Đề tài Thu nhận và ứng dụng phức hệ enzym pectinase và celulase

Enzim là chất xúc tác sinh học khơng chỉ cĩ ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng,sinh sản của mọi sinh vật mà nĩ cịn đĩng vai trị rất quan trọng trong cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong cơng nghệ gen và trong bảo vệ mơi trường.Cĩ rất nhiều phức hệ enzim.Ta sẽ nghiên cứu 2 phức hệ cellulase và pectinase. Pectinase Pectinase là hệ enzym có tác dụng lên pectin dạng hoà tan, làm giải phóng nhóm metoxy (CH3O-) và phần polysaccarit còn lại được gọi là axit pectic (hay polygalacturonic). I-PECTIN: (thuộc nhóm chất xơ hoà tan ) Một đoạn phân tử pectin Pectin là polysaccarit có nhiều trong quả ,củ, hoặc thân cây . Ở thực vật ,pectin tồn tại dưới hai dạng :dạng protopectin không tan và dạng pectin hoà tan . +Tên gọi pectin dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoá 100% +Axit pectinic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic metyl hoáthấp hơn 100% + Axit pectic dùng để chỉ chuỗi polygalacturonic hoàn toàn không chứa nhóm metyl Tuy nhiên trong thực tiễn thì pectin đựoc dùng chỉ cả pectin va axit pectinic. Protoprectin không tan: chủ yếu ở thành tế bào, kết hợp với polysaccharide araban. Pectin hoà tan: chủ yếu ở dịch bào. Pectin hoà tan là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galaturonic, trong đó một số gốc acid có chứa nhóm thế methoxy Dạng không tan có thể chuyển hoá thành pectin hoà tan trong môi trường acid, ở nhiệt độ sôi, hay khi có mặt enzim protopectinase. II-HỆ ENZYM PECTINASE: Pectinase có trong cả thực vật và vi sinh vật.Ở đây ta chỉ xét việc thu nhận và ứng dụng của pectinase từ vi sinh vật. á Đặc điểm của hệ enzym pectinase ở vi sinh vật : Theo quan điểm hiện đại ,trong phức hệ enzym pectinase có các enzym :pectinesterase;polygalacturonase;protopectinase;transeliminase. 1/.Pectinesterase: (pectase-3.1.1.11) -Enzym này thu đuợc từ canh trường nấm mốc A.niger ở trạng thái đồng thể ,N-axit amin cuối trong phân tử là phenylalanin. -Pectinesterase thuỷ phân liên kết este trong pectin cũng như trong các axít pectic để tạo thành metanol và axít pectinic . pectin + nH2O g CH3OH + axit pectinic - Pectinesterase của nấm mốc thì tham gia thuỷ phân sâu sắc hơn so với pectinesterase thực vật . - Pectinesterase co ùnguồn gốc khác nhau thì có pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu khác nhau . - Các ion Ca2+ ,Na+ ;các clorua của Na ,Ca,K sẽ hoạt hoá pectinesterase ; còn cation hoá trị 3 và 4 thì kìm hãm tác dụng của nó. 2/.Polygalacturonase:(pectinase-3.2.1.15) (tên hệ thống là : polygalacturonitglucanhdrolase ) Dựa vào cơ chế tác dụng có the åchia ra thành : -Endopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase dịch hoá ) : phân cắt liên kết α-1,4 ở phía trong phân tử pectin cũng như phía trong phân tử axit polygalacturonic -Exopolygalacturonase (còn gọi là polygalacturonase đường hoá ) : phân cắt dần dần từng phân tử acid galacturonic một ,bắt đầ từ đầu không khử của mạch . pH tối ưu phụ thuộc vào nguồn thu va cơ chất ; đa số polygalacturonase bền vững ở pH từ 4,0 đến 6,0 ;nhiệt độ tối ưu khoảng 40-50oC và bị vô hoạt ở 55-65oC. Polygalacturonase cũng được hoạt hoá bởi cation kim loai kiềm và NH4+ . 3/Protopectinase: tách araban và galactan ra khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất metyl của axit polygalacturonic (tức là pectin hoà tan ). 4/.Transeliminase: phân huỷ pectin bằng con đường phi thuỷ phân tạo ra đơn phân là galacturonic có chứa nối đôi (4-deoxy-5-xetogalacturonic). Transeliminase có tính đặc hiệu cao nên ngfưòi ta chia nó thành : +endopectintranseliminase +exopectintranseliminase +endopectinc-transeliminase +exopectinic-transeliminase Transeliminase có nguồn gốc khác nhau thì có cơ chế tác dụng và thuộctính khác nhau. III.Ứng dụng: Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinaza dưới dạng tinh khiết. Pectinaza thường được sử dụng trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm sau: Sản xuất rượu vang Sản xuất nước quả và nước uớng khơng rượu Sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả cơ đặc, mứt... Sản xuất nước giải khát Sản xuất cà phê và cà phê hòa tan Trong sản xuất rượu vang,nước quả và các nước uớng khơng rượu dều có thể sử dụng pectinaza mợt cách hiệu quà. Có pectinaza các quá trình ép làm trong và lọc d ịch quả rất dễ dàng làm tăng hiệu xuất của sản phẩm ví dụ dưa pectinaza vào khâu nghiền quả sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép 15-25. Khi có pectin thì khới quả nghiền sẽ có trạng thái keo, do dó khi ép dịch quả khơng thoát ra dược.nhừ pectinaza phân giải các chất pectin di mà dịch quả trong suớt khơng bị vẩn dục và lọc rất dễ dàng. Pectinaza còn góp phần chiết rút dược các chất màu, tanin và những chất hòa tan, làm tăng thêm chất lượng của sản phẩm Trong sản xuất các mặt hàng từ quả nhờ pectinaza có thể thu dược dịch quả có nờng dợ dậm dặc Ví dụ: dịch táo cơ dặc dến 72 dợ Brix, nếu khơng tách các pectin tự nhiên thì sãn phẩm sẽ bị keo tụ mợt cách mạnh mẽ và khơng thể cơ dặc thêm nữa Trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinaza dể tách lớp keo ở trên bề mặt hạt cà phê CELLULASE Cellulase là phức hệ enzym có tác dụng rất quan trong trong việc thuỷ phân cellulose.Đây là enzym thuộc nhóm enzym hydrolase thuờng chỉ thấy ở vi sinh vật . I-CELLULOSE: là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật ; trong bông chiếm khoảng 90% ,còn trong gỗ chiếm hơn 50%.;Hằng năm cellulose do thực vật tởng hợp khoảng 1011 tấn .Sự tạo cellulase chủ yếu do thực vật còn phân huỷ nó thì chủ yếu do vi sinh vật . Cellulose có nhiều hơn tất cả các hợp chất hữu cơ khác của cơ thể sống vì nó là nguyên liệu chính của thành tế bào thực vật, giúp mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Cellulose là chất được trùng hợp từ các đơn phân tử glucose, mạch thẳng được tạo bởi b-D- glucose bằng liên kết b-1,4 glucoside. Cellulose là chất rắn, trắng , không mùi vị, không tan trong nước ngay cả khi đem đun nóng, không tan trong các dung môi hữu cơ thông thường (rượu, ether, benzen). Trong tế bào thành cây xanh, các vi sợi cellulose sắp xếp dưới dạng các lớp xen phủ, như thể tạo nên một cấu trúc rất dai, và chắc. Đôi khi thành tế bào còn được củng cố bằng một nguyên liệu gọi là lignin, chất này chèn vào khoảng không giữa các vi sợi cellulose. Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu đễ làm mềm vải. đuoduLIÊN KẾT b-1,4- GLUCOSIDE VỊ TRÍ TÁCH NƯỚC CỦA LIÊN KẾT b ình 1 – Liên kết b-1,4- glucoside Cellulose không có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng của người vì trong cơ thể người không có enzim phân huỷ được cellulose. Động vật nhai lại có thể tiêu hoá dễ dàng cellulose vì trong dạ dày chúng có chứa các vi khuẩn có khả năng tiết ra enzym cellulase có tác dụng thuỷ phân cellulose. Thành tế bào thực vật Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật. Các đơn vị cấu tạo cellulose gắn với nhau nhờ liên kết glucoside. Trật tự sắp xếp của Fibril, Microfibril và Cellulose trong tế bào thực vật TẾ BÀO THỰC VẬT THÀNH TẾ BÀO Mỗi đơn vị cấu trúc nên cellulose là một anhydride d-glucose. Mỗi gốc glucose chứa ba nhóm – OH ở nguyên tử Carbon thứ hai, thứ ba và thứ sáu (trong đó nhóm – OH đính trên C6 là nhóm rượu bậc I, còn lại là nhóm rượu bậc II) Gốc anhydride d-glucose có vòng 6 cạnh piranose (nhờ 5 nguyên tử C và nguyên tử O) liên kết 1-4 glucoside. Phân tử cellulose chứa từ 1.400 – 10.000 gốc glucose không xoắn mà duỗi thẳng. Phân tử lượng của các cellulose thu được từ các nguồn khác nhau xê dịch trong giới hạn khá rộng (từ 5.104 – 106 hoặc cao hơn) . Chuỗi phân tử Cellulose Dùng phương pháp phân tích tia Rontgen, người ta xác định được phân tử cellulose có dạng sợi. Chuỗi phân tử Cellulose Các dạng sợi của cellulose lại gắn vào nhau nhờ các liên kết hydro tạo nên cấu trúc mixen của cellulose Liên kết Hydro giữa các phân tử Cellulose tạo cấu trúc Micelle các sợi celluose liên kết lại với nhau tạo thành từng bó sợi, các bó sợi lại liên kết với nhau tạo thành đại phân tử cellulose. II-CELLULASE: là phức hệ hydrolase bao gồm từ C1 đến Cx và β-glucozidase , có vai trò là thuỷ phân cellulose thành sản phẩm cuối cùng là glucose. Chế phẩm cellulase Mô hình phân tử cellulase *Cơ chế tác dụng của cellulase như sau: Ở giai đoạn đầu dưới ảnh hưởng của enzym C1 ,những mảnh polyanhydroglucose có kích thước lớn được tách ra khỏi cellulose không hoà tan ban đầu ; sau đó dưói tác dụng của enzym Cx mảnh vừa được tạo thành sẽ bị phân ly thành oligosaccarit cho đến cellobiose .Như vậy , cellulase C1 tác dụng trên cellulose nguyên thủy ,cellulase C2 tácdụng trên cellulose đã biến hình nhưng vẫn không hoà tan ,cellulase Cx tác dụng trên cellodextrin hoà tan hoặc các dẫn xuất hoà tan ,còn cellobiase thì tác dụng trên các disaccaritcellobiose để tạo ra glucose . ×Sơ dồ minh hoạ tổng quát cơ chế tácdụng cùa cellulase: Mô hình cellulase tác dụng lên cơ chất cellulose *Phức hệ cellulase nhiều cấu tử đã được tách ra từ một số loại nấm .Ví dụ :nấm Morythesium verrucaia tạo cellulase sáu cấu tử ;Polyporus versicolor tạo cellulase 4 cấu tử ;… *Tính đặc hiệu của cellulase trên các liên kết glucoside rất rộng rãi :chúng có thể thuỷ phân được xilan (β -1,4);glucomanan(β -1,4);lichenin (β -1,3 va β –1,4);polysaccarit của mật (α-1,2) ;laminarin (β -1,3);lutean(β -1,6) . III. ỨNG DỤNG: Các chế phẩm cellulaza thường được dùng để: Tăng chất lượng các sản phẩm thực phẩm và thức ăn gia súc chúng ta đều biết, celluloza là hợp phần quaon trọng của vỏ tế bào thục vật. các nguyên liệu thực phẩm cĩ nguồn gốc thực vật nếu được gia cơng bằng chế phẩm celluloza sẽ được mềm ra, sẽ ăng hệ số đồng hĩa và nĩi chung chất lượng được tăng lên. O đĩ rất bổ ích khi chuẩn bị các thức ăn đặc hiệu cho trẻ con, cho người ăn kie6g cũng như khi chế biến thức ăn gia súc. Tăng hiệu suất trích ly các chất khác nhau từ nguyê liệu thực vật Protein, acid amin, vitamin từ đậu tương, thạch từ rong, tinh bột từ bã, chất thơm và chất hịa tan khi sản xuất chè xanh và cà phê hịa tan. Chẳng hạn trong sản xuất bia dưới ảnh hưởng của phức hệ enzym xitaza (chủ yếu gồm 4 ezym cellulaza, hemicellulaza, ezym thủy phân chất gơm và ezymcellobiaza,…) thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy khiến cho các ezym proteaza và amilaza tác dụng dễ dàng với protein và tinh bột chứa trong hạt đại mạch. Khi đĩ, lượng đường, dextrin và các chất hịa tan khác tăng lên, tạo điều kiện để để khi gia sau này hình thành nên các phẩm vật cĩ màu và cĩ mùi thơm đặc trưng của malt và bia. Rong biển nếu được gia cơng từ chế phẩm cellulaza thì hiệu suất thạch sẽ được tăng lên. Người ta cũng thấy, do ảnh hưởng của ezym hemicellulaza mà các chất mật, gơm,… vốn khơng bị tác dụng của pectinaza cũng bị phân hủy một cách mạnh mẽ, nên kết quả là ngăn cản được sự gelatin hĩa khi chế biến các loại cà phê cơ đặc Thủy phân gỗ và phế liệu gỗ Các phế liệu này rẻ tiền và cĩ thể dùng chế phẩm cellulaza để thủy phân thành các đường đơn giản cĩ thể chế biến làm thức ăn gia súc ezym cellulaza phổ biến rộng rãi trong các nấm hiển vi và vi khuẩn. Trong đa số trường hợp, người ta thu chế phẩm cellulaza từ canh trường bề mặt của nấm mốc A. oryzae và A. awamori. Nấm mốc A.oryzae Được ứng dụng trong chất tẩy rửa, chủ yếu đễ làm mềm vải. Thu nhận 2 phức hệ enzym pectinaza va cenlulaza: I/Thu nhận pectinase: 1.Nguồn thu nhận: Vi sinh vật tổng hợp pectinase: Nguồn giàu enzym pectinase là nấm mốc nấm men và vi khuẩn. Nấm mốc:penicillium glaucum, P. ehrlichii, P. chrysogenum, P.expanam, P. cilrimim, Aspergillus awamori, A. foetidus, A. niger, A. terrus, A. saitoi, Fusarium moniliforme,… Nấm men: Saccharomyces fragilis Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pentinovorum, Klebsiella aerogenes,… Các lồi vi sinh vật này thường cĩ trong bề mặt tất cả các loại quả, các bộ phận khác của thực vật. khi quả bị hư hỏng hoặc thực vật chết chúng sẽ cùng các lồi VSV khác phá hủy rất nhanh quả và các bộ phận khác của thực vật. Bên cạnh Pectinesterase (PE) VSV, hầu hết các loại cây cho trái đều chứa enzym PE như: cà chua, đậu nành, thịt quả chuối, quả cam, táo… Polygalacturonase thường được tìm thấy trong các phần tiết ngoại bào của các lồi nấm và vi khuẩn gây bệnh. Ví dụ như: Saccharomyces fragilis, aspergillus niger,…PG cịn được tìm thấy ở cà chua 2.Thu nhận: Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV. Cĩ hai phương pháp sản xuất: A/ Thu nhận từ canh trường bề mặt: mơi trường sử dụng để nuơi cấy VSV thường là cám gạo, cám mì, bã củ cải hoặc thĩc mầm. nguồn dinh dưỡng bổ sung thường lá các muối ammonium, phosphoric…độ ẩm mơi trường phải nằm trong khoảng 60 độ C. nấm mốc A. awamori thường được nuơi cấy ở 30 độ C trong thời gian 40 giờ, sau đĩ giảm xuống 24 độ C và nuơ trong 48-52 giờ. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khơ thàng chế phẩm enzym thơ và đem tinh chế. Để thu pectinase tinh khiết thì enzym thơ phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung mơi hữu cơ (etanol 72,5-75% hoặc iso-propanol 55-57%) hay muối amoni sunfat cĩ độ bão hịa 0,79%. Nếu dùng etanol đơ tinh khiết của chế phẩm enzym khoảng 90%, nế dùng muối thì khoảng 75%. Nhiệt độ tối ưu của rượu là 2-5 độ C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ít càng tốt. sau đĩ ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân khơng hay sấy thăng hoa ri62i nghiề nhỏ và đem đi bảo quản. B/Thu nhận từ canh trường bề sâu: a/phương pháp hiếu khí sự tích tụ enzym trong mơi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi mơi trường bị acid hĩa mạnh và khi lượng ohospho vơ cơ được sử dụng hồn tồn. pH thích hợp từ 6-7,2, pH kiềm kìm hãm, pH = 4 ức chế hồn tồn. Vật liệu gieo cấy cĩ thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10%. Trong quá trình nuơi cấy hàm lượng các chất hịa tan trong mơi trường thường giảm từ 6 xuống cịn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khơ cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khơ đạt 5-8% rối sấy khơ trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C. thời gian lưu của chế phẩm enzym trong thiết bị sấy phải khơng quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải khơng quá 40 độ C. chế phẩm thu được cần phải được đĩng gĩi kín để tránh hút ẩm. Cĩ thể thu bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với etanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammoniumsulfate(50-80%). Nếu kết tủa bằng etanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu. nếu kết tủa bằng muối ammonium silfate, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích, sau đĩ sấy khơ. b/Phương pháp yếm khí: Mơi trường :bã củ cải 2%, (NH4)2HPO4 0,75% KH2PO4: 0,1%; CaCO3 0,3%; nước chiết ngơ: 0,5% Clostridium pectinofermentants 15 cĩ khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối.sự tích lũy ezym tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 5-60h. pH ban dầu của mơi trường dinh dưỡng là 6,5-7,0. vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuơi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35 độ C. cl.felsineum cũng cĩ thể được nuơi cấy yếm khí để thu được pectinase thành phần mơi trường cĩ: lactose 2%, pectin củ cải 1%, (NH4)HPO4 0,4%,K2HPO4 0,7%, KH2PO4 0,3%, NaCl 0,1%, MgSO4 0,025%, FeSO4dạng vết, CaCO4 0,5%, dịch nấm men tự phân, 0,05%, ascorbis acid 0,5%. Cĩ thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzym với dung mơi hữu cơ hoặc với muố amomium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung mơi hữu cơ, Ph của dung dịch đã xử lý là 6,5- 6,8. nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzim trong kết tủa đạt 93-95 % so với hoạt đọ ban đầu. Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzym pectinase thường theo các bước cơ bản sau; -khử muối bằng phương pháp lọc gel -tách protein bằng phương pháp trao đổi ion _tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang _Tinh sạch bằng FPLC II/THU NHẬN CELLULASE TỪ VSV Cellulose là thành thành phần cơ bản của thực vật và chúng được thực vật tổng hợp với số lượng nhieuf nhất trong tự nhiên. Cellulose cũng là mọt trong những chất hữu cơ cĩ trong tự nhiên chỉ bị VSV phân giải. thực hiện quá trình phân giải celluosa trong diều kiện tự nhiên là các loại enzym cellulase. VSV tổng hợp celluase Trong điều kiện tự nhiên, celluose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí lẫn hiếm khí. Các lồi VSv thay phiên nhau phân hỷ celluose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, trong thiên nhiên, khơng cĩ một VSV nào cĩ khả năng cùng một lúc tổng hợp tất cả các loại enzym cĩ trong phức hệ enzym celluase. Cĩ lồi này cĩ khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzym này, lồi khác lại tổng hợp mạnh loại enzym khác,. Chính vì thế, sự phân giải glucose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và khơng triệt để. Số lượng các lồi VSV tham gia sinh tổng hợp enzym cĩ trong tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khẩn, vi khuẩn, và trong một số trường hợp cịn cĩ cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này. Trong đĩ, nhuwgx VSV sau được nghiên cứu kĩ nhất: Altenaria tenuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Celluvibrio gilvus, Fusarium culmorum, Trichoderma koningi… Enzym celluase là một trong những enzym cĩ vai trị rất quan trọng trong quá trình chuyển hĩa các vật chất hữu cơ cĩ trong thiên nhiên và cĩ ý nghĩa lớn trong cơng nghiệp thực phẩm, bảo vệ mơi trường. 2.Phương pháp thu nhận: VSV cĩ khả năng tổng hợp celluase thuộc ba nhĩm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. trong cơng nghiệp sản xuật enzym cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuơi cấy nấm sợi và xạ khuẩn. Để thu nhận enzym cellulase từn nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuơi cấy theo phương pháp bề mặt bằng mơi trường xốp( mơi trường bán rắn) độ ẩm tốt nhất là 60-65%, cĩ cơ chất là cellulose. Thành phần mơi trường phải: đủ chất dinh dưỡng, cĩ cellulose, cĩ đủ độ xốp để khơng khí lưu thơng. Phải cung cấp oxy vì cà hai đều là VSV hiếu khí. Xạ khuẩn phát triển mạnh trong mơi trường kiềm và mơi trường axit yếu.Nấn sợi phát triển mạnh trong mơi trường axit.PH mơi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6.2-7.6.PH mơi trường ban đầu cho nấm sợi là 4.5-5.5. Xạ khuẩn thưởng cĩ thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thơng thường,nấm sợi phát triển từ 36-48h cho hoạt tính enzim rất cao.Xạ khuẩn phải mất ít nhất 72h mới tổng hợp cellulase nhiều. Xạ khuẩn chịu nhiệt tốt hơn nấm sợi. Enzim của xạ khuẩn hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzim của nấm sợi. Sau khi nuơi cấy ở những điều kiện kĩ thuật tối ưu,người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thơ.Chế phẩm này chứa nước,sinh khối vi sinh vật,thành phần mơi trường và enzim. Cơng việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hĩa lý tách nước,sinh khối VSV sẽ thu được enzim dạng bán tinh khiết.Enzim bán tinh khiết cịn chứa nước,protein kh6ng hoạt động và enzim.Bằng những phương pháp hĩa lý ta sẽ loại được nước,protein khơng hoạt động khi đĩ ta thu được chế phẩm enzim tinh khiết.