Đề tài Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy In Vitro tế bào cây dừa cạn

ong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y. Tuy nhiên nguồn thực vật ngoài thiên nhiên cũng đang ngày một hạn hẹp,hơn nựa khi chiết xuất hợp chất từ thiên nhiên thường hiệu suất không cao.Ứng dụng nuôi cấy tế bào đơn để thu nhận hợp chất tự nhiên đang là một hướng mới cho ngành công nghệ sinh học hiện nay.Một trong nhữ hợp chất được thu nhận thành công từ nuôi cấy tế bào đơn là các hợp chất alkaloid. I.TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ ALKALOID. A.HỢP CHẤT THỨ CẤP 1.Định nghĩa: Sản phẩm trao đổi chất bậc hai hay hợp chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào,sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào và đi ra môi trường ngoài. Phần lớn các sản phẩm bậc hai thường không có ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế bào.Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào,cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa. Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. 2.Vài nét về tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam. Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền với công nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó đến nay đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất chính là quy trình sản xuất sâm Ngọc Linh do Học viện Quân y khai thác. Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/02/2009 tại Việt Nam. Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ cây thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra còn có “Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng” của Viện Sinh học Nhiệt đới trong nghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense”. Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm. B. Alkaloid. 1 Lịch sử phát hiện. Năm 1804- 1805, pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế được dạng muối của nó. Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính của cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt. Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là “cinchonino” sau đó hai nhà hóa học pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai alcaloid là quinin và cinchonin. Năm 1918, phát hiện ra alcaloid của hạt mã tiền là strycnin và bruxin. Năm 1918 phát hiện ra được cafein trong chè, cà phê rồi sau đó là nicotin trong thuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc phiện, cocain trong lá coca. Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 Alcaloid khác nhau trong đó có 3293 chất đã xác định được công thức hóa học. Hiện nay đã phát hiện ra được rất nhiều số lượng Alcaloid và cũng đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng . 2 Khái quát về Alkaloid 2.1 Khái niệm. Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là: - Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. - Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh. - Có hoạt tính sinh học rất quan trọng. - Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng. Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo. 2.2 Cấu tạo hóa học. Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một chuyên nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi vì chúng có hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu. Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu nằm trong vòng. Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin, Hordenin, là các protoalkaloid. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong nghiên cứu alkaloid. 2.3 Phân loại. Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất alkaloid trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây (khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướng chia chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin, Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các nhóm: Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin. Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid Tên cấu trúc Công thức Hợp chất thí dụ Apocphin Stephanin, Apomocphin Erythrinan Erythratin Pyrolidin Nicotin, Stachydrin, Hygrin Indol Reserpin, Strychnin, Echitamin Mocphinan Mocphin, Codein Purin Cafein, Theophylin Pyridin Rixinin Pyroligidin Heliotridin Quinolin Dictamnin Steroit Solasodin, Tomatidin Tropan Hyosxinamin,Cocain II.THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ LOÀI Catharanthus roseus (L.) G. Don BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO. Catharanthus roseus Tên khác: Bông dừa, Hải đăng, Hải đằng. Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G. Don Tên đồng nghĩa: Vinca rosea L. Họ: Trúc đào (Apocynaceae) Tên nước ngoài: Madagasca Periwinkle, Pervenche mangache. Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, dầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3-5 mm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên. Cụm hoa : Hai hoa ở kẽ lá. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3-4 mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2-4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hay hồng tím , trắng , …ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5-1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím)Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị : rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa,chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn : rời ở bầu nhưng dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy: dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2 đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn. 2 quả đại dài 3-5 cm, mỗi quả chứa 12-20 hạt, xếp thành 2 hàng. Hạt nhỏ, hình trứng. Đặc điểm giải phẫu:  Vi phẫu rễ: Lớp bần gồm 4-5 lớp tế bào hình chữ nhật. Mô mềm vỏ khoảng 5-6 lớp tế bào có vách bằng cellulose, hình dạng thay đổi, xếp không đều đặn. Trụ bì vách bằng cellulose. Libe 1 bị libe 2 đẩy ra sát trụ bì, các tế bào bị ép dẹp lại. Libe 2 là những tế bào hình chữ nhật, xếp thành dãy xuyên tâm. Gỗ 2 chiếm tâm. Mạch gỗ 2 xếp thành dãy, kích thước không đều. Tia tủy hẹp 1-2 dãy tế bào. Gỗ 1 phân bố đều. Libe trong tạo thành đám phân bố đều bên trong gỗ 1.Vi phẫu thân : Gần vuông, 2 cạnh phẳng và 2 cạnh hơi lồi; 4 cánh ngắn. Vùng vỏ: biểu bì gồm một lớp tế bào xếp đều đặn mang lông che chở, cutin dày. Dưới biểu bì là mô dày góc. Tế bào mô mềm vỏ hình bầu dục, xếp không thứ tự theo hướng tiếp tuyến. Ống nhựa mủ rải rác. Nội bì có nhiều hạt tinh bột. Vùng trung trụ : Trụ bì hóa sợi thành đám, vách tế bào sợi vẫn bằng cellulose. Libe 2 và gỗ 2 liên tục thành một vòng. Mạch gỗ 2 tương đối đều đặn. Libe trong thành đám. Tia tủy hẹp 1 hoặc 2 dãy tế bào. Mô mềm tủy hình tròn, kích thước không đều, có tinh thể calci oxalate hình khối. Vi phẫu lá : Gân giữa: Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm một lớp tế bào khá đều, lông che chở và lỗ khí rải rác. Dưới biểu bì trên là mô dày góc, mô mềm gồm những tế bào vách mỏng, kích thước không đều. Bó libe-gỗ chồng kép hình cung gồm những đám libe xếp thành 2 cung bao bọc lấy cung gỗ. Mạch gỗ xếp đều đặn. Phiến: Biểu bì trên và dưới gồm một lớp tế bào, có lông. Lỗ khí nhiều ở biểu bì dưới. Mô mềm giậu gồm một lớp tế bào hẹp, dài, khá đều nhau; mô mềm khuyết tế bào vách mỏng, xếp chừa các khuyết nhỏ. Phân bố, sinh học và sinh thái:  Xuất xứ từ miền Đông Châu Phi được truyền vào nước ta. Nay phát tán hoang dại và cũng được trồng. Cây sinh trưởng tốt trên đất cát vùng biển, phát triển tốt về cả mùa hè. Ra hoa quanh năm, chủ yếu là từ tháng 5-9. Bộ phận dùng:  Toàn cây (Herba Catharanthi rosei). Ở Trung Quốc gọi là Trường xuân hoa. Thành phần hóa học:  Hoạt chất của Dừa cạn là alkaloid có nhân indol trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong lá và rễ. Dừa cạn Việt Nam có tỷ lệ alkaloid toàn phần là 0,1-0,2%. Rễ chứa hoạt chất (0,7-2,4%) nhiều hơn trong thân (0,46%) và lá (0,37-1,15%). Các chất chủ yếu là: vinblastin, vincristin tetrahydroalstonin, prinin, vindolin, catharanthin, vindolinin, ajmalicin, vincosid (1 glucoalkaloid tiền thân để sinh tổng hợp các alkaloid). Từ Dừa cạn, người ta còn chiết được các chất sau: acid pyrocatechic, sắc tố flavonoid (glucozid của quercetol và campferol) và anthocyanic từ thân và lá dừa cạn hoa đỏ. Ngoài ra từ lá chiết được acid ursoloc, từ rễ chiết được cholin. Tác dụng dược lý - Công dụng:  Dừa cạn dùng làm thuốc kiềm tế bào và được chỉ dẫn trong điều trị bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu lympho cấp, một số ung thư. Trong dân gian vẫn dùng trị cao huyết áp, trị bệnh tiểu đường, điều kinh, chữa tiêu hóa kém và chữa lỵ, thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít. Có người trị ung thư máu, ung thư phổi, tẩy giun, chữa sốt, lợi tiểu khá mạnh,.... Thân và lá có tính chất săn da, lọc máu, dùng chữa một số bệnh ngoài da. III.THU NHẬN ALKALOID TỪ NUÔI CẤY INVITRO TẾ BÀO CÂY DỪA CẠN Mô sẹo màu xanh được nuôi trong điều kiện chiếu sáng từ lá dừa cạn in vitro 4 tháng tuổi được chuyển vào 100 ml môi trường cảm ứng trong erlen 250 ml. Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trưởng thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kinhoặc BAP) + 30g/l đường sucrose. Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25± 2oC trong điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày. Cũng làm theo cách tương tự như trên nhưng thay thế nồng độ đường 30g/l bằng các nồng độ đường 40 g/l, 50 g/l, 60 g/l, 70 g/l, 80 g/l và nồng độ hormon tăng trưởng là tối ưu nhất trong thí nghiệm trên. Xác định sinh khối bằng phương pháp cân Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phương pháp của Kutney và cộng sự (1983) Cây dừa cạn ngoài tự nhiên Khử trùng mẫu và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp Cây dừa cạn in vitro Mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng 1000 lux Dịch huyền phù tế bào Sinh khối Định lượng alkaloid Chuyển mô sẹo sang môi trường lỏng để nuôi cấy dịch huyền phù Nuôi cấy trong 28 ngày 1.Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào Nhiều nghiên cứu đã được thử nghiệm trong việc thu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy cho năng suất thu indole alkaloid cao, đặc biệt là vinblastine và vincristine . Phương pháp sản xuất catharanthine và ajmalicine trong dịch huyền phù được nuôi cấy trong bioreactor đã thành công. Moreno và cộng sự (1996) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên những con đường chuyển hóa khác nhau liên quan đến quá trình chuyển hóa hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù tế bào C.roseus. Dịch trích tế bào nấm Phytium aphanidermatum đã được tiệt trùng được dùng trong nghiên cứu này. Những tế bào C.roseus ngay lập tức biến đổi quá trình chuyển hóa của chúng để phản ứng lại tác động của nấm. Zhao và cộng sự (2001) đã thử nghiệm nhiều chất cảm ứng của nấm nhận được từ 12 loại nấm và ảnh hưởng của chúng lên việc cải thiện sản xuất indole alkaloid ở huyền phù tế bào C.roseus. Những kết quả này cho thấy rằng những chất chiết từ nấm khác nhau kích thích tích lũy những indole alkaloid khác nhau, có thể gấp 2 đến 5 lần ở nuôi cấy thường. Zhao và cộng sự (2001) đã tăng sản phẩm catharanthine trong tế bào nuôi cấy C.roseus bằng cách kết hợp chất cảm ứng nuôi trong bình lắc và bioreactor. Tác động tổng hợp lên sự tích lũy alkaloid trong tế bào nuôi cấy đã được theo dõi khi chúng được xử lý với một vài sự kết hợp giữa chất cảm ứng của nấm và hóa chất. Sự kết hợp giữa tetramethyl ammonium bromide và nấm sợi Aspergillum niger đã cho hiệu suất thu ajmalicine cao nhất và cải thiện sự tích lũy catharanthine. Trong khi sự kết hợp giữa chất cảm ứng malate và sodium alginate cho kết quả hiệu suất catharanthine cao nhất và cũng tích lũy ajmalicine cao trong tế bào nuôi cấy. Các tác giả sau đó đã phát triển quy trình này để nâng cao việc sản xuất catharanthine ở tế bào C.roseus nuôi trong bình lắc và bioreactor. Sau 10 ngày nuôi cấy đã thu được catharanthine với hiệu suất theo thứ tự là 25 mg/l, 32mg/l và 22 mg/l trong bình lắc 500 ml, 1,000 ml và bioreactor dạng sục khí 20 lít. Tác giả cũng đã quan sát thấy rằng sự kết hợp giữa việc xử lý malate và alginate kích thích sự phản ứng lại, ví dụ như là sự oxy hóa lipid xảy ra ở hầu hết quá trình nuôi cấy C.roseus và điều này có thể gián tiếp sản xuất indole alkaloid thông qua con đường jasmonate. 2. Nuôi cấy mô sẹo Những mô sẹo có thể là nguồn cung cấp alkaloid chính, phổ biến nhất, cung cấp vật liệu khởi đầu cho sự thiết lập quá trình nuôi cấy huyền phù hoặc cho việc cảm ứng những cơ quan như chồi hoặc rễ. Những khảo sát đầu tiên có liên quan đến sự hình thành của rễ từ mô sẹo C.roseus đã được công bố bởi Dhruva và cộng sự (1977). Việc tái sinh những cây C.roseus khỏe mạnh có thể thực hiện từ những mô sẹo thông qua việc làm lây nhiễm những cây này với mycoplasma-like organisms (MLOs). Mollers và Sarkar (1989) đã làm nhiễm những chỗ cắt ở đốt thân cây C.roseus với 3 loại MLOs khác nhau và nuôi chúng trên môi trường dinh dưỡng MS rắn. Mô sẹo đã được hình thành trên những mô bị nhiễm, rồi được phân vào các cây, sau đó chuyển sang môi trường MS có bổ sung 1-naphthyl acetic acid (NAA) 1.0 mg/l, 6-benzyl aminopurine (BAP) 0.25 mg/l và gentamycin 10.0 ml/l. Những cây này sau đó dễ dàng thích nghi với điều kiện trong nhà kính nơi chúng sẽ được nuôi trong 1 năm. Việc nhuộm màu lá với fluorochoromes DAPI (4’,6- diamidino-2-phenylindole) và berberine sulfate đã chứng minh sự vắng mặt của MLOs trong cây tái sinh. Ramavat và cộng sự (1978) đã mô tả quá trình hình thành chồi non C.roseus từ mô sẹo. Sự tái sinh cây từ những tế bào mô sẹo đơn bội hay lưỡng bội C.roseus cũng đang được kết hợp với việc sử dụng những chất điều hòa sinh trưởng thực vật như kinetin và β-indolylacetic acid (IAA) đã được thực hiện bởi Abou- Mandour và cộng sự (1979). Phương pháp cho tần số cây C.roseus tái sinh cao bằng cách là tạo phôi soma đã được mô tả bởi Kin và cộng sự (1994). Tác giả thu được những mô sẹo từ bao phấn của cây C.roseus sử dụng môi trường MS rắn bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l (MSNK). Những phôi soma được hình thành sau khi chuyển những mô sẹo này vào môi trường MSNK lỏng. Những cây được trồng như vậy sẽ có cùng số nhiễm sắc thể như là cây trồng từ hạt (2n=16). Pietrosiuk và cộng sự (1999) đã thành lập hai dòng mô sẹo C.roseus trắng và xanh (hình 17d, e) trên môi trường Gamborg rắn bổ sung với 0.1 mg/l kinetin và 1.0 mg/l IAA. Mô sẹo được lấy từ những đoạn trụ dưới lá mầm của cây C.roseus giống. Dòng mô sẹo trắng đã được chọn từ những mô xanh phát triển trong pha tĩnh. Trái ngược với sự rắn chắc của dòng mô sẹo màu xanh, dòng màu trắng lại mịn và mềm. Phương pháp HPLC đã phân tích các chất chiết từ mô sẹo của cả hai dòng mô sẹo xanh và mô sẹo trắng chỉ cho thấy các indole alkaloid tồn tại ở dạng vết nhưng không có dược tính. 3. Nuôi hạt nhân tạo Krueger và cộng sự (1982) đã tạo ra được cây có lá nuôi cấy từ hạt C.roseus nảy mầm vô trùng trên môi trường Murashige và Skoogs Revised Tobacco (MS RT) có bổ sung benzyladenine (BA), với đặc điểm là nhân giống nhanh chóng và sản xuất được các alkaloid như vindoline, ajmalicine, sitsiriline, tetrahydroalstonine và serpentine. Quá trình nuôi cấy cho thấy sự phát triển và sản xuất vindole nhanh chóng và rất nhiều hỗn hợp alkaloid khác, bao gồm cả những alkaloid không được tìm thấy ở cây nguyên vẹn. Miura và cộng sự (1988) đã cô lập đựơc vinblastine từ những chồi non C.roseus nuôi cấy được lấy từ những cây con nảy mầm từ hạt. Lượng vinblastine thu đựơc là 15µg/g chất khô và cao hơn trong mô sẹo (Miura et al. 1987). Kết quả này cho thấy rằng là sự sản xuất vinblastine thì liên quan đến sự hình thành chồi. 4. Nuôi cấy mô phân sinh Sự nhân giống cây từ những mô phân sinh hiện nay là một phương pháp hữu ích để sản xuất nhanh sinh khối phục vụ cho y học. Nó cho phép khả năng tái tạo một kiểu gen ổn định và không thay đổi. Alen và cộng sự (1995) đã đề xướng việc nhân giống in vitro C.roseus bằng cách nuôi dưỡng mô phân sinh ngọn và chồi nách từ những cây được nuôi trong nhà kính. Các tác giả đã sử dụng môi trường MS cơ bản có bổ sung BA và 2,4-D ở nồng độ thấp. Những chồi nách này sẽ hình thành chồi ngọn sau 4-5 tuần nuôi cấy. Một phần những cành đã nhân giống được chuyển vào nuôi cấy tiếp trong môi trường tự do. Sau đó chúng được cắt và cho tạo rễ in vitro trong môi trường MS được bổ sung với NAA và phát triển trong nhà kính với độ ẩm tương đối 100%. Trong cả 2 trường hợp đều thành công. Furmanowa và cộng sự (1991, 1994) đã thành công trong việc áp dụng phương pháp này cho sự nhân giống cây C.roseus. Tác giả đã tái sinh những cây con từ chồi ngọn và chồi nách. Những chồi ngọn đã được cắt từ những cây con 7 ngày tuổi và nuôi trong môi trường rắn Nitsch và Nitsch (NN) (Nitsch và Nitsch 1969) được bổ sung thêm kinetin, bezyladenine, indole-3-butyric acid (IBA) và IAA kết hợp với nhau. Sau 2 tháng nuôi cấy những cây con có rễ được cắt và chuyển vào môi trường mới. Những cây này phải gồm có chồi ngọn hoặc chồi nách. Khoảng 200 cây con đang mọc rễ (hình 17a, b) đã được thu từ một cây con. Sau đó chúng sẽ phát triển trong nhà mái vòng bằng nhựa và trong nhà kính (hình1c). Sau 5 tháng sinh trưởng chúng được thu nhận, sấy và cân. Việc phân tích thành phần hóa học của lá được thực hiện. Vindoline và catharanthine chiếm ưu thế trong giai đoạn còn non của cây (trước khi ra hoa). Hàm lượng alkaloid tổng trong lá của những cây được nuôi cấy in vitro rồi mới chuyển sang môi trường đất thì cao hơn những cây trồng chỉ trong đất. 5. Nuôi cấy rễ tơ Trong những năm gần đây, phương pháp nuôi cấy rễ, chủ yếu là rễ tơ của C.roseus đã tăng lên đáng kể hơn cả mong đợi, như là một nguồn tiềm năng của những hợp chất có giá trị chữa bệnh này. Sự phát triển của kỹ thuật vi nhân giống cây và phương pháp để mở rộng việc nuôi cấy rễ in vitro là rất quan trọng và có thể trở thành giải pháp quan trọng để giải quyết việc thu nhận indole alkaloid từ nguyên liệu thô. Những yếu tố di truyền của rễ tơ, thu được bằng sự nhiễm với Agrobacterium rhizogenes, sản xuất hợp chất thứ cấp nhiều hơn là những cây tự nhiên. Hàm lượng alkaloid trong rễ tơ có thể tương đương hoặc cao hơn khi đối chiếu với hàm lượng đo được trong nghiên cứu ở rễ tự nhiên. Những alkaloid chiếm ưu thế trong rễ tơ là ajmalicine, serpentine, vidoline và catharanthine, được tìm thấy với hàm lượng cao hơn trong rễ tự nhiên. 6. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng -Phytohormone (hormone thựcvật) rất quan trọng cho sự tăng trưởng và phân chia hình thái của mô, dẫn đến sự hình thành và phát triển của chồi C.roseus, và cũng làm đa dạng hóa các alkaloid và làm tăng hàm lượng của chúng(Hirata và cộng sự (1994)) -Tất cả chồi non nuôi cấy của C.roseus được cảm ứng hoàn toàn với tần số cao từ những hạt nảy mầm trên môi trường Murashige và Skoog (MS) (Murashige và Skoog 1962) được bổ sung thêm BA 1.1 mg/l (Hirata và cộng sự 1987). -Khi chuyển quá trình nuôi cấy vào môi trường không có BA đã kích thích sự phát triển của chồi non và dẫn đến sự gia tăng sản xuất vindoline và catharanthine đồng thời với việc ức chế sản xuất ajmalicine. -Những chồi được nuôi trong môi trường MS có bổ sung IAA ở nồng độ cao và BA ở nồng độ thấp, đã tích lũy một lượng lớn ajmalicine. Với IAA ở nồng độ thấp và BA ở nồng độ cao thì chồi sẽ giải phóng nhiều ajmalicine vào môi trường. Quá trình sản xuất ajmalicine từ chồi nuôi cấy thì không tương quan với tốc độ tăng trưởng. Vinblastine và vincristine thì không hiện diện trong chồi nuôi cấy.( Satdive và cộng sự (2003)_ -Điều kiện nuôi cấy mô sẹo rất quan trọng cho việc sản xuất alkaloid. Morris (1986) đã thiết lập quá trình nuôi cấy mô sẹo từ lá của những cây C.roseus sử dụng 3 loại môi trường: môi trường Gamborg (B5), môi trường MS và Zenk với những thay đổi khác nhau (B5 với 2,4-D 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; B5 với IAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l; MS với NAA1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l, môi trường Zenk bổ sung IAA 0.175 mg/l và BAP 1,125 mg/l, và chỉ một mình NAA, 2,4-D và zeatin 1.0 mg/l). Các tác giả cũng thử tiến hành nuôi cấy trong 2 điều kiện sáng và tối. Các mô sẹo hình thành có đặc trưng về màu sắc, hình thái và hàm lượng alkaloid. Bốn loại alkaloid: catharanthine, vindoline, ajmalicine và serpentine đã có mặt trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có bổ sung IAA và BAP. Serpentine là alkaloid chính tích lũy trong điều kiện sáng và ajmalicine tích lũy trong điều kiện tối. Miura và cộng sự (1987) đã cô lập vinblastine từ mô sẹo C.roseus hình thành từ những đoạn lá non. Môi trường MS có bổ sung NAA 1.0 mg/l và kinetin 0.1 mg/l đã được sử dụng. Các mô sẹo đã được nuôi cấy trong môi trường tối. Sự hiện diện của vinblastine trong mô sẹo của những rễ khác nhau đã được xác định bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) và phép đo phổ khối lượng. Lượng vinblastine (1µg/g chất khô), thấp hơn so với cây mẹ. Marfori và Alejar (1993) đã cho thấy khả năng sản xuất alkaloid của những mô sẹo có nguồn gốc từ rễ, thân, lá và hoa của hai giống C.roseus, trắng và hồng tím. Các tác giả đã thu được tám dòng mô sẹo bằng cách sử dụng môi trường LS bổ sung BA 3.0 mg/l, 2,4-D 0.5 mg/l và nước dừa. Sau khi các mô được hình thành thì được chuyển vào môi trường LS không có chất điều hòa sinh trưởng và được nuôi trồng trong 1 năm. Hàm lượng alkaloid cao nhất là trong cây màu hồng tím và trong mô sẹo có nguồn gốc từ rễ Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối Môi trường NAA (mg/lít ) BAP (mg/lít ) KIN (mg/lít ) Trọng lượng tươi (FW) Trọng lượng tươi (DW) K1 1,0 0 0 9.24±0.10 0.36±0.03 K2 1,0 0 0,10 9.34±0.08 0.47± 0.07 K3 1,0 0 0,25 10.59±0.2 0.66±0.13 K4 1,0 0 0,50 11.47±0.48 0.76±0.06 K5 1,0 0 1,00 9.55±0.16 0.61±0.04 K6 1,0 0,10 0 9.26±0.13 0.46±0.09 K7 1,0 0,25 0 10.58±0.29 0.58±0.09 K8 1,0 0,50 0 11.59± 0.27 0.78±0.09 K9 1,0 1,00 0 9.50±0.16 0.64±0.05 Ở bảng trên cho thấy môi trường chỉ bổ sung NAA có sự tạo sinh khối thấp hơn so với môi trường bổ sung NAA kết hợp với Kin. Môi trường K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l) + BAP (0.5 mg/l) cho sinh khối tươi và khô đều cao hơn các môi trường khác. Như vậy, theo cách bố trí của thí nghiệm này thì sự kết hợp với nồng độ cytokinin tăng dần từ 0,1 – 0,5 mg/l làm lượng sinh khối tăng tỉ lệ thuận theo. Nuôi dịch huyền phù tế bào trong môi trường MS có các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau. Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ các chất điều hòa tăng trưởng khác nhau đến sự tạo s