicilium, Aspergillus flavus là loài nấm mốc sinh độc tố aflatoxin đã nhiễm trong 9/11 mẫu (81% số mẫu phân tích) với tỷ lệ hạt nhiễm mốc từ 10% đến 97%, mức nhiễm trung bình là 31%. A.niger đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo sát trong 8/11 (71% số mẫu phân tích) với tỷ lệ nhiễm mốc từ 3% đến 70%, mức độ nhiễm mốc trung bình là 17%. Chi Fusarium đã nhiễm trên các mẫu ngô khảo