Đề tài Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

ư sau. ti = [ t0.tMC.( 1+ ki’) ] / [ tMC + t0.ki’ ) ] (2) Nếu như mà ( tMC << t0.k’ ) thì chúng ta lại có: ti = [ tMC.( 1 + ki’) ] / ki’ ] (3) Nghĩa là thời gian lưu tR có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki’. Khi hệ số ki’ lớn, thì thời gian lưu ti cũng lớn. Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc vào nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công thức sau đây. q = [V.( CSP- CMC )] / [ 1 – vmc.(CSP – CMC )] (4) Trong đó: V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di. CSP : Nồng độ của Mixen (mol/l.) CMC : Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.) Vmc : Tốc độ trung bình của Mixen . Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen . Và khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki’, và tốc độ của dòng EOF, được tính như sau. ki’ = Ki.vmc .( CSP - CMC ) (5) vEOF = ( me + mMC ).E (6) Cùng với các tham số tR, ki’ , Rij đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động Ki của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau. lnKi = (DH0/R.T) + ( DS0/R ) (7) Trong đó: DH0, DS0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động. Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần ở tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số Ki này cũng thay đổi rất khác nhau. Đó chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di. Đồng thời với các chất hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ số Ki khác nhau. Ngoài các đại lượng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản. Rij = A.z.ti (8) Trong đó: ________ Hiệu lực tách A: A = Ö (N/4) . (9) Độ chọn lọc z : z = [( a - 1 )/a] với a = k2’/k1’ (10) Thời gian lưu tR : ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tmc )] / [1 + k1.( t0/tmc)]} (11) Trong đó: k’i : hệ số dung tích ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian không lưu giữ của chất tmc: Thời gian không lưu giữ của Mixen. Công thức (8) và (9) này cho chúng ta thấy rằng, độ phân giải Rij có thể được nâng cao (làm tốt), khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc a và hệ số dung tích ki’ của các chất tan là phù hợp nhất. Để có được hệ số dung tích ki’ tốt, trong MEKC, có thể đạt được bằng cách thay đổi pH, thay đổi nồng độ của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch đệm điện di). Nói chung, hệ số dung tích ki’ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là, nhất là khi dùng các chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt. Công suất điện trong vùng từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC). Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm. Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 mm), việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều. Vì thế nên tránh dùng thế quá cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn 100 mm và cần phải điều nhiệt mao quản. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF. Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen. Bảng 2.1. Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC Loại chất Ví dụ CMC (mM) Số phần tử kết tụ (Mixen) Anionic SDS 14 62 Cationic DTAB 14 50 1,3 78 Non-Ionic Octylglucoside - - (không ionic) n-Dodecyl-b-D-maltoside 0,16 - Triton-X 0,24 140 Ionic kép CHAPS 8 10 (Zwitterionic) CHAPSO 8 11 Bile Salts Axít Chlolic 14 2-4 2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ Cx của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là: Hi = k1.Ci (12) và Si = k2.Ci (13) Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i. Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi . k1, k2 là hằng số điều kiện thực nghiệm. Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích trong mẫu. 2.3. Thực nghiệm 2.3.1. Máy móc và dụng cụ - Máy điện di model 1602A của hãng HP3D (Đức) với detector DAD, kết nối với phần mềm HP chemstation - Mao quản silica trần – loại bubble cell, đường kính 50 µm, chiều dài 64.5 cm, chiều dài hiệu dụng 58 cm của hãng HP (Đức) - Mắc trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu - Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức - Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc 0.45 μm; 0.2 μm của hãng Millipore (USA) - Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích 2.3.2. Hóa chất - Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H2O, AMO.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O, CEF, OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp - Nước deion được lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore (USA) - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4… của hãng Merk ( Đức). - Đệm Borat được pha từ axit boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O với nước deion. Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc kích thước lỗ 0.2 μm và định mức tới thể tích mong muốn. Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH và H3BO3, giá trị pH thay đổi cho phép ± 0.05 và được đo sau khi thêm SDS. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ thường - Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000 mg/l. Dung dịch 1000 mg/l được pha loãng 10 lần thành 100 mg/l.( 1000 mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100 mg/l bảo quản 1 tháng). Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100 mg/l và sử dụng trong ngày. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng trực tiếp. CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis. Do các β-Lactam đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9. Phổ thu được thể hiện hình 3.1 Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10 mg/l ) Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 198 nm. Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP 3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn 100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ 25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 50 µm Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là 58cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di. Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột, rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút. 3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài. Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu. Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng DH, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng. Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm 3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS. Theo lý thuyết, độ điện di [7,8] mtot(i) = ( mef + mEOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14) Thời gian lưu của chất tan i là: ti = (L.l)/(mtot(i) .V) (15) Trong đó: mtot(i) = (mef + mEOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan. V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV. l: Chiều dài hiệu dụng (56cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản (64.5cm). E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V (kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản. Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan được tính theo công thức sau: µef = mtot - mEOF µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 56/ ti .V mEOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 56/ t0 . V Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di metanol tinh khiết. Thực tế trong mỗi thí nghiệm chúng tôi quan sát thấy t0 trùng với tín hiệu nhiễu trên đường nền gây ra bởi dung địch đệm điện di. Vì thế trong các thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng thời gian xuất hiện của tín hiệu này như thời gian t0 3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di chứa: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Gía trị pH thay đổi tại pH = 8.25; 8.0; 7.75; 7.5. Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactam ở pH 8.25; 8.0; 7.75; 7.5 Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam pH Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 8.25 5.47 8.38 9.37 9.48 10.83 11.78 12.404 13.44 8.0 5.58 8.35 9.95 10.12 11.11 12.09 12.74 13.08 7.75 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 7.5 5.83 8.41 11.43 11.87 12.36 13.05 14.11 14.43 Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 7.5 đến 8.25 (>4), bề mặt mao quản tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton, làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thường hướng theo phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất hoạt động bề mặt SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Do từng tính chất riêng của các β-Lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau. Khi chất phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi không bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di thẩm thấu. Kết quả là trong dòng EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và các ion mang điện tích âm. Mixen và dòng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau. Khi điện di ở pH từ 7.5 đến 8.25 làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan bị thay đổi theo. Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm thay đổi chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại. Kết quả sẽ làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao hơn giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dòng EOF. Như vậy cùng với tác dụng làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm thay đổi cả tốc độ của dòng EOF. Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đối lớp điện kép và thế Zêta. Qua đó mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất. Từ hình 3.3, ở pH =7.5 đến 8.25 độ điện di của PENG, OXA, CEF hầu như không bị ảnh hưởng. Đối với CLO độ điện di ko đổi pH 7.5 đến 8, đến pH 8.25 độ điện di cao hơn. Với CEP, AMP độ điện di thấp dần khi tăng dần gía trị pH, tại pH = 8.25 và 8.0 chân pic của CEP và AMP chưa tách ra được khỏi nhau. Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn hơn và pic nhọn hơn. Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở AMP và CEP. Từ nghiên cứu, chũng tôi chọn pH =7.75 tốt nhất để tách các β-Lactam trong những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế người ta chọn chất đệm pH cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao quản. Qua đó sẽ làm ảnh hưởng đến độ điện di hiệu dụng µef của chất phân tích. Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường có hiệu lực tốt hơn các hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có khả năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ cao mà không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản. Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 25 mM đệm Photphat - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH =7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa xuất hiện pic trước thời gian 15 phút. Vì vậy chũng tôi quyết định chọn đệm Borat cho các khảo sát tiếp theo. 3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực chất nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nó liên quan đến sự hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di. Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 75 mM; 100 mM và 125 mM. Các điều kiện khảo sát: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ SDS = 75 mM;100 mM và 125 mM Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-Lactam Nồng độ SDS(mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 75 5.8 8.552 10.437 10.662 11.235 12.708 12.951 13.298 100 5.9 8.74 11.32 11.68 12.31 13.17 13.4 14.12 125 6.1 9.397 12.45 12.802 14.085 14.414 15.011 17.372 Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên thành mao quản qua tương tác ionic hay hiệu ứng kị nước. Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Chất hoạt động bề mặt là SDS là dạng anionic làm tăng dòng EOF, sẽ di chuyển về anot ( cực dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Theo lý thuyết [7,8] Độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản. Rij = A.z.ti Trong đó: ________ Hiệu lực tách A: A = Ö (N/4) . Độ chọn lọc z : z = [( a - 1 )/a] với a = k2’/k1’ Thời gian lưu tr : ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tm )] / [1 + k1.( t0/tm)]} Trong đó: k’i : hệ số dung tích ti : Thời gian lưu của chất tan. t0 : Thời gian không lưu giữ của chất Theo công thức, độ phân giải R có thể được nâng cao (làm tốt) khi tối ưu hóa được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc α và hệ số dung tích k’i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k’i nói chung là tăng tuyến tính cùng với sự tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng tăng nồng độ thì thời gian lưu các chất β-Lactam càng tăng do ảnh hưởng của nồng độ các ion trong dung dịch càng lớn, tương tác với Mixen bền và lâu hơn sự di chuyển của nó, dẫn đến tốc độ di chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lưu tăng, cường độ dòng cũng tăng, chiều cao pic bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo dãn và tù hơn. Độ điện di hiệu dụng của AMO và ClO tăng khi tăng nồng độ SDS, các chất còn lại độ điện di hiệu dụng hầu như không thay đổi, khả năng tách thay đổi nhiều, các pic tách hết chân. Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nóng lên. Tại nồng độ 125 mM nhận thấy tín hiệu nền xấu hơn so với nồng độ 75 mM và 100 mM, pic dãn rộng hơn. Nồng độ SDS 75mM hiệu quả tách cũng rất tốt nhưng chiều cao pic không bằng 100 mM, sẽ gây ảnh hưởng độ nhạy. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ SDS = 100 mM tối ưu để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di. Như vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại bốn gía trị là 20 mM; 25 mM; 30 mM; 35 mM với điều kiện khảo sát như sau: - 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C HÌnh 3.6 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ đệm 20 mM, 25 mM, 30 mM và 35 mM Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu ( phút) Nồng độ đệm (mM) Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO 20 5.42 7.94 9.90 10.12 10.49 11.51 11.80 11.91 25 5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 30 6.08 9.3 12.03 12.37 13.53 14.22 14.86 16.0 35 6.31 10.95 14.16 14.58 17.54 17.8 19.70 22.42 Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu dụng của 7 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt. Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng, thường làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ thể nhất ở nồng độ 35 mM. Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dòng EOF và quá trình sắc ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion lớn, taọ ra dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 30 mM và 35 mM nồng độ đệm cao nên pic đã bị dãn và tín hiệu nền xấu đi nhiều, hiệu quả tách cũng kém, pic của PENG và OXA bị dính chân vào nhau tại nồng độ 35 mM. Nồng độ đệm 20 mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém, h