Đề tài Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở Việt Nam

Mục lục Mở đầu Phần 1 Tổng quan tài liệu 1.1. Đặc điểm của cây đu đủ 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại 1.1.2. Giá trị kinh tế 1.1.3. Phân bố 1.1.4. Các bệnh về cây đu đủ 1.2. Đặc điểm virus gây bệnh đốm vòng ở đu đủ (PRSV) 1.2.1. Cấu trúc 1.2.2. Cơ chế lan truyền 1.2.3. Các biện pháp phòng trừ 1.2.4. Gen kháng virus 1.2.5. Những thành tựu trong việc chống lại PRSV ở cây đu đủ 1.2.5.1. Trường đại học Hawaii và đại học Cornell, Mỹ 1.2.5.2. Trường đại học Kasetsart, Thailand và Queensland, Austrailia 1.2.5.3. Trung tâm Công nghệ sinh học, MARDI, Malaysia 1.3. Công nghệ sinh học phân tử và ứng dụng để tạo cây chuyển gen 1.3.1. Một số vector sử dụng trong sinh học phân tử 1.3.1.1 Vector nhân dòng TA-cloning 1.3.1.2 Vector biểu hiện protein pRSET 1.3.1.3 Vector chuyển gen 1.3.2. Một số loại enzim sử dụng trong sinh học phân tử 1.3.2.1 Enzim sao mã ngược (reverse transcriptase) 1.3.2.2 Enzim ligase 1.3.2.3 Enzim DNA polymerase 1.3.2.4 Enzim cắt giới hạn (restriction enzim) 1.3.2.5 Enzim Mung-bean nuclease 1.3.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử 1.3.3.1 Kỹ thuật RT-PCR 1.3.3.2 Kỹ thuật Western blotting 1.4. Công nghệ thông tin và ứng dụng trong sinh học phân tử 1.4.1. Phần mềm tin học DNAstar sử dụng trong SHPT 1.4.2. Internet và SHPT. Phần 2 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nguyên liệu 2.2. Phương pháp 2.2.1. Tách RNA tổng số chứa mRNA mã hoá protein vỏ của virus PRSV 2.2.2. Phương pháp điện di 2.2.3. Thiết kế Primer 2.2.4. Phương pháp RT-PCR 2.2.5. Phương pháp tách và tinh sạch DNA từ gel Agarose bằng ly tâm 2.2.6. Phản ứng ghép nối đoạn gen với vector 2.2.7. Phương pháp xử lý với enzim giới hạn và Mung-bean nuclease 2.2.8. Phương pháp biến nạp 2.2.9. Kiểm tra khuẩn lạc chứa vector tái tổ hợp bằng PCR 2.2.10. Tách chiết DNA plasmid từ E. coli 2.2.11. Phân tích trình tự nucleotide 2.2.12. Thiết kế vector chuyển gen mang gen PRSVN 2.2.13. Biểu hiện gen CP trong E.coli 2.2.14. Western blotting Phần 3 Kết quả và thảo luận Phần 4 Kết luận và đề nghị Phần 5 Tài liệu tham khảo Mở đầu Đu đủ là cây ăn quả được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Quả chín để ăn tráng miệng và quả xanh được dùng làm salad. Ngoài ra nhựa đu đủ còn là nguyên liệu tách chế phẩm enzim papain có giá trị thương mại sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và thuộc da. ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ vào khoảng 2500 ha với sản lượng khoảng 100.000 tấn ước tính đạt 200 - 300 tỉ đồng [17]. Nhưng hạn chế lớn nhất đối với sự phát triển cây đu đủ là sự hoành hành của bệnh đốm vòng do virus đốm vòng (papaya ringspot virus) gây ra. Virus này thuộc nhóm Potyirus có vật liệu di truyền là sợi ARN đơn. Khi virus này nhiễm vào cây đu đủ thì làm cho lá cây có những vòng đốm và mất khả năng quang hợp dẫn đến giảm nghiêm trọng năng suất và chất lượng quả. Bệnh được truyền do các loại rệp cây nên lan rộng rất nhanh. Đến nay toàn bộ các vùng trồng đu đủ ở nước ta [17] cũng như Austrailia [16], Thái Lan [14], Đài Loan [18], Malaysia [10]... và đặc biệt là Hawaii [5] đều đã bị nhiễm bệnh. Những phương pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan rộng của PRSV như chặt bỏ cây bị bệnh, cách ly vùng bị bệnh [7], sử dụng thuốc trừ sâu để diệt rệp truyền bệnh hay sử dụng chủng PRSV yếu cho nhiễm vào cây chưa bị bệnh để ngăn sự nhiễm các chủng mạnh hơn theo cơ chế bảo vệ chéo [19,20]. Nhưng những phương pháp này chỉ làm giảm sự lan truyền mang tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này. Hiện nay nhờ ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hoá protien vỏ (coat proetin gene) của virus vào genom của thực vật. Thành công đầu tiên là ở thuốc lá và cà chua kháng lại virus khảm thuốc lá [12]. Sau đó là sự kháng lại nhiều loại virus khác như cucumber mosaic virus [1], alfalfa mosaic virus [6] và potato leaf roll virus [4]. Gần đây ở Hawaii đã tạo được dòng đu đủ 55-1 kháng lại PRSV [2,3]. Dòng đu đủ được chuyển gen này đã trở thành giống thương mại sau khi lai với giống Kapoho [9]. Nhưng tính kháng của cây đu đủ chuyển gen này chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của Hawai mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác [15]. Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen mã hoá protien vỏ (coat protein gene) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh. Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã xây dựng đề tài: " Tách dòng và thiết kế vector chuyển gen của gen mã hoá protein vỏ (coat protein) từ virus gây bệnh đốm vòng cây đu đủ (PRSV) ở việt nam". Với mục đích là tạo được một vector chuyển gen mang gen mã hoá cho protein vỏ của PRSV của Việt Nam phục vụ cho việc chuyển gen này vào cây đu đủ tạo ra giống đu đủ mới có khả năng kháng lại PRSV ở Việt Nam. PhÇn 1 Tæng Quan tµi liÖu 1.1 §Æc ®iÓm c©y ®u ®ñ 1.1.1 Nguån gèc vµ ph©n lo¹i: §u ®ñ (Carica papaya L.) thuéc gièng Carica, chi Caricaeae, hä hai l¸ mÇm. Trong chi cßn 3 gièng kh¸c lµ Cyclimorpha, Jacaratia vµ Jarilla. §u ®ñ ®­îc biÕt cã tíi 45 loµi trong gièng Carica (Willis 1973). C¸c loµi cña Carica papaya L. ®· ®­îc t×m thÊy d¹ng d¹i trong tù nhiªn. Nã cã thÓ ®­îc b¾t ®Çu tõ vïng ®Êt thÊp cña Trung Mü, gi÷a Nam Mexico vµ Nicaragua (Story 1969), cã thÓ tõ sù lai gièng gi÷a hai loµi Carica Mexico. §u ®ñ ®­îc ph¸t t¸n däc theo ®­êng biÓn th­¬ng m¹i vïng nhiÖt ®íi nhê nh÷ng ng­êi th¸m hiÓm vµ nhµ bu«n vµo gi÷a thÕ kû 16. N¨m 1601, ng­êi Bå §µo Nha ®· phæ biÕn c©y ®u ®ñ tíi Ên ®é vµ Malaca, ng­êi T©y Ban Nha ®· ®­a c©y ®u ®ñ vµo Philippin... Ngµy nay, ®u ®ñ cã thÓ thÊy trong ph¹m vi tõ vÜ tuyÕn 320 B¾c ®Õn 320 Nam cña xÝnh ®¹o. Nã ®­îc trång phæ biÕn trong ®ån ®iÒn hoÆc mïa vô tiÓu n«ng. §u ®ñ lµ lo¹i c©y trång cho qu¶ ¨n nhá, d¹ng c©y th¶o. C©y sinh tr­ëng l©u n¨m nh­ng thêi kú c©y con ng¾n, trung b×nh kho¶ng 6 th¸ng. Sau mét n¨m cã thÓ cho thu ho¹ch qu¶ chÝn vµ sau ®ã lµ thu ho¹ch liªn tôc trong vßng nhiÒu n¨m. HÇu hÕt c©y trång mang tÝnh th­¬ng m¹i chØ ®­îc thu ho¹ch trong vßng 3 hoÆc 4 n¨m tr­íc khi tµn lôi vµ c©y trë lªn qu¸ cao g©y khã kh¨n cho viÖc thu ho¹ch. Mét c©y cho s¶n l­îng tõ 30 ®Õn 40 kg qu¶ chÝn trong mét n¨m. N¨ng suÊt tõ 30 - 40 tÊn/ha/n¨m vµ cã thÓ ®¹t 100 tÊn/ha/n¨m. §u ®ñ lµ c©y ®a tÝnh, nhiÒu loµi lµ kh¸c gèc (c©y ®ùc vµ c¸i riªng rÏ), nhiÒu loµi lµ cïng gèc (c©y l­ìng tÝnh). C©y kh¸c gèc ph¶i ®­îc thô phÊn chÐo do sù chia rÏ cña nhÞ vµ nhuþ hoa vµ hÇu nh­ sù ph©n t¸n cña phÊn hoa lµ nhê giã. C©y cïng gèc cã hoa l­ìng tÝnh nªn cã hiÖn t­îng tù thô phÊn. 1.1.2. Gi¸ trÞ dinh d­ìng vµ kinh tÕ cña c©y ®u ®ñ §u ®ñ ®­îc sö dông chñ yÕu lµ qu¶ chÝn lµm mãn ¨n tr¸ng miÖng v× qu¶ cã vÞ ngon, rÊt giÇu vitamin vµ muèi kho¸ng(Table 1), mét phÇn qu¶ xanh ®­îc dïng lµm salad, l¸ xanh dïng ®Ó hÇm thÞt trong mét sè mãn ¨n truyÒn thèng. Ngoµi ra, nhùa ®u ®ñ cßn ®­îc sö dông lµm nguyªn liÖu t¸ch chÕ phÈm papain (chiÕm 1% chÊt kh« cña qu¶ xanh) lµ enzim th­¬ng m¹i ®­îc sö dông trong c«ng nghiÖp thùc phÈm vµ thuéc da. Thªm n÷a, ®u ®ñ cßn ®­îc coi lµ mét lo¹i d­îc liÖu quÝ: rÔ, hoa, l¸ ®­îc dïng réng r·i trong ®«ng y nh­ hoa ®u ®ñ ®ùc ®­îc dïng ®Ó trÞ ho, h¹t dïng lµm thuèc chèng giun s¸n, h¹ sèt...(Vò C«ng HËu) Table 1: Thµnh phÇn dinh d­ìng cña qu¶ ®u ®ñ chÝn (100g) Thµnh phÇn  100g qu¶ chÝn   N¨ng l­îng  35.0 - 59 cal   N­íc  88.4 - 90.7 g   Protein  1.0 - 1.5 g   ChÊt bÐo  0.1 g   Carbohydrates  7.1 - 13.5 g   Ash  0.1 g   Calcium  11.0 - 31.0 mg   Phospho  7.0 - 17 mg   Iron  0.6 - 0.7 mg   Sodium  2.0 - 3.0 mg   Potassium  39 - 337 mg   Carotene  1.16 - 2.43 mg   Vitamin B1  0.03 - 0.08 mg   Vitamin B2  0.7 - 0.15 mg   Niacin  0.1 mg   Vitamin C  69.3 - 71.0 mg   S¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ chÝn ë n­íc ta ­íc tÝnh ®¹t 100.000 tÊn/n¨m. Mçi kg qu¶ chÝn trÞ gi¸ kho¶ng 2500® ®Õn 3500® th× tæng gi¸ trÞ ®¹t tõ 2500 - 3500 tØ ®ång (kho¶ng 150 -200 triÖu USD). Tæng s¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ t­¬i trªn thÕ giíi n¨m 1995 ­íc tÝnh ®¹t 5.9 triÖu tÊn ®¹t gi¸ trÞ kho¶ng 15 ®Õn 20 tØ USD (S¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ hµng n¨m cña mét sè n­íc s¶n xuÊt chÝnh ®­îc ®­a ra trong b¶ng 2). B¶ng 2: S¶n l­îng qu¶ ®u ®ñ hµng n¨m cña mét sè n­íc N­íc s¶n xuÊt  Tæng s¶n l­îng c¸c n¨m ( x1000 tÊn)    1984  1987  1990  1993  1995   Ch©u Phi  237   247  282  -   Nam Mü  -  -  685  723  754   B¾c Mü  -  -  1697  1738  1872   Hawaii  -  -  -  2866  3208   Thailan  -  -  206.5  363  342.9   Malaysia  -  84.28  -  -  66   Philipine  -  -  65  64.8  58.1   ViÖt Nam  -  -  -  -  100   Indonexia  -  -  349.6  422.4  714.1   (-) sè liÖu kh«ng ®­îc x¸c ®Þnh 1.1.3. Ph©n bè ë n­íc ta ®u ®ñ ®­îc trång trong v­ên nhµ ( tõ 5 ®Õn 10 c©y) cña gÇn 50% hé n«ng d©n. §u ®ñ còng ®­îc trång tËp trung trong c¸c n«ng tr­êng hoÆc trang tr¹i vïng ®ång b»ng s«ng hång, ven biÓn miÒn trung, ®ång b»ng s«ng Mekong vµ s­ên nói ®¸ v«i. Tæng diÖn tÝch vµo kho¶ng 2500 ha gåm kho¶ng 1250 ha trång tËp trung (B¶ng 3) vµ 1250 ha trång trong v­ên nhµ B¶ng 3: Vïng ph©n bè tËp trung cña c©y ®u ®ñ ë ViÖt Nam Vïng ph©n bè  DiÖn tÝch (ha)   Vïng nói vµ trung du phÝa b¾c - S¬n La - L¹ng S¬n  500   §ång b»ng s«ng Hång - Hµ Néi - H­ng Yªn - Nam Hµ - Ninh B×nh  250   Ven biÓn miÒn trung - NghÖ An - Thanh ho¸  100   §ång b»ng s«ng Mekong - Ninh ThuËn - Nha Trang - T©y Ninh - TiÒn Giang  500-550   1.1.4. C¸c bÖnh vµ s©u h¹i cña c©y ®u ®ñ - BÖnh ®èm vßng: H¹n chÕ lín nhÊt ®èi víi sù ph¸t triÓn c©y ®u ®ñ lµ sù hoµnh hµnh cña bÖnh ®èm vßng do virus ®èm vßng (papaya ringspot virus) g©y ra. Khi virus nµy nhiÔm vµo c©y ®u ®ñ th× l¸ c©y cã nh÷ng vßng ®èm, c¸c g©n l¸ xo¨n l¹i vµ phång lªn lµm mÊt kh¶ n¨ng quang hîp, ë qu¶ cã nh÷ng vßng xanh « l­u. C©y chËm ph¸t triÓn dÉn ®Õn gi¶m nghiªm träng n¨ng suÊt vµ chÊt l­îng qu¶. BÖnh ®­îc truyÒn do c¸c lo¹i rÖp c©y nªn lan réng rÊt nhanh. HiÖn nay tÊt c¶ c¸c vïng trång ®u ®ñ ë n­íc ta ®Òu ®· bÞ nhiÔm bÖnh kÓ c¶ khi lÊy h¹t cña nh÷ng c©y ®u ®ñ kh«ng bÞ bÖnh ®em gieo th× còng chØ kho¶ng 4- 5 th¸ng sau khi trång ch­a kÞp thu ho¹ch ®· thÊy xuÊt hiÖn triÖu trøng bÖnh. - RÖp s¸p, rÖp m×nh mÒm, bä nh¶y... ngoµi viÖc hót nhùa g©y t¸c h¹i trùc tiÕp cßn lµ vËt truyÒn bÖnh PRSV nhÊt thiÕt ph¶i trÞ b»ng nh÷ng thuèc hiÖn cã nh­ Bi 58ND, Mipcin 20ND, Trebon 10ND, Applaud-BAM 50ND.... Nh÷ng c©y ®u ®ñ trång lÎ tÎ, kh«ng ch¨m sãc cã rÊt nhiÒu lo¹i c«n trïng vµ thùc sù lµ nh÷ng æ dÞch nÕu kh«ng ph¸ bá th× nghÒ trång ®u ®ñ rÊt khã ph¸t triÓn. - TuyÕn trïng: tÊn c«ng vµo rÔ, g©y nh÷ng nèt sÇn. BÖnh bÞ nÆng ë n¬i ®Êt c¸t, n¬i ®· trång ®u ®ñ nhiÒu vô. Phßng trÞ b»ng lu©n canh, ®æ formalin 4% 25cc vµo mçi hè trång. - NhÖn ®á: G©y h¹i chñ yÕu vµo mïa kh«, ®Î trøng ë phÝa d­íi l¸, c¶ s©u non vµ s©u tr­ëng thµnh ®Òu hót nhùa lµm cho phiÕn l¸ mÊt diÖp lôc, chuyÓn mµu vµng. TrÞ b»ng Kelthane hoÆc nÕu kh«ng dïng Trebon phun vµo d­íi l¸. - BÖnh nÊm Helminthosporium: g©y ch¸y l¸ lµm cho l¸ bÞ biÕn mµu vµ kh« rông (Phun Kitazin 0,2% cã thÓ hçn hîp víi v«i 1%) - BÖnh phÊn tr¾ng: do nÊm Oidium caricae g©y ra (phun Benomyl, Zineb vµ c¸cthuèc thuéc nhãm l­u huúnh) - BÖnh nÊm Phytophtora: Võa h¹i rÔ, võa h¹i qu¶. NÊm ë trong ®Êt khã phßng trÞ, ë Hawaii ng­êi ta dïng thuèc x«ng h¬i ®Ó trÞ. T¹o nh÷ng ®iÒu kiÖn kh«ng thuËn lîi cho nÊm ph¸t triÓn nh­: trång trªn lip ®Êt cao, lu©n canh, tr¸nh cuèc xíi lµm ®øt rÔ. 1.2. §Æc ®iÓm cña PRSV 1.2.1 CÊu tróc PRSV thuéc lo¹i potyvirus, nhãm gåm cã kho¶ng 160 lo¹i kh¸c nhau. Nhãm potyvirus lµ lín nhÊt vµ quan träng nhÊt vÒ sù ¶nh h­ëng ®Õn kinh tÕ cña virus g©y bÖnh ë thùc vËt. Nh÷ng virus cña nhãm nµy cã genome lµ sîi RNA ®¬n cuèn vßng víi kÝch th­íc 780x12nm. Nã chøa kho¶ng 10kb liªn kÕt víi protein ë ®Çu 5' (VPg) vµ cã ®u«i polyA ®Çu 3' (Shukla et.al 1994). Sîi RNA genome nµy ®­îc bao bäc b»ng vá protein (Capsid). Vá protein lµ sù lÆp l¹i cña nh÷ng tiÓu phÇn nhá lµ protein vá (coat protein). RNA genome cña PRSV ®­îc dÞch m· trong tÕ bµo chñ t¹o ra polyprotein. Polyprotein nµy thuû ph©n t¹o ra 12 protein trong ®ã cã protein vá (viral coat protein). Trong suèt qu¸ tr×nh nhiÔm trong tÕ bµo chñ, virus sö dông nguyªn liÖu cña tÕ bµo chñ ®Ó t¹o ra nh÷ng b¶n sao genome còng nh­ c¸c protein cña nã. Sau ®ã RNA vµ nh÷ng tiÓu phÇn protein vá tù l¾p r¸p víi nhau t¹o ra nh÷ng virus hoµn chØnh riªng biÖt cã kh¶ n¨ng nhiÔm sang c¸c tÕ bµo kh¸c trong c©y hoÆc sang c¸c c©y kh¸c nhê c«n trïng. Genome cña virus m· ho¸ kho¶ng 12 lo¹i protein. Mét vµi lo¹i th× chøc n¨ng cña nã kh«ng hoµn toµn ®­îc x¸c ®Þnh, mét vµi lo¹i th× cã nhiÒu chøc n¨ng kh¸c nhau. Mét sè chøc n¨ng ®· ®­îc x¸c ®Þnh lµ vá protein, nh©n, th©n h×nh trô, phÇn bæ trî liªn quan ®Õn sù truyÒn nhê c«n trïng, helicase vµ nhiÒu protease, replicase, protein liªn kÕt genome, ATPase. 1.2.2. C¬ chÕ lan truyÒn cña PRSV PRSV ®­îc truyÒn dÔ dµng ®Õn tÕ bµo chñ th©n thuéc nhê nhiÒu loµi rÖp c©y kh¸c nhau víi ph­¬ng thøc kh«ng liªn tôc. Virus ®­îc truyÒn kh«ng liªn tôc nhê rÖp c©y lµ v× sù tån t¹i trong vËt truyÒn trung gian lµ rÊt ng¾n, ng¾n h¬n c¶ thêi gian tån t¹i cña virus trong dÞch chiÕt l¸ c©y. Trong qu¸ tr×nh truyÒn kh«ng liªn tôc, virus ®­îc truyÒn sang c«n trïng sau khi sinh tr­ëng mét thêi gian ng¾n trong c©y bÞ nhiÔm vµ cã thÓ ®­îc truyÒn tíi mét hoÆc vµi c©y ngay lËp tøc hay sau nhiÒu giê. Cã sù kh¸c nhau trong vËt truyÒn ®Æc hiÖu cña tõng lo¹i virus riªng biÖt trong nhãm thËm chÝ gi÷a c¸c d¹ng sinh häc cña cïng mét lo¹i virus. §iÒu nµy nãi lªn r»ng c¬ chÕ cña sù t­¬ng t¸c virus - vector v­ît ra ngoµi tÝnh chÊt sinh häc chung cña virus vµ vector truyÒn cña nã [ ]. 1.2.3. C¸c biÖn ph¸p phßng trõ - Sö dông c¸c chÊt ho¸ häc tiªu diÖt rÖp truyÒn bÖnh. - Lo¹i bá c¸c c©y bÞ bÖnh, tr¸nh trång gÇn c¸c c©y hä bÇu bÝ lµ ký chñ cña c¸c c«n trïng truyÒn bÖnh. - C¸ch ly víi c¸c vïng cã c©y bÞ bÖnh. C¸c vïng c¸ch ly cã thÓ t¹m thêi kh«ng bÞ bÖnh nh­ng do sù bïng ph¸t cña PRV th× c¸c vïng trªn còng sÏ bÞ nhiÔm. §iÒu nµy thÊy râ ë c¸c vïng trång ®u ®ñ qui m« lín ë Hawaii (isherwood,1994) C¸c ph­¬ng ph¸p nµy chØ ¸p dông ®­îc khi c©y ch­a bÞ nhiÔm bÖnhvµ mang tÝnh chÊt phßng trõ chø kh«ng thÓ chèng l¹i ®­îc bÖnh nµy - C¬ chÕ kh¸ng chÐo: sö dông mét chñng PRV yÕu cho nhiÔm vµo c©y (vÝ dô chñng HA5-1) ®Ó ng¨n chÆn sù l©y nhiÔm cña c¸c chñng PRV m¹nh h¬n. Nh­îc ®iÓm cña ph­¬ng ph¸p nµy lµ c¸c c©y bÞ nhiÔm chñng PRV yÕu tuy cã c¸c dÊu hiÖu bÞ bÖnh nhÑ h¬n nh­ng thiÖt h¹i vÒ s¶n l­îng còng lªn tíi 10-20%.(Yeh vµ Gonsalves, 1994). 1.2.4. Gen kh¸ng virus Tõ nhiÒu n¨m, ng­êi ta ®· biÕt c©y cá cã thÓ trë nªn kh¸ng ®èi víi c¸c chñng virus g©y bÖnh nÕu tr­íc ®ã g©y nhiÔm chóng víi cïng lo¹i hay víi virus t­¬ng tù. HiÖn t­îng nµy gäi lµ “b¶o vÖ chÐo”. H×nh nh­ protein vá cña thÓ virus ®ãng vai trß quyÕt ®Þnh ®èi víi tÝnh kh¸ng chÐo, bëi v× khi gen CP cña nhiÒu lo¹i virus RNA ®­îc thÓ hiÖn trong c©y (còng kh«ng nhÊt thiÕt ph¶i cã sù biÓu hiÖn gen m· ho¸ protein vá ë møc ®é cao) th× ph¶n øng b¶o vÖ chÐo biÓu hiÖn. TÝnh kh¸ng virus cßn cã thÓ ®¹t ®­îc khi biÕn n¹p thùc vËt víi DNA cã nh÷ng ®o¹n m· ho¸ RNA vÖ tinh. C¬ chÕ b¶o vÖ chÐo cßn ch­a ®­îc gi¶i thÝch ®Çy ®ñ nh­ng cã thÓ gi¶ thiÕt r»ng gi÷a thÓ virus g©y nhiÔm vµ tÕ bµo chñ cã sù hoµ trén s¶n phÈm biÓu hiÖn cña gen nªn ®· t¹o ra tÝnh kh¸ng virus cña c©y. B»ng viÖc sö dông c¸c tiÕn bé trong kü thuËt di truyÒn, ng­êi ta ®· chuyÓn gen CP cña virus vµo gièng ®u ®ñ, t¹o cho c©y cã kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh virus. §©y lµ mét thµnh tùu lín cña c«ng nghÖ sinh häc trong viÖc chèng l¹i bÖnh PRSV. C¸c dßng ®u ®ñ chuyÓn gen nµy sÏ gãp phÇn cã hiÖu qu¶ trong viÖc phßng trõ bÖnh PRSV. 1.2.5. Nh÷ng thµnh tùu trong viÖc chèng l¹i PRSV ë c©y ®u ®ñ Trªn thÕ giíi ®· cã nhiÒu phßng thÝ nghiÖm lµm vÒ chuyÓn gen ë thùc vËt, nh­ng ®èi víi sù chuûªn gen CP ®Ó t¹o c©y kh¸ng PRSV th× chØ cã mét sè phßng thÝ nghiÖm næi bËt lµ: 1.2.5.1. Tr­êng ®¹i häc Hawaii vµ ®¹i häc Cornell, Mü Hai n¬i nµy ®· ®i tiªn phong trong viÖc chuyÓn gen CP vµo ®u ®ñ ®Ó kh¸ng bÖnh ®èm vßng vµ ®· më ra mét ph­¬ng ph¸p míi cho viÖc t¹o c¸c gièng c©y trång kh¸ng bÖnh virus. Nhãm c¸c nhµ khoa häc gåm cã: Dr. Dennis Gonsalves, Khoa bÖnh häc thùc vËt, ®¹i häc Cornell, tham gia trong viÖc t¸ch ph©n lËp gen CP tõ virus PRSV. Dr. Jerry Slightom thiÕt kÕ cÊu tróc gene CP dïng cho chuyÓn gen Dr. Maureen Fitch (USDA) chuyÓn gen CP vµo ®u ®ñ. Dr. Richarh Manshardt, Khoa trång trät, ®¹i häc Hawaii, tham gia kiÓm tra vµ kh¶o nghiÖm c¸c dßng c©y chuyÓn gen. Nhãm nghiªn cøu nµy ®· ®­a Gen CP cña dßng virus PRSV HA 5-1 vµo vector pGA482 vµ chuyÓn thµnh c«ng vµo gièng ®u ®ñ "Sunset" b»ng sóng b¾n gen. Hä ®· t¹o ra hai dßng ®u ®ñ mang tªn 55-1 vµ 63-1 cã mang gen CP trong genom vµ ®· kiÓm tra b»ng lai Southern vµ ELISA. KÕt qu¶ thö nghiÖm kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh cña thÕ hÖ R1 tõ dßng 55-1 cho thÊy nã cã tÝnh kh¸ng bÖnh rÊt cao (chØ cã 5% cña 128 c©y ®­îc thö nhiÔm bÖnh) ®èi víi c¸c dßng virus t¸ch tõ Hawaii. Nh­ng kh«ng kh¸ng ®­îc c¸c dßng t¸ch tõ n¬i kh¸c (vd: Thailand). V× thÞt qu¶ cña dßng 55-1 cã mÇu hång kh«ng phï hîp víi thÞ tr­êng nªn dßng 55-1 nµy ®· ®­îc lai víi gièng Kapoho t¹o ra dßng "Rainbow" cã thÞt qu¶ mÇu vµng mang ®Çy ®ñ c¸c ®Æc tÝch cña gièng gèc. HiÖn nay dßng "Rainbow" ®· ®­îc ®¨ng ký b¶n quyÒn vµ trë thµnh gièng ®u ®ñ chuyÓn gen th­¬ng m¹i ®Çu tiªn cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i PRSV. 1.2.5.2 Tr­êng ®¹i häc Kasetsart, Thailand vµ Queensland, Austrailia Nhãm nghiªn cøu gåm cã: Dr. Tom Burn, Dr. Kanokawan Kanokawaree, Dr. Supart Attathom §¹i häc Kasetsart, Thailand Dr. Srimake Chaowphongphang, ®¹i häc Queensland, Austrailia. §Ó kiÓm so¸t bÖnh PRV th× tõ n¨m 1987 Thailand ®· t¹o ra c¸c gièng cã kh¶ n¨ng chÞu bÖnh cao theo ph­¬ng ph¸p b¶o vÖ chÐo nh­ng hiÖu qu¶ kh«ng cao. N¨m 1995, Thailand ®· cã ch­¬ng tr×nh ph¸t triÓn c©y ®u ®ñ chuyÓn gen kh¸ng bÖnh PRSV ®­îc tµi trî cña ACIAR kÕt hîp gi÷a tr­êng ®¹i häc Kasetsart, Thailand vµ Queensland, Austrailia. Gen CP ®· ®­îc t¸ch tõ c¸c chñng virus cña Thailand. Gen nµy ®­îc chuyÓn vµo hai gièng Khak-Dum vµ Khak-Nual b»ng ph­¬ng ph¸p b¾n gen víi nguyªn liÖu lµ ph«i non qua giai ®o¹n m« sÑo. HiÖn nay hä còng ®· thu ®­îc c©y chuyÓn gen, ®ang thö nghiÖm tÝnh kh¸ng PRSV. 1.2.5.3. Trung t©m C«ng nghÖ sinh häc, MARDI, Malaysia Nhãm nghiªn cøu gåm Dr. Hassan Matd Daud t¸ch ph©n lËp gen CP tõ c¸c chñng virus cña Malaysia. Dr. Tan Chong Seng thiÕt kÕ cÊu tróc CP gen, ®­a vµo vector p2K7 dïng cho chuyÓn gen b»ng sóng b¾n gen vµ vector pCAMBIA2300 dïng cho chuyÓn gen b»ng Agrobacterium. Dr. Vilasini Pillai: chuyÓn gen CP vµo gièng ®u ®ñ Ekotika. HiÖn nay ®· thu ®­îc c©y chuyÓn gen Ro ®­îc kh¼ng ®Þnh b»ng lai southern nh­ng ch­a ®­îc thö kh¶ n¨ng kh¸ng bÖnh. 1.3. Sinh häc ph©n tö vµ øng dông ®Ó t¹o c©y chuyÓn gen 1.3.1. Mét sè vector sö dông trong sinh häc ph©n tö 1.3.1.1. Vector nh©n dßng TA- cloning Vector nµy ®­îc thiÕt kÕ riªng cho viÖc nh©n dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit cña mét ®o¹n gen nµo ®ã. Do tÝnh chÊt cña s¶n phÈm ph¶n øng PCR khi sö dông enzim Taq DNA polymerase ®Ó nh©n lªn mét ®o¹n gen nµo ®ã th× bao giê trªn mçi m¹ch ®¬n hai ®Çu cña s¶n phÈm còng g¾n d­ thªm mét dATP vµo nªn vector TA-cloning ®­îc thiÕt kÕ d¹ng më vµ trªn mçi m¹ch ®¬n ë hai ®Çu cã g¾n thªm mét dTTP. V× vËy, ®o¹n DNA s¶n phÈm cña ph¶n øng PCR cã thÓ g¾n trùc tiÕp vµo vector nhê T4 ligase. Xung quanh ®iÓm chÌn ®o¹n DNA nµy cã vÞ trÝ nhËn biÕt cña mét sè enzim giíi h¹n ®Ó dÔ dµng cho viÖc thiÕt kÕ cÊu tróc gene sau nµy. PhÝa tr¸i cña ®iÓm chÌn ®o¹n DNA lµ lac promoter cho viÖc biÓu hiÖn cña gen lacZ(, trïm qua ®iÓm chÌn lµ ®o¹n gen lacZ( m· ho¸ 146 a xÝt amin cña (-galactosidase gióp cho viÖc chon läc khuÈn l¹c xanh/tr¾mg. Vector nµy mang vïng gen tù sao m· ColE1 origin biÓu hiÖn sè l­îng cao b¶n sao trong E.coli vµ gen chän läc lµ hai gen kh¸ng kanamycin vµ Ampicillin. §Æc biÖt, cã tr×nh tù b¾t cÆp bæ sung cña hai ®o¹n måi M13 forward vµ M13 reverse n»m ë hai bªn cña ®iÓm chÌn phôc vô cho viÖc x¸c ®inh tr×nh tù ®o¹n DNA ®­îc chÌn vµo (h×nh ) H×nh : B¶n ®å vector TA-cloning pCR2.1 1.3.1.2. Vector biÓu hiÖn protein pRSET Vector pRSET cã nguån gèc lµ c¸c vector biÓu hiÖn pUC, ®­îc thiÕt kÕ cho sù biÓu hiÖn protein vµ tinh chÕ protein ë møc ®é cao trong E. coli. Sù biÓu hiÖn ë møc ®é cao cña c¸c tr×nh tù DNA ®­îc ®­a vµo vector pRSET ®­îc t¹o ra do sù ®iÒu khiÓn cña T7 promoter. §o¹n DNA ®­îc ®­a vµo vÞ trÝ trong khung dÞch m· víi tr×nh tù m· ho¸ ®o¹n peptid tÝn hiÖu tËn cïng ®Çu N, mét bé m· khëi ®Çu dÞch m· ATG, mét ®o¹n tr×nh tù m· ho¸ 6 a xÝt amin histidine cã chøc n¨ng lµ vïng liªn kÕt víi kim lo¹i trong protein ®­îc dÞch m·. Vïng liªn kÕt kim lo¹i cña ®o¹n peptide tÝn hiÖu cho phÐp tinh chÕ protein t¸i tæ hîp mét c¸ch ®¬n gi¶n b»ng s¾c ký ¸i lùc. Mét ®o¹n tr×nh tù cã tÝnh n¨ng lµm æn ®Þnh cho sù sao m· cã nguån gèc tõ gen 10 cña phag¬ T7. Mét ®o¹n tr×nh tù qui ®Þnh vÞ trÝ c¾t cña enzim enterokinase trªn chuçi peptide n»m gi÷a vïng liªn kÕt víi kim lo¹i vµ protein t¸i tæ hîp, cã t¸c dông lo¹i bá ®o¹n peptide tÝn hiÖu ®Çu N tõ protein t¸i tæ hîp ®· tinh s¹ch. Trong pRSET, vÞ trÝ MCS (multiple cloning site) cã vÞ trÝ c¾t cña 10 enzim giíi h¹n: BamH I; Xho I; Bgl II; Pst I; Pvu II; Kpn I; Nco I; EcoR I; BstB I vµ Hind III. Theo ®ã, ®Ó t¹o ra ®óng protein t¸i tæ hîp ch­¸ ®o¹n pepetide tÝn hiÖu cÇn ph¶i chÌn ®o¹n DNA vµo mét trong nh÷ng vÞ trÝ trong MSC sao cho ®óng khung dÞch m· víi m· khëi ®Çu ATG cña vector. Vector pRSET cã 3 lo¹i pRSET A, B vµ C (h×nh 2) chØ kh¸c nhau ®o¹n tr×nh tù gi÷a vïng m· cho ®o¹n peptide tÝn hiÖu vµ MCS. §Ó biÓu hiÖn ®óng protein ®· ®­îc m· ho¸ bëi tr×nh tù DNA, yÕu tè quyÕt ®Þnh ®Çu tiªn lµ vÞ trÝ c¾t giíi h¹n ph¶i thÝch hîp cho sù lai ghÐp ®o¹n DNA vµ sau ®ã lµ vector nµo sÏ duy tr× ®­îc khung dÞch m· cña vector vµ ®o¹n DNA ®­îc chÌn vµo. Vector t¸i tæ hîp pRSET ®­îc chuyÓn vµo E. coli TOP 10F’ ®Ó nh©n dßng vµ duy tr×. Muèn biÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp th× cÊu tróc vector nµy ph¶i ®­îc chuyÓn vµo E. coli BL21 (DE3) lµ chñng E. coli biÓu hiÖn T7 polymerase d­íi sù ®iÒu khiÓn cña lacUV5 promoter vµ mét plasmid biÓu hiÖn T7 lysozyme. Sù biÓu hiÖn cña T7 polymerase cÇn thiÕt cho sù tæng hîp protein t¸i tæ hîp, khi cã mÆt IPTG tÕ bµo ®­îc c¶m øng ®Ó biÓu hiÖn T7 RNA polymerase ë møc ®é cao vµ lµm t¨ng sù tæng hîp protein t¸i tæ hîp. 1.3.1.3. Vector chuyÓn gen ë thùc vËt 1.3.1.3.1 Ti - Plasmid N¨m 1974, Zaenen vµ céng sù ®· ph¸t hiÖn ra A. tumefacien mang mét cÊu tróc di truyÒn ngoµi nhiÔm s¾c thÓ lµ mét plasmit khæng lå (Ti-plasmid) chøa gen liªn quan ®Õn sù t¹o thµnh khèi u ë vÕt th­¬ng c©y bÞ chóng x©m nhËp[32]. Ti-plasmit lµ mét ®o¹n ph©n tö ADN m¹ch vßng, sîi kÐp cã träng l­îng ph©n tö b»ng 3-5% so víi träng l­îng ph©n tö cña nhiÔm s¾c thÓ vi khuÈn. Víi kÝch th­íc kho¶ng 200kb, trong tÕ bµo chóng tån t¹i nh­ mét ®¬n vÞ sao chÐp ®éc lËp. MÆc dï ®­îc t¸ch ë c¸c chñng Agrobacterium kh¸c nhau, song tÊt c¶ Ti-plasmit qua ph©n tÝch di truyÒn cho thÊy, chóng ®Òu chøa ®ùng ba vïng quan träng. Vïng T-ADN vµ vïng vir (virulence) cã liªn quan trùc tiÕp ®Õn sù h×nh thµnh khèi u. Vïng cßn l¹i lµ vïng dÞ ho¸ opine (opine catabolism region) [28]. - CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña vïng T-ADN: Nghiªn cøu tr×nh tù gen trªn vïng T-ADN ë c¸c Ti-plasmit kh¸c nhau ng­êi ta thÊy r»ng T-ADN ®­îc giíi h¹n bëi c¸c ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i gÇn nh­ hoµn toµn kho¶ng 25 bp ®­îc gäi lµ ®o¹n ®Çu biªn (T-ADN border sequence). Chóng lµ dÊu hiÖu nhËn biÕt cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt. ë ®o¹n ®Çu biªn bªn ph¶i cã chøa yÕu tè cis, cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo c©y chñ. §o¹n ®Çu biªn bªn tr¸i gi÷ vai trß ®Ó qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN kÕt thóc b×nh th­êng. T-ADN mang rÊt nhiÒu gen vµ biÓu hiÖn trong qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ cña tÕ bµo thùc vËt. C¸c ph©n tÝch tr×nh tù gen trªn T-ADN cho thÊy T-ADN còng mang c¸c dÊu hiÖu khëi ®Çu phiªn m· (hép TATA) vµ kÕt thóc phiªn m· (hép AATAAA). Gen tån t¹i trªn T-ADN ®­îc chia lµm hai hÖ chÝnh [11]: + HÖ thø nhÊt lµ gen g©y ung th­ onc, gen nµy m· ho¸ sinh tæng hîp auxin vµ cytokinin, kÕt qu¶ lµm cho c¸c tÕ bµo ph©n chia liªn tôc vµ biÕn ®æi h×nh d¹ng t¹o ra c¸c nèt sÇn trªn c©y. + HÖ gen thø hai m· ho¸ cho c¸c enzim cÇn thiÕt trong qu¸ tr×nh tæng hîp opine. Vi khuÈn sö dông opine lµm nguån n¨ng l­îng cung cÊp cacbon vµ nit¬. D¹ng opine ®­îc tæng hîp trong khèi u cã thÓ lµ nopaline, octopine, agropine, manopine vµ agrocinopine phô thuéc vµo c¸c chñ Agrobacterium sinh ra khèi u ban ®Çu [11]. §©y còng lµ c¬ së ®Ó ph©n lo¹i c¸c chñng Agrobacterium.