Đề tài Thu nhận inulinase

nulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 23 Inulin là nguồn carbon tốt nhất để sản xuất inulinase từ K. marxianus YS-1. Những nguồn carbon khác thì cho hiệu suất sản xuất inulinase thấp khi sử dụng cô lập, và khi sử dụng tinh bột là nguồn carbon thì hoat tính inulinase hoàn toàn không có (hình 9a). Hiệu quả của từng nguồn cacbon (1%, w / v) kết hợp với Inulin ở nồng độ 0,1% và% 0,5 (w / v) đã được nghiên cứu (hình 9b). Có sự gia tăng đáng kể trong hoạt tính của enzyme khi sử dụng kết hợp. Inulin với từng nguồn carbon như trên. Vì vậy, có thể kết luận rằng inulinase là enzyme cảm ứng trên cơ chất cảm ứng là inulin. Người ta thấy rằng inulin là cơ chất cảm ứng cho quá trình sản xuất inulinase, trong khi sự nuôi cấy của vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon khác ức chế quá trình sản xuất enzyme này. Và điều này có thể là do những nguồn carbon này kìm hãm sinh tổng hợp inulinase enzym . b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Khả năng sản xuất inulinase dưới ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau: chất chiết thịt> chất chiết thịt bò> peptone>chất chiết men > ammonium clorua > Ammonium sulfate> dịch bắp> ammonium nitrat> Natri nitrat> urê (hình 10). Hoạt tính tối đa của inulinase đạt được là 6,5 IU / ml khi sử dụng chất chiết thịt. Hoạt tính inulinase cũng khá cao khi sử dụng peptone và chất chiết thịt bò. Những nguồn nitơ hữu cơ tốt hơn so với các nguồn nitơ vô cơ. Chất chiết thịt được xem là nguồn nitơ tốt nhất cho việc sản xuất inulinase từ Chrysosporium pannorum (Xiao et al. 1988). Chất chiết thịt heo sau chất chiết thịt bò đã được sử dụng là nguồ nitơ tốt để tổng hợp từ inulinase từ Kluyveromyces sp. Y-85 (Wenling et al, 1998b.). Do đó, chất chiết thịt là nguồn nitơ thích hợp nhất cho sản xuất inulinase, và được chọn cho những nghiên cứu sau này. Để xác định nồng độ tối ưu của các chất chiết thịt, người tat thay đổi nồng độ của nó từ 0.5-5.0%, w/v được sử dụng trong môi trường. Khi nồng độ của chất chiết thịt đạt đến 2% (w/v) thì hoạt tính enzyme cực đại (12.1 IU/ml) và nếu nồng độ vượt qua 2% có sự giảm hoạt tính enzyme. Điều này có thể là do bản chất phức tạp của nguồn nitơ và ở nồng độ cao một vài thành phần của nó có thể gây độc cho quá trình sản xuất inulinase Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 24 Hình 11 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ đến hoạt tính của enzyme c. Ảnh hưởng của các nguyên tố vết Bảng 3: chỉ ra sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme. Chỉ có Mn 2+ (0.1 mM) và Ca 2+ (0.5 mM) nâng cao hoạt tính của inulinase trong khi Mg2+, Cu2+, Zn2+, Co 2+ , K + , BO3 3- và MoO4 2- không có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp inulinase. Tuy nhiên, nếu nồng độ của những nguyên tố này cao hơn sẽ tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp inulinase. Fe 2+ và Ni 2+ làm giảm khả năng tạo inulinase. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 25 Bảng 3 Sự ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính của enzyme d. Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt Trong số những chất hoạt động bề mặt được sử dụng, chỉ có SDS nâng cao khả năng sản xuất inulinase (hình 11). Những nghiên cứu trước cho thấy chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến khả năng thẩm thấu của màng tế bào ((Tukmachev et al., 1977). Để tối ưu nồng độ của SDS, người ta thay đổi nồng độ SDS từ 0.05–2.5 mM trong môi trường. Khi nồng độ của SDS tăng đến 0.1 mM thì hoạt tính inulinase cực đại là 21.5 IU/ml. Khi nồng độ SDS cao hơn 0.1 mM thì nó có khả năng hòa tan màng protein và phospholipids, từ đó giết chết tế bào nấm men. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 26 Hình 12 Ảnh hưởng của chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính của inulinase e. Ảnh hưởng của tuổi và tỉ lệ giống cấy Hoạt tính enzyme đạt tối đa 24,8 IU/ml khi sử dụng canh trường giống 12h tuổi. Hoạt tính enzyme thấp hơn với canh trường giống dưới 12h tuổi. Điều này có thể do canh trường giống chưa vào giai đoạn sinh trưởng. Sử dụng canh trường giống này, hoạt tính inulinase tăng cực đại (24.8 IU/ml) khi tỉ lệ giống cấy là 5%(v/v). Nếu tỉ lệ giống cấy thấp, lượng sinh khối nấm men sinh ra có thể không đủ để tận dụng hết nguồn cơ chất. Tuy nhiên, hàm lượng vi sinh vật cao, độ nhớt của môi trường thể lên men dẫn đến sự mất cân bằng dinh dưỡng trong môi trường. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 27 f. Hiệu quả việc kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường Hiệu quả của việc dử dụng kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường lên men được thể hiện ở bảng sau: Bảng 4 Sự kết hợp các thành phần tối ưu của môi trường Từ bảng trên, cho thấy rằng sự kết hợp các thành phần đã được tối ưu: inulin 1.5%, chất chiết thịt 2%, CaCl2 0.5mM, và SDS 0.1mM sẽ cho hoạt tính enzyme cực đại 24.7 IU.ml. g. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ Kết quả cho thấy rằng hoạt tính enzyme cực đại là 24.5 IU/ml khi tăng pH của môi trường lên 6.5. Ở pH 4.0 và 8.0 , hoạt tính enzyme rất thấp: tương ứng với pH 8 hoạt tính enzyme là 4.2 IU/ml. Khoảng pH 6.4 – 6.6 tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp inulinase từ K. marxianus (Gupta et al., 1994). Năng suất cực đại cũng đạt được bởi K. marxianus ở pH 6.5 bởi (Kalil et al., 2005; Silva-Santisteban and Filho, 2005). Hoạt tính inulinase tối đa 24.3 IU/ml ở 30oC, nếu nhiệt độ vượt quá nhiệt độ này thì hoạt tính enzyme sẽ giảm đáng kể. Nói chung nhiệt đô ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào. h. Ảnh hưởng của sự khuấy trộn Tác động khuấy trộn có ảnh hưởng mạnh đến quá trình sinh tổng hợp inulinase. Hoạt tính enzyme tăng đáng kể 28.1 IU/ml khi tốc độ khuấy trộn là 150rpm so với điều kiện không khuấy trộn 5.9 IU/ml. Nếu tốc độ khuấy trộn vượt quá 150 rpm thì hoạt tính enzyme giảm. Tốc độ khuấy trộn không chỉ ảnh hưởng đến lượng oxy, mà còn ảnh hướng đến những chất dinh dưỡng khác trong môi trường. Khi tốc độ khuấy trộn cao hơn, hoạt tính enzyme sẽ thấp do sự ảnh hưởng của ứng suất trượt lên tế bào nấm men cũng như cấu trúc tế bào enzyme. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 28 i. Ảnh hưởng của thời gian lên men Hoạt tính enzyme đạt 30.8 IU/ml khi thời gian lên men là 72h, và sau đó sẽ giảm. Điều này cho thấy rằng sự sinh tổng hợp inulinase từ K. marxianus liên quan đến sự sinh trưởng của tế bào và đạt đến giá trị tối ưu (Al-Dagal and Bazaraa, 1998). Hoạt tính enzyme sẽ giảm sau 72 lên men do sự giảm của chất dinh dưỡng trong môi trường, hoặc do phản ứng dị hóa của enzyme. 7. Tinh sạch 7.1. Ly tâm lần 1 - Mục đích: Tách sinh khối vi sinh vật - Các biến đổi: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch. Hóa lý: Độ nhớt giảm, huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. Vi sinh: Hàm lượng vi sinh vật giảm. - Thiết bị: Sử dụng các cơn lốc ly tâm để tách riêng các phần tử rắn và lỏng có tỷ trọng khác nhau. Hình 13 Thiết bị ly tâm lắng - Nguyên tắc hoạt động: Cấu tạo: gồm một máy ly tâm nằm ngang có sức chứa lớn,quay khoảng 10000rpm, lực ly tâm lớn làm cho các pha tách ra khỏi nhau nhờ vào tỉ trọng khác nhau của chúng. Khi máy hoạt động, hỗn hợp huyền phù được nạp theo ống nạp liệu vào khoang trong của vít tải rồi qua cửa tháo vào bên trong rotor. Dưới tác động của lực li tâm, huyền phù được Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 29 phân chia và các tiểu phần của pha rắn được lắng trên tường của rotor. Chất lỏng trong chảy vào cửa rót, tràn qua ngưỡng rót và được tháo ra khỏi rotor. - Thông số công nghệ: Tốc độ ly tâm 10000rpm. Nhiệt độ 40C Thời gian 20 phút. Hiệu suất thu hồi 100% Độ tinh sạch 1 Hoạt tính riêng 9.4 IU/mg Tổng lượng protein 185.0 mg Tổng hoạt độ 1750 IU 7.2. Kết tủa - Mục đích: Khai thác: Tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô, thu protein dưới dạng kết tủa. Chuẩn bị: Chuẩn bị cho quá trình sấy thu nhận sản phẩm. - Các biến đổi: Vật lý: Nhiệt độ giảm. Hóa lý: Sự kết tủa và tách pha. Enzyme chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn. Hóa học: Hàm lượng enzyme hòa tan trong dung dịch giảm. Vi sinh: vi sinh vật bị tiêu diệt hoặc ức chế. Vi sinh vật nổi lên trên bề mặt . - Phương pháp thực hiện: Dịch enzyme thô thu được sau quá trình ly tâm lắng tách sinh khối và tạp chất rắn sẽ được thêm vào môi trường dung dịch (NH4)2SO4 bão hòa 80% theo tỉ lệ giữa thể tích môi trường và thể tích chất làm kết tủa là 1:5. Trong quá trình thêm vào, hỗn hợp được khuấy với tốc độ 1000rpm. Quá trình trên nhằm mục đích đưa (NH4)2SO4 bão hòa vào để tăng nhanh hiệu suất quá trình kết tủa tách protein ra khỏi dung dịch enzyme thô. - Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ dung dịch enzyme ban đầu càng loãng thì enzyme càng khó kết tủa và ngược lại. Lượng muối hòa tan bổ xung càng nhiều thì khả năng kết tủa enzyme càng cao nhưng nếu quá cao thì khả năng kết tủa giảm. - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 30 Hình 14 Thiết bị kết tủa Một cách tổng quát, thiết bị kết tủa gồm các bộ phận chủ yếu sau: thùng hình trụ với đáy tròn hoặc nón. Theo đường tâm của thiết bị lắp trục khuấy với cánh khuấy. Trục khuấy xuyên qua nắp và được bít kín bởi hộp đệm phía trên nắp. Truyền chuyển động cho trục khuấy từ động cơ cánh khuấy qua hộp giảm tốc độ để tạo tốc độ thích hợp cho cánh khuấy. Thực hiện nhập liệu qua các cửa phần trên của thiết bị còn tháo sản phẩm qua đường dưới đáy thiết bị. Trên nắp và thân thiết bị, người ta bố trí cửa sửa chửa và cửa quan sát. - Thông số công nghệ: Nhiệt độ 40C Muối: (NH4)2SO4 bão hòa 80% Thời gian 30 phút Tổng lượng protein 35.0 mg Tổng hoạt độ 850 IU Hoạt độ riêng 38 IU/mg Độ tinh sạch 2.5 Hiệu suất thu hồi 48.5% 7.3. Ly tâm lần 2 - Mục đích: Thu nhận kết tủa. - Các biến đổi: Vật lý: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch. Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng - Các yếu tố ảnh hưởng : Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 31 Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn – lỏng: chênh lệch nhiều thì quá trình phân riêng sẽ dễ dàng hơn. Tốc độ quay của roto: Tốc độ quay càng nhanh thì quá trình ly tâm càng thuận lợi. - Thiết bị: Giống ly tâm lần 1. - Thông số kỹ thuật: Tốc độ quay 10000rpm Thời gian 10 phút Nhiệt độ 40C 7.4. Hòa tan kết tủa - Mục đích: Chuẩn bị cho quá trình thẩm tách. - Các biến đổi: Hóa lý: Enzyme chuyển từ dạng rắn sang dạng lỏng. Hóa học: Nồng độ dung dịch enzyme giảm do mất các chất hòa tan. - Các yếu tố ảnh hưởng: Lượng dung dịch đệm càng nhiều thì khả năng hòa tan càng cao nhưng gây khó khăn trong quá trình lọc gel. Chêng lệch pH của dung dịch đệm và pI của enzyme càng cao thì hòa tan càng tốt - Thiết bị: Dạng thiết dạng hình trụ có cánh khuấy. - Thông số công nghệ: Dung dịch đệm: Citrate-phosphate . pH 6.0 Trong dung dịch thu được, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử khác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác nhau. 7.5. Thẩm tách - Mục đích: Hoàn thiện: Loại bỏ phần muối sau quá trình kết tủa còn dư ra khỏi enzyme, tách các tạp chất có kích thước nhỏ. - Các biến đổi: Hóa lý: Huyền phù tách ra thành 2 pha rắn - lỏng, tách các cấu tử hòa tan và các chất có kích thước rất nhỏ cỡ vi sinh vật.. Các đại phân tử bị giữ lại. Vật lý: Nhiệt độ tăng, có sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng của dung dịch. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 32 Hóa học: Thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn – lỏng. - Các yếu tố ảnh hưởng : Kích thước các tạp chất rất nhỏ: Nếu quá nhỏ, lưu lượng qua lỗ thấp, dễ gây bít lỗ màng, giảm hiệu suất quá trình thẩm tách. Nhiệt độ: Các quá trình tinh sạch, thu nhận enzyme đều thực hiện ở nhiệt độ thấp (40C ) nên các chất hòa tan, các chất kích thước nhỏ chuyển động chậm, giảm hiệu suất thẩm tách, chúng tự chui qua lỗ màng. Vì thế tốn thời gian. - Phương pháp thực hiện: Cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất. Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn. Để giảm thời gian thẩm tách, tăng hiệu suất quá trình, người ta thường tạo ái lực trong thiết bị thẩm tách. Hình 15 Cơ chế thẩm tách - Thông số công nghệ: Nhiệt độ 40C Dung dịch Nước cất 7.6. Trao đổi ion - Mục đích: Khai thác: Thu nhận enzyme Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 33 Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm. - Biến đổi: Vật lý: lực hút tĩnh điện giữa các hạt tích điện dương trong cột và các ion âm trong dịchlên men. Hóa học: Nồng độ các chất hòa tan tích điện dương giảm đáng kể - Phương pháp thực hiện:  Nguyên lý của phương pháp: Phương pháp sắc ký trao đổi ion có thể coi là 1 dạng đặc biệt của sắc ký hấp phụ mà trong đó các cấu tử mang điện có khả năng tương tác tĩnh điện 1 cách thuận nghịch với pha tĩnh là các hạt nhựa mang điện trái dấu, còn pha động là các dung dịch điện ly.  Quy trình thực hiện gồm 4 bước: Bước 1: Nhồi hạt nhựa trao đổi ion vào cột . Bước 2: Đưa các mẫu vào cột . Bước 3: Các thành phần của mẫu có thể tích điện dương, âm hay trung hòa về điện, khi đi qua cột chỉ có phần tử mang điện trái dấu mới kết hợp với hạt nhựa, các phần tử khác do không bị giữ lại bởi pha tĩnh sẽ rời khỏi cột, trong đó có enzyme inulinase cần thu nhận. Bước 4: Tái sinh cột. Do enzyme inulinse tích điện âm nên ta dùng thiết bị trao đổi anionit .Các ion âm sẽ bị giữ lại trên cột, ngoài ra còn có các ion âm khác như ion acetate , ion photphate,... Các ion dương và các chất không mang điện trong dung dịch sẽ đi ra khỏi cột. Các ion âm có ái lực khác nhau với pha tĩnh (hạt nhựa) v à pha động (chất rửa giải) nên các cấu tử sẽ phân bố khác nhau giữa pha tĩnh và pha động và được pha động lôi cuốn ra khỏi cột với vận tốc khác nhau. Ta sử dụng dung dịch rửa giải là NaCl để lôi cuốn ion âm ra khỏi cột. - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 34 Hình 16 Cơ chế sắc ký trao đổi ion Hình 17 Thiết bị trao đổi ion Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 35 - Thông số công nghệ: Nhựa trao đổi anion DEAE-Sephacel (2.5 x 30 cm) Dung dịch đệm 50 mM tris (pH 8.0) Tốc độ rửa giải khoảng 0.4 ml/phút Tổng lượng protein 4.2 mg Tổng hoạt độ 160 IU Hoạt độ riêng 38 IU/mg Độ tinh sạch 4 Hiệu suất thu hồi 9.1% - Các yếu tố ảnh hưởng: Pha tĩnh: Phụ thuộc vào tính chọn lọc của nhựa trao đổi ion  Tính chọn lọc cao: Các peak thu được tách rời nhau ra .  Tính chọn lọc thấp: Các peak thu được không hoàn toàn tách rời.  Đối với nhựa trao đổi anion: ion F – bị giữ lại ít nhất. Pha động: Phụ thuộc bản chất ion đối (ion thuộc pha động) và nồng độ của nó. Dung dịch đệm:  Đối với các chất lưỡng tính có khả năng tích điện ở pH khác nhau, pH lớn hơn pI thì phân tử tích điện âm và ngược lại.  Do đó cần lựa chọn pH dung dịch đệm thích hợp. 7.7. Sắc ký ái lực - Mục đích: Khai thác: Thu nhận enzyme Hoàn thiện: Tách tạp chất khỏi sản phẩm, thu enzyme với độ tinh sạch cao. - Các biến đổi: Hóa học: Xuất hiện liên kết ái lực giữa inulinase với các hạt ConA-CL Agarose. Tăng nồng độ enzyme trong dung dịch. - Phương pháp thực hiện: Dịch enzyme thu được sau quá trình trao đổi ion được bơm vào thiết bị sắc ký ái lực nhằm thu được enzyme inulinase với độ tinh sạch cao nhất. Những protein không hấp thu trên cột sẽ tách ra ngoài với dung dịch đệm tương tự. Trong khi đó, các protein bị hấp thu trên cột được tách ra bởi quá trình rửa giải từng bậc bằng methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5 M) trong dung dịch đệm 25 mM citrate ( pH 6.0 ) - Thiết bị: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 36 Hình 18 Cơ chế sắc ký ái lực - Thông số công nghê: Sắc ký ái lực: cột có kích thước 2.0 x 2.8 cm với ConA-CL Agarose. Dung dịch đệm: 25 mM citrate (pH 6.0) Dung dịch rửa giải: methyl- -D-mannopyranoside (0–0.5 M) Tổng lượng protein: 0.5 mg Tổng hoạt độ: 85 IU Hoạt độ riêng: 170 IU/mg Độ tinh sạch: 18.0 Hiệu suất thu hồi: 4.8% 8. Sấy - Mục đích: Bảo quản (do sau quá trình sấy phun độ ẩm sản phẩm bé hơn 5%),tạo sản phẩm dạng bột mịn. - Các biến đổi: Vật lý: Có sự giảm về khối lượng do nước bay hơi, nhiệt độ tăng. Hóa lý : Sự bay hơi nước và các chất dễ bay hơi dưới tác động của nhiệt độ cao. Có sự chuyển pha: dung dịch enzyme sau quá trình sấy phun sẽ có dạng bột. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 37 Hoá sinh: Inulinase có thể bị vô hoạt hoặc giảm hoạt tính bởi nhiệt độ nên có thể sẽ làm giảm các phản ứng do enzym xúc tác. Tuy nhiên thời gian lưu trong buồng sấy là rất ngắn nên ảnh hưởng không đáng kể đến hoạt tính enzyme. Sinh học: Tiêu diệt vi sinh vật. - Phương pháp thực hiện: Dịch dextran sau khi ly tâm được bơm vào máy sấy phun trong điều kiện chân không để sấy ở 300C và thu được dextran ở dạng bột. Lượng dextran tạo thành được tính toán theo hàm lượng chất khô. - Thiết bị: Hình 19 Máy sấy phun chân không 2 giai đoạn. Với hệ thống này, độ ẩm bột sản phẩm từ buồng sấy phun được hiệu chỉnh cao hơn 2 – 5% so với giá trị độ ẩm cuối cùng. Phần ẩm còn lại cần tách sẽ được bốc hơi tiếp trong thiết bị sấy tầng sôi. Với hệ thống này giai đoạn 1 là sấy phun bình thường, giai đoạn 2 là sấy tầng sôi. Tuy phải tiêu tốn thêm một phần năng lượng cho sấy tầng sôi nhưng nhờ sấy tầng sôi nên hạt sản phẩm sau quá trình sấy đạt kích thước cần thiết, nghĩa là quá trình sấ y tầng sôi tương đương với quá trình tạo hạt, do đó tiết kiệm chi phí thiết bị so với hệ thống sấy phun 1 giai đoạn và hệ thống sấy thăng hoa. - Thông số công nghệ: Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 38 Nhiệt độ 1500C Thời gian lưu của các hạt trong buồng sấy 5s Độ ẩm sản phẩm 3 – 4% IV. SẢN PHẨM  Sản phẩm dạng bột Hoạt tính riêng 40000 IU/mg Màu sắc Bột màu trắng Mùi Không có mùi lạ pHopt 5.5 topt 55 o C Tổn thất do sấy <5% Samonella Không phát hiện E.coli Không phát hiện Tổng số vi sinh vật hiếu khí <3000 cfu/G V. THÀNH TỰ CÔNG NGHỆ 1. Sản xuất inulinse bằng phương pháp lên men bề mặt sử dụng Response surface methodology ( RSM )  Theo truyền thống, người ta sản xuất inulinase theo phương pháp lên men bề sâu.. Gần đây, có nhiều bài nghiên cứu khoa học sản xuất inulinase theo phương pháp lên men bề mặt. Phương pháp lên men bề mặt (SSF) có những thuận lợi hơn phương pháp lên men bề sâu là: năng suất cao, kĩ thuật đơn giản, ít chi phí đầu tư, năng lượng cần ít, và cần ít nước thu hồi sản phẩm tốt hơn và phù hợp với các nước đang phát triển. SSF là tiềm năng lớn trong sản xuất enzyme và gần đây nó được ứng dụng nhiều trong sản xuất enzyme.  Mô hình tối ưu các thành phần của môi trường là một khía cạnh rất quan trọng trong việc phát triển quá trình SSF. Kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê là một công cụ hữu ích cho việc lựa chọn thành phần của môi trường lên men, vì nó cung cấp mô hình thống kê giúp ta hiểu được các tương tác giữa các thông số của quá trình ỡ những mức độ khác nhau và có thể tính toán được mức tối ưu cho từng thông số cho mục đích đưa ra, ví dụ như sản xuất enzyme với hiệu suất tối đa. Ứng dụng của kĩ thuật mô hình thực nghiệm thống kê trong việc phát triển quá trình lên men có thể dẫn đến cải thiện hiệu suất thu nhận sản phẩm, giảm sự biến đổi của quá trình, giảm thời gian và giá tổng cộng của quá trình. Response surface methodology( RSM) là một mô hình bao gồm kĩ thuật toán học và thống kê, được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiều biến số và tìm ra điều kiện tối ưu cho một hệ đa Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 39 biến. Ứng dụng thành công của RSM trong nâng cao năng suất sản xuất enzyme bằng việc tối ưu hóa môi trường đã được nghiên cứu. Nói cách khác nghiên cứu xem xét tối ưu hóa môi trường lên men bề mặt để sản xuất inulinase vẫn cón khá mới. Sau đây là nghiên cứu sản xuất inulinase từ giống mới, Kluyveromyces S120. RMS được đưa ra ở đây như là công cụ để tối ưu hóa môi trường lên men bề mặt.  Vi sinh vật sử dụng : Kluyveromyces S120 được phân lập từ đất, được giữ trên, môi trường thạch nghiêng với môi trường tương ứng (g/l): Glucose 20 Chất chiết nấm men 10 Pepton 10 Agar 20.  Lên men bề mặt Môi trường lên men chứa (g/l): Chất chiết nấm men 10 Pepton 20 Inulin 10. 20g cám lúa mì 3.0 mg MgSO4.H2O 9.0 mg FeSO4.6H2O tính trên 100g cơ chất khô được chỉnh 2.5 mg ZnSO4.7H2O 3.5 mg CaCl2 pH 6.0 Hàm ẩm 65% Môi trường được chứa trong bình nón 250ml và được bịt kín bằng bông không thấm nước. Sau đó đem bình nón đi tiệt trùng ở 1210C trong vòng 20 phút. Sau khi tiệt trùng, bình nón được làm nguội, sau đó bổ sung 4% giống vào bình , trộn đều nhưng vẫn đảm bảo được môi trường vẫn vô trùng. Sau đó được ủ trong buồng vói hàm ẩm 80%, nhiệt độ 300C trong vòng 72h. Bằng việc sử dụng mô hình Plackett-Burman và mô hình của Box-Behnken để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên quá trình sản xuất inulinase, thành phần của môi trường thay đổi dựa trên mô hình thực nghiệm.  Nghiên cứu các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Plackett-Burman Mô hình Plackett-Burman một kĩ thuật hiệu quả để tối ưu hóa thành phần của môi trường, được sử dụng để lựa chọn các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase và những nhân tố nào không quan trọng sẽ được loại ra nhằm thu hẹp các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình và dễ dàng điều khiển các nhân tố còn lại. Cám lúa mì được bán trên thị trường được sử dụng làm cơ chất rắn. Các thành phần bổ sung được điều chỉnh bằng mô hình Plackett-Burman cho 8 biến số ở hai mức độ. Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 40  Tối ưu hóa các thành phần bổ sung sử dụng mô hình Box- Behnken Một khi các nhân tố được xác định qua màn hình, mô hình Box-Behnken cho 3 biến số độc lập, mỗi biến số ở 3 mức độ với 3 bản sao ở những điểm trung tâm, được sử dụng để phù hợp với một mô hình đa thức: Trong đó Y - hiệu suất tạo inulinase, 0 - hệ số chặn, 1 2 3, , - hệ số tuyến tính, 12 13 23, , - hệ số tương tác, 11 22 33, , - hệ số bậc hai và X1, X2, X3 - các biến số đã độc lập được mã hóa. Gói SAS được sử dụng cho thiết kế thực nghiệm và phân tích hồi quy các dữ liệu đạt được.  Hoạt tính enzyme Hoạt tính của enzyme được xác định bằng cách xác định hàm lượng đường khử được tạo ra trong quá trình thủy phân sucrose. 0.5 ml dịch chiết enzyme đã pha loãng phù hợp được trộn với dung dịch sucrose ( 2%, w/w ) trong dung dịch đệm acetate 0.1M, pH 4.8. Phản ứng được thực hiện ở 500C trong 10 phút, sau đó đun sôi 10 phút. Xác định lượng đường fructose trong hỗn hợp phản ứng bằng phương pháp DNS. Đường cong hiệu chỉnh được chuẩn bị với dịch fructose đã biết nồng độ và mẫu trắng được thực hiện đồng thời với enzyme và cơ chất. Một đơn vị hoạt tính của inulinase được định nghĩa là lượng enzyme cần để sản xuất ra 1 mol fructose dưới điều kiện đã nêu trên.  Đếm Kluyvermyces Vất chất lên men được trộn đầy dủ với 10 thể tích nước vô trùng. Hỗn hợp được pha loãng đến nồng độ thích hợp trong điều khiện vô trùng. 0.1 ml hỗn hợp đã pha loãng được trải đều trên môi trường chất chiết malt. Sau khi ủ trong 48h ở 300C, số khuẩn lạc CFU/g được đếm theo hệ số pha loãng . Kết quả  Sàng lọc các nhân tố ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase Dựa trên những nghiên cứu gần đây, ảnh hưởng của tổng 8 thành phần khác nhau lên sản xuất inulinase được phân tích trên cơ sở sử dụng mô hình Plackett – Burman ( bảng 5). Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trang 41 Bảng 5 Các thành phần của môi trường dựa trên mô hình Plackett –Burman Trong mẫu thực nghiệm, từng hàng đại diện cho một thí nghiệm, và từng cột đại diện cho một biến số độc lập. Dấu (+) và (-) đại diện cho hai mức khác nhau ( cao và thấp) của biến số độc lập. Hiệu suất sản xuất inulinase, xác định cho từng thí nghiệm, được trình bày ở bảng 6. Việc phân tích các biến số (ANOVA) cho mô hình thực nghiệm được tính toán, và mức độ quan trọng của từng biến số môi trường lên men được quyết định bởi giá trị t như bảng 7. Kết quả phân tích chỉ ra rằng inulin, dịch bắp và (NH4)2SO4 có ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất inulinase. Tất cả các biến số không quan tr