Đề tài Thu nhận probiotic và ứng dụng trong các sản phẩm từ sữa

tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Kháng thể là các globulin trong máu của động vật, có khả năng liên kết đặt hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó, hay còn gọi là kháng thể miễn dịch hoặc kháng thể đặc hiệu. Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh. IgA được tổng hợp chủ yếu nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiên chức năng chống vi khuẩn trên bề mặt niêm mạc ruột. Các vi khuẩn có làm tăng hệ miễn dịch bằng cách: Tăng cường chức năng chống virus của hệ miễn dịch. Tăng hoạt động của tế bào NK ( natural killer) nhằm diệt trực tiếp tế bào bị nhiễm khuẩn bằng cách tiết những chất độc để phân giải chúng hoặc bằng cách tiết IFN – gamma ( một loại ctokine). Tăng S-IgA, sinh cytokine, điều khiển đáp ứng miễn dịch tế bào Sinh nitric oxide NO, có vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền thông tin ở hệ thần kinh và đặc biệt có tác dụng làm thư giãn. Tăng khả năng đề kháng chống lại một số quá trình tự miễn. Giảm đáp ứng trung gian IgE (IgE-mediated responses) Gián tiếp chống lại hiện tượng radiation-included depression in white blood cells: đây là hiện tượng các tế bào bạch cầu bị ức chế và tiêu diệt khi chiếu xạ. Hiện tượng này thường xảy ra trong khi điều trị bệnh ung thư bằng chiếu xạ. Ngăn chặn ung thư Cơ chế chung: Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư. Giảm hoạt tính của các enzyme ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm móng gây ung thư. Kích thích hệ thống miễn dịch, ngăn chặn sự tạo thành khối u. Đa số ung thư ở người liên quan đến thói quen ăn uống. Một số chủng của vi khuẩn lactic (L.bulgaricus, S.thermophilus hay L.acidophilus và Bifidobacteria) sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến. Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung thư (ß-gulucoronidase, azoreductase, nitroreductase và ß-glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết. Bifidobacteria ngăn chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và non – enzymatic. Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocyclic amines (các chất gây ung thư trong quá trình nấu thịt) sau đó được bài tiết theo phân. Chống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục – chống nấm Candida: Bình thường việc viêm nhiễm đường sinh dục là do sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử trùng, hormones, và các yếu tố khác. Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong quá trình giành chỗ cư trú và ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh. Một số chủng thuộc Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển và bám chặt của nấm Candida albicans và các chủng Candida khác. Việc sử dụng Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nấm trở lại, giảm nhiễm nấm âm đạo. Ngoài ra một số chủng Lactobacillus GR-1 và RC-14 ngăn chặn sự nhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra. THU NHẬN PROBIOTIC CÁC CHỈ TIÊU ĐỂ CHỌN MỘT VI SINH VẬT LÀM PROBIOTIC Về mặt sản xuất Có thể phát triển nhanh chóng với số lượng lớn trong điều kiện lên men đơn giản và rẻ. Có thể tồn tại và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc vi hiếu khí Có thể sống sót qua quá trình ly tâm, lọc, đông lạnh hoặc sấy lạnh mà không mất số lượng đáng kể. Có khả năng hoạt hóa nhanh sau khi được sử dụng. Có thể sống sót dưới những điều kiện biến đổi khác nhau trong chế biến thực phẩm bao gồm cả các quá trình nhiệt độ cao trên 450C cũng như chịu đựng được nồng độ ethanol và sodium cloride cao. Khả năng sống sót trong ruột Khả năng chịu được các dịch tiêu hoá Acid dạ dày và muối mật ảnh hưởng mạnh đến sự sống sót của vi sinh vật. Các chủng có khả năng phát triển và thực hiện quá trình trao đổi chất dưới sự có mặt của lượng mật sinh lý (lượng mật bình thường trong cơ thể người) thì có khả năng sống sót tốt hơn trong suốt quá trình ở trong đường ruột. Khả năng cư trú trong ruột Khi các vi khuẩn có lợi có khả năng bám chặt vào các tế bào bên trong đường ruột, chúng mới có khả năng cư trú tạm thời khoảng một thời gian trong hệ thống ruột. Những chỗ cư trú gần các mô bào và màng nhầy khá giàu chất dinh dưỡng, đối với một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột thì khả năng bám chặt được xem là điều kiện trước hết đối với việc xâm chiếm và lây nhiễm. Đặc tính riêng Có khả năng sử dụng prebiotic (oligosaccharides, inulin, tinh bột) để phát triển. Khả năng tổng hợp hay sử dụng vitamine (Nhóm B, folate, vitamin K) Có khả năng ngăn chặn các mầm bệnh: Samonella typhimurium, Clostridium perfringens,  Clostridium difficile, Escherichia coli, Candida albicans… Có hoạt tính beta – galactosidase Có khả năng tổng hợp acid, hydrogen peroxide, các bacteriocin Khả năng sinh D-lactic acid Có thể sử dụng kết hợp với các vi sinh vật khác Tính an toàn Không gây độc, không ảnh hưởng xấu đến sức khỏe Kiểm tra bằng liều gây chết trên động vật KHỬ NƯỚC (Anhydrobiotics) Kỹ thuật sấy Sự khử nước thường sử dụng với ý nghĩa làm ổn định probiotic, thuận lợi cho vấn đề bảo quản, mua bán, vận chuyển. Freeze – drying được sử dụng phổ biến cho quá trình khử nước ở canh trường probiotic và sản sản phẩm từ sữa, trong khi đó sấy phun chỉ được ứng dụng cho vài quá trình khử nước ở canh trường probiotic. Freeze – drying Freeze – drying đã được sử dụng để sản xuất probitic dạng bột qua nhiều thập niên, dựa trên cơ sở của sự thăng hoa, xảy ra ba giai đoạn: freezing, primary và secondary drying. Tế bào được làm lạnh ở –1960C, sau đó sấy thăng hoa dưới áp suất chân không (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2007). Do điều kiện nhẹ nhàng hơn spray – drying nên tỷ lệ sống sót của probiotic cao hơn trong freeze-dried powders Trong quá trình làm lạnh tế bào sẽ bị vô hoạt (Tsvetkov & Brankova, 1983). To và Etzel (1997) đã chứng minh rằng 60 – 70% tế bào sống sót qua bước làm lạnh sẽ vượt qua được giai đoạn dehydrate hóa. Trong suốt quá trình làm lạnh, sự hình thành lớp băng ngoài tế bào làm tăng hơn áp suất thẩm thấu và tế bào bắt đầu mất nước. Nồng độ dung dịch nội bào và ngoại bào sẽ tăng lên khi nhiệt độ giảm dưới điểm eutectic. Có hai cách thức làm lạnh là làm lạnh chậm và làm lạnh nhanh. Làm lạnh chậm, quá trình khử nước tế bào diễn ra từ từ khi sự đóng băng xảy ra chậm ngoài tế bào ảnh hưởng lớn đến tế bào Làm lạnh nhanh có thể tránh ảnh hưởng đến chất tan và sự co tế bào quá mức (Fowler & Toner, 2005). Các báo cáo cũng chỉ ra rằng diện tích màng tế bào càng lớn thì càng nguy hiểm hơn khi hình thành tinh thể băng bên ngoài tế bào trong quá trình làm lạnh (Fonseca, Beal, & Corrieu, 2000). Do đó, kích thước tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tồn tại probiotic trong freeze – drying, với tế bào hình cầu có kích thước nhỏ chống chịu freezing và freeze-drying tốt hơn tế bào hình que có kích thước lớn hơn (Fonseca et al., 2000). Nước mất đi từ tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy sẽ gây hư hại bề mặt protein, thành tế bào, màng tế bào. Nước tại bề mặt có vai trò quan trọng trong việc tạo ổn định cấu trúc và nguyên vẹn các chức năng của đại phân tử vi sinh. Do đó, nước mất đi trong sấy khô có thể làm mất sự ổn định cấu trúc, tính toàn vẹn các thành phần tế bào làm giảm hoặc mất đi các chức năng (Brennan, Wanismail, Johnson, & Ray, 1986). Người ta dự đoán rằng trong quá trình sấy vị trí các phân tử lipid trên màng tế bào là nơi chịu ảnh hưởng lớn nhất do các phân tử lipid rất dễ bị oxy hóa. Thêm vào đó, cấu trúc của RNA và DNA mất ổn định, dẫn tới giảm hiệu quả sự sao chép của DNA, phiên mã, giải mã. Vì thế, để đạt được kết quả tốt nhất trong việc làm khô probiotic, phải tập trung chú ý đến phương pháp để giảm đến mức tối thiểu hư hại thành phần tế bào. Sản phẩm thương mại từ canh trường freeze-dried là kết quả của quá trình tốn kém nhiều chi phí nhưng thu lợi thấp. Sấy phun Quá trình sấy phun đòi hỏi sự phun với tốc độ cao tại nhiệt độ trên 2000C, mà sau đó luồng hơi xuyên qua bộ phận tạo thành dạng bột. Do đó kết quả của quá trình này dễ nhận thấy rằng: trong môi trường sấy ở nhiệt độ cao với thời gian ngắn, nó có thể bất lợi tế bào vi khuẩn sống. Trong quá trình sấy phun, tế bào vi khuẩn chịu tác dụng của nhiệt, sự mất nước, áp suất thẩm thấu,... (Brennan et al., 1986; Teixeira, Castro, Mohacsi-Farkas, & Kirby, 1997). Sấy phun có thể làm màng tế bào bị biến đổi, và có thể làm lọt vài thành phần nội bào từ tế bào ra môi trường xung quanh (Teixeira, Castro, & Kirby, 1995a). Màng tế bào chất là phần nhạy cảm nhất trong tế bào vi khuẩn khi sấy phun, trong khi đó thành tế bào, DNA và ARN cũng dễ bị ảnh hưởng, giảm hoạt động trao đổi chất. Việc mất đi các liên kết hydro với nước, làm gia tăng liên kết nội phân tử các nhóm phospholipid và xúc tiến các liên kết đóng vòng. Thành phần lipid có thể bị chuyển từ trạng thái lamellar (màng mỏng) sang trạng thái gel phase (khối bán rắn), có thể xem như là sự dehydrate lamellar phase trong đó các chuỗi trở nên cứng và mở rộng hoàn. Hơn nữa, các phân tử phospholipid sẽ có sự biến đổi lớn từ dạng lamellar sang dạng hexagonal phase ngay khi nước mất đi (Crowe et al., 1988; Leslie, Israeli, Lighthart, Crowe, & Crowe, 1995). Vài nghiên cứu cho rằng vài giống probiotic trong sấy phun, tỉ lệ sống sót phụ thuộc vào chủng vi khuẩn được sử dụng, nhiệt độ ra và môi trường sấy. Sử dụng giống Lactobacillus paracasei NFBC 338 chịu được rifampicin có thể đạt được tỉ lệ sống sót hơn 80% ở quá trình sấy phun trong RSM (Reconstituted Skim Milk), với nhiệt độ ra từ 85 – 900C (Gardiner et al., 2002), trong khi đó ở cùng điều kiện (nhiệt độ ra 850C) Ananta and Knorr (2003) cho rằng loài L. rhamnosus GG tỉ lệ sống sót khoảng 60%. Nghiên cứu cho thấy các loài vi khuẩn khác nhau biến đổi khác nhau với điều kiện quá trình sấy phun, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chọn giống, như L. paracasei NFBC 338 tồn tại tốt hơn L. salivarius UCC 118 trong cùng điều kiện sấy phun (Gardiner et al., 2000), có thể cho là sức chịu đựng giống L. paracasei NFBC 338 tốt hơn khi so sánh với L. salivarius UCC 118 (Gardiner et al., 2000). Nhiệt và sức chịu đựng khí oxy của vài loài Bifidobacterium liên quan đến việc tuyển chọn chủng vi khuẩn sử dụng sấy phun được so sánh, tìm ra loài tốt nhất, đáng chú ý Bifidobacterium animalis subsp. Lactis có thể tồn tại hơn 70% trong quá trình sấy phun với RSM (20% w/v) với nhiệt độ ra khoảng 85-900C (Simpson, Stanton, Fitzgerald, & Ross, 2005). Trong sấy phun, nhiệt độ dòng khí ra là một thông số quan trọng, ảnh hưởng đến sự sống sót của vi khuẩn. Kim and Bhowmik (1990) cho rằng số lượng vi khuẩn Streptococcus salivarius subsp. thermophilus và L. debrueckii subsp. Bulgaricus ngày càng giảm dần khi nhiệt độ dòng khí vào, ra tăng lên và phun dưới áp suất cao; trong bản báo cáo của Gardiner et al., 2000 với hai loài L. paracasei NFBC 338 and L. salivarius UCC 118 cũng giống nhận xét trên. Do đó việc cải thiện khả năng tồn tại của vi khuẩn rất quan trọng bằng cách giảm nhiệt độ ra trong quá trình sấy phun, nhưng không vượt quá khả năng tồn tại của probiotic, chất lượng phụ thuộc vào các thông số, độ ẩm 3-5% hay sử dụng để sản phẩm ổn định (Zayed & Roos, 2004). Hình 1 Tương quan nhiệt độ ra và tỉ lệ sống sót của vi sinh vật trong sấy phun Protectant (Chất bảo vệ) Chất bảo vệ ở những dạng khác nhau được thêm vào trước khi freeze-drying hoặc sấy phun để bảo vệ probiotic trong quá trình khử nước, bao gồm skim milk powder, whey protein, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose, lactose và polymers như dextran and polyethylene glycol (Hubalek, 2003; Morgan, Herman, White, & Vesey, 2006). Các cryoprotectants thích hợp được thêm vào môi trường trước khi lên men làm tăng sự thích nghi của probiotic với điều kiện xung quanh (Capela, Hay, & Shah, 2006). Vì các cryoprotectants thích hợp tích lũy trong tế bào và sự thẩm thấu giữa môi trường trong và ngoài tế bào giảm xuống (Kets, Teunissen, & de Bont, 1996a). Sử dụng gum acacia trong môi trường sấy phun, kết quả nâng cao khả năng sống sót probiotic L. paracasei NFBC 338; khi phát triển trong hỗn hợp RSM (10% w/v) và gum acacia (10% w/v) trước khi sấy phun với nhiệt độ dòng khí ra 100 – 105oC thì khả năng sống sót tăng 10 lần so với tế bào kiểm tra (20% RSM) (Desmond, Ross, O’Callaghan, Fitzgerald, & Stanton, 2002). RSM là môi trường thích hợp để việc sấy phun canh trường probiotic hiệu quả (Ananta,Volkert, & Knorr, 2005). Protein trong sữa nguyên kem có thể bảo vệ tế bào khỏi tổn thương các thành phần của màng tế bào (Castro, Teixeira, & Kirby, 1995). Cách thức là phủ lớp protein ngoài thành tế bào, cùng với đó calci trong sữa làm tăng khả năng sống sót vi khuẩn sau khi khử nước (King & Su, 1993). Theo Corcoran et al. (2004) cho rằng khi có mặt của prebiotics polydextrose và inulin trong môi trường sấy phun (RSM) không nâng cao khả năng tồn tại vi khuẩn hoặc bảo quản. Khả năng sống sót của L. helveticus trong quá trình sấy phun được cải thiện bằng cách thêm 1% sorbitol (Santivarangkna, Kulozik, & Foerst, 2006). Các nghiên cứu chứng minh rằng carbohydrates có thể bảo vệ hiệu quả vi khuẩn probiotic trong suốt quá trình freeze-drying, Nghiên cứu chỉ ra rằng các cryprotectants có thể tạo ra các lớp glass-phase có nhiệt độ trung gian và do đó các tế bào có thể sống sót dựa trên glass-phase mà không có sự kết tinh đá trong nội bào (Fowler & Toner, 2005). Nó cũng giải thích rằng trehalose là một cryoprotectant có hiệu quả trong quá trình freezing and freeze-drying, có thể nâng cao khả năng sống sót của L. acidophilus (Conrad, Miller, Cielenski, & de Pablo, 2000), nhờ khả năng tạo high glass transition temperature (Tg) của trehalose, và tương tác mạnh mẽ ion lưỡng cực và liên kết hydro, giữa trehalose và biomolecule (Patist & Zoerb, 2005). Trong nghiên cứu gần đây nhất trong phòng thí nghiệm, đã so sánh hiệu quả bảo vệ của một loạt các disaccharides với khả năng tồn tại của vi khuẩn L. rhamnosus GG trong quá trình freeze-drying và bảo quản, và đã tìm thấy trehalose, trehalose/lactose and lactose/ maltose hầu hết các disaccharides có hiệu quả trong cả hai quá trình freezing and freeze-drying (chưa công bố). Các chất tan đã được chứng minh có lợi cho probiotic, hiệu quả trong môi trường acid. Ví dụ, sự hiện diện của 19.4 mMol glucose kết quả tăng lên 6log10 khả năng tồn tại vi khuẩn sau 90 phút bằng mô hình giống dịch ruột với pH 2.0 so sánh với control (Corcoran, Stanton, Fitzgerald, & Ross, 2005). Trong công trình nghiên cứu này, sự hiện diện của glucose do kết quả sự cung cấp ATP theo đường thủy giải F0F1-ATPase, có thể ngăn chặn proton vào tế bào và vì thế làm tăng khả năng sống sót vi khuẩn trong điều kiện mô hình dạ dày. Chức năng sinh lý của tế bào. Tầm quan trọng các hoạt động của tế bào đối với sự thành công trong việc sấy probiotic đã được chứng minh ở trên, khía cạnh này vài nhân tố được đề xuất là có hiệu quả đối với khả năng tồn tại của probiotic trong quá trình khử nước, như stress treatment, sự phát triển các pha của canh trường probiotic trước khi khử nước, growth media và sự biến đổi gen. Application of mild stress prior to dehydration (Sự ứng dụng tác nhân nhẹ trước khi khử nước) Sử dụng các yếu tố stress dưới mức gây chết nhằm nâng cao khả năng đáp lại stress trước khi khử nước đã được chứng minh là một phương pháp khả thi, bảo đảm có hiệu quả với canh trường vi sinh vật và duy trì các hoạt động sinh lý trong suốt quá trình khử nước (de Urraza & de Antoni, 1997; Desmond et al., 2002; Kim, Khunajakr, & Dunn, 1998; Lorca & de Valdez, 1998; Teixeira et al., 1995a). Nó cũng giải thích là vi khuẩn phản ứng lại để thay đổi môi trường xung quanh bằng cách biến đổi quá trình trao đổi chất nhằm nâng cao sức đề kháng (Pichereau, Hartke, & Auffray, 2000). Sức đề kháng mã hóa bằng hệ thống bảo vệ có thể chia ra thành hai cấp Loại đầu tiên gồm có một hệ thống đặc biệt để cảm ứng giới hạn tối đa bởi các yếu tố stress hóa học hoặc vật lý (như heat shock), cho phép các phần tử sống sót thay đổi liều lượng gây chết khi gặp cùng tác nhân (Desmond, Stanton, Fitzgerald, Collins, & Ross, 2001; Gouesbet, Jan, & Boyaval, 2001; Pichereau et al., 2000). Loại đề kháng thứ hai bao gồm nhiều hệ thống chuẩn bị cho tế bào chịu đựng các yếu tố thay đổi khác nhau của môi trường mà không cần đã trãi qua quá trình chuẩn bị trước (Desmond et al., 2001; Gouesbet et al., 2001; Pichereau et al., 2000). Cơ chế này được biết đến như là cross-protection (Kim, Perl, Park, Tandianus, & Dunn, 2001). Thực tế là sự thích nghi trước (pre-adaptation) với nhiệt hoặc dung dịch muối để cải thiện sức chịu đựng nhiệt của probiotic trong quá trình sấy phun. Ví dụ, L. paracasei NFBC 338, thích nghi trước bằng cách thêm 0.3M NaCl, thì có ý nghĩa đặc biệt với sức chống chịu tác nhân nhiệt khi sấy phun (nhiệt độ dòng ra giữa 95-100oC) hơn tế bào kiểm chứng không làm thích nghi trước (33.46 ± 2.3% so với 8.27 ± 4.42% sống sót, theo thứ tự) (Desmond et al., 2001). Mặc dù không hiệu quả bằng homologous stress, mức độ crossprotection theo thứ tự heat ~ salt > hydrogen peroxide > bile (Stanton et al., 2002). Growth phase Sự phát triển canh trường vi khuẩn thể hiện ở 4 pha: lag, log, stationary (ổn định) và death phases (suy vong). Sự phản ứng lại các tác nhân của canh trường vi khuẩn biến đổi phụ thuộc vào pha phát triển. Thật vậy, vi khuẩn đang ở trong stationary phase tăng khả năng chống cự tác nhân và chịu được nhiều kiểu tác nhân khác nhau, hơn vi khuẩn trong pha log, vì thiếu carbon và tình trạng kiệt quệ nguồn thức ăn gây ra sự phản ứng lại các tác nhân để tế bào sống sót (Brashears & Gilliland, 1995; Lorca & de Valdez, 1999; Morgan et al., 2006; van de Guchte et al., 2002). Vì thế pha phát triển tối ưu cho sự tồn tại vi khuẩn qua việc khử nước là stationary phase. Tỷ lệ số lượng tế bào vi khuẩn L. rhamnosus ở pha stationary phục hồi là cao nhất sau quá trình sấy (31-50% sống sót), trong khi đó tế bào vi khuẩn pha log chỉ 14% sống sót, và pha lag cao nhất đạt được chỉ 2% tế bào sống sót đưới cùng điều kiện sấy (Corcoran et al., 2004). Tuy nhiên theo những nghiên cứu mới đây, trong freeze-drying vi khuẩn acid lactic, thường sử dụng các tế bào cuối pha log (Champagne, Mondou, Raymond, & Roy, 1996) hoặc đầu pha ổn định (Carvalho et al., 2004a;Wang et al., 2004; Zayed & Roos, 2004). Theo nguồn khác Saarela et al. (2004) cho rằng không có sự khác nhau về mức độ ổn định giữa freeze – drying và bảo quản của tế bào B. animalis subsp. lactis phát triển ở cuối pha log (15 h) hay đầu pha ổn định (22 h). Thú vị là Carvalho et al. (2003a) cho rằng sự thiếu dinh dưỡng trong stationary phase của canh trường L. bulgaricus lại cải thiện sức đề kháng trong quá trình bảo quản dưới dạng khô. pH của môi trường phát triển của canh trường probiotic cũng ảnh hưởng sự sống sót trong quá trình sấy khô. Tỉ lệ sống sót cao nhất (khoảng 80%) đạt được trong freeze-drying khi tế bào L. reuteri phát triển ở pH=5, và được thu hoạch sau 2.5h ở stationary phase (Palmfeldt & Hahn-Hagerdal, 2000). Hơn nữa, tế bào thu được ở điều kiện pH không điều chỉnh (4.5) có sức chịu đựng tác nhân nhiệt, sấy phun, bảo quản dạng khô tốt hơn so ở điều kiện pH đã điều chỉnh (6.5) (Silva et al., 2005). Hiện tượng này có thể có liên quan đến sự thích nghi môi trường acid, có thể biến đổi chức năng tế bào để nâng cao việc tổng hợp heat shock protein, từ đó cải thiện sức chịu đựng quá trình sấy như mô tả ở trên. Silva et al. (2005) thừa nhận rằng sức đề kháng cao hơn với vi khuẩn L. delbrueckii subsp. bulgaricu khi phát triển dưới điều kiện pH không điều chỉnh có liên quan đến việc tạo ra heat shock protein. Tuy nhiên, Linders et al. (1997a) cho rằng điều chỉnh pH trong suốt quá trình phát triển vi khuẩn L. plantarum kết quả vi khuẩn hoạt động còn lại cao hơn sau khi sấy (37% survival) so với điều kiện phát triển không điều chỉnh pH (19% survival). Growth media( Môi trường phát triển) Thành phần môi trường phát triển là một nhân tố góp phần tăng tỷ lệ tồn tại canh trường probiotic trong quá trình sấy, ở khía cạnh này tầm quan trọng của sự hiện diện carbonhydrate đã được chứng minh. Ví dụ, sự phát triển của L. delbrueckii subsp. Bulgaricus với sự có mặt đường như lactose, sucrose và trehalose hoặc cryoprotectants hóa học như glycerol để tế bào có thể thích nghi với áp suất thấm thấu của quá trình đông lạnh, hoặc làm tan (Panoff, Thammavongs, & Gueguen, 2000). Tỉ lệ sống sót của L. sakei sau khi sấy phun được nâng lên, khi tế bào phát triển có sự hiện diện của sucrose (Ferreira et al., 2005). Tymczyszyn, Gomez-Zavaglia, and Disalvo (2007) cho rằng có sự khác nhau hiệu quả phục hồi giữa lactose, sucrose and trehalose của L. delbrueckii subsp. Bulgaricus sau khi sấy, khi phát triển ở hoạt độ nước khác nhau. Người ta đã được chứng minh rằng bảo quản vi khuẩn đã khử nước với sucrose, sau khi phát triển chúng ở môi trường có hoạt độ nước thấp (MRSsucrose) có hiệu quả bằng với sự khử nước có trehalose. Lý do cho điều này là tế bào vi khuẩn thích nghi với môi trường có hoạt độ nước thấp. Khả năng sống sót giảm bớt thấp nhất sau khi freeze-drying thu được khi L. bulgaricus phát triển trong môi trường có sự hiện diện của mannose, so với fructose, lactose hay glucose (Carvalho et al., 2003b; Carvalho et al., 2004a). Các loại đường khác như fructose, sorbitol cũng được thêm bảo vệ tốt hơn glucose, môi trường phát triển chuẩn có carbohydrate (Carvalho et al., 2004a). Cơ chế bảo vệ của đường trong môi trường phát triển có khả năng là sự phát triển trong chất nền các loại đường khác nhau tạo ra tế bào với các đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau, vì vậy mang lại sức kháng cự khác nhau với các tác nhân khác nhau (thus reflecting distinct resistances to the various stress treatments tested (Carvalho et al., 2004b). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chất chuyển hóa như mannitol, sorbitol and glutamate còn trong tế bào chịu trách nhiệm hoạt động tồn tại riêng biệt trong quá trình khử nước (Wisselink, Weusthuis, Eggink, Hugenholtz, & Grobben, 2002), và sự hình thành những chất chuyển hóa này phụ thuộc vào nguồn carbon trong môi trường phát triển (Kets, Galinski, de Wit, de Bont, & Heipieper, 1996b). Vài tác nhân khác, bao gồm sự hiện diện của sodium chloride trong môi trường phát triển và sự cô đặc môi trường cũng tác động đến sự sống sót của probiotic sau quá trình khử nước. Linders et al. (1997a) chứng minh rằng sự có mặt của 1mol hoặc 1.25mol NaCl trong quá trình phát triển của L. plantarum giảm bớt độ hoạt động còn lại sau khi sấy tầng sôi (decreased residual activity after drying in the fluidized bed) Hoạt độ nước còn lại sau khi sấy thường cao hơn cho tế bào phát triển trong MRS loãng với tế bào phát triển trong MRS cao. Tuy nhiên ảnh hưởng không đáng kể. VI BAO Nguyên liệu và phương pháp Microencapsulated bacteria Bifidobacterium lactis (Bb-12, Chr. Hansen, Denmark) đã được bao bọc thành công trong các vi bao (microcapsules) với 1ml của bead slurry chứa khoảng 108 cfu. Trước khi bao bọc, vi khuẩn đã được cấy trong nước thịt MRS (Oxoid Inc., Nepean, ON, Canada) thêm L-cysteine đã khử trùng 0.5g/L (Sigma,Oakville, ON, Canada) tại 370C trong 24h. Môi trường dự trữ đã được kiểm soát tinh khiết và duy trì trên MRS agar với cysteine 0.5g/L ủ trong điều kiện kị khí sử dụng hệ thống GasPak Plus (gas generator envelopes and anaerobic jars) từ BBL (Fisher Scientific, Nepean, ON). Tế bào để bao bọc được thu bằng ly tâm 3000 x g trong 10 phút tại 50C, rửa với dung dịch đệm phosphate đẳng trương (PBS, 0.01M NaH2PO4, 0.137M NaCl, 2.68mM KCl, pH 7.0, Fisher Scientific), và chứa lại trong peptone saline (dung dịch muối đẳng trương) (PS, 8.5 gL_1 NaCl, 1.0 gL_1 peptone (Difco, Fisher Scientific), pH 7.0). Hàm lượng tế bào đã rửa được đếm sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường kị khí tại 370C. Tế bào sau khi rửa được đem đi vi bao (microencapsulation). Sự sản xuất calcium alginate microcapsules Calcium alginate microcapsules được tạo có hoặc không có B. lactis Bb-12 sử dụng kỹ thuật đông lại bên ngoài (external gelation technique) theo Sheu and Marshall (1993) và được mô tả bởi Hansen et al. (2002). Trong thời gian ngắn calcium alginate microcapsules với đường kính trung bình 20µm được tạo ra bằng trộn 18g alginate solution (10g/L, môi trường có tính nhớt và high mannuronic acid, A2033, Sigma, Oakville ON), với 1g washed bacteria suspension hoặc 1g PS. Hỗn hợp trên chuyển thành thể sữa trong 100g dầu thực vật chứa 5g/L Tween 80 (P8074, Sigma), sử dụng thìa khuấy có từ tính đặt chế độ 300rpm trong 20 phút. Sự đông đặc bắt đầu khi thêm 32ml Ca2+, hệ nhũ tương bao gồm 60g dầu thực vật, 5g/L Eween 80 và 62.5mMol CaCl2. Alginate microcapsules thành hình trong quá trình khuấy 20 phút. 40 ml PS+ CaCl2 (0.05M) đã được thêm vào và the alginate microcapsules được tách bằng phễu. Hỗn hợp lỏng được điều chỉnh theo tỉ lệ 1:1 (v/v) giữa alginate microcapsules và lipid Phân tích cấu trúc mẫu vi bao Bước tiếp theo được kết hợp trong giai đoạn chuẩn bị mẫu để có được số lượng vi bao lớn nhất để có thể được quan sát bằng kính hiển vi. Để bảo đảm quan sát thấy được tập hợp các đặc trưng, polylysine hydrobromide được dùng như một xúc tác gắn kết, để duy trì lượng vi bao ở dạng thể nền, và phủ l