Đề tài Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu

Phần 1. MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới ẩm gió mùa, nền kinh tế chủ yếu vẫn là sản xuất nông nghiệp. Khí hậu nóng ẩm rất phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, đồng thời cũng là điều kiện tốt cho sâu bệnh phát triển. Theo thống kê của tổ chức Lương- Nông thế giới, hiện nay các loại cây trồng trên đồng ruộng phải chống đỡ với 100000 loài sâu hại khác nhau, 10000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng và 600 loài virus gây bệnh. Hàng năm, khoảng 20 % sản lượng lương thực, thực phẩm trên thế giới bị mất trắng [1]. Do đó việc sử dụng thuốc trừ sâu là vô cùng cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực cho loài người. Theo TS. Marcus Theurig (2002), nếu không sử dụng thuốc BVTV thì loài người phải cần đến 3 lần diện tích trồng cấy như hiện nay [3]. Bên cạnh những lợi ích lớn lao của thuốc trừ sâu hóa học thì nó cũng gây ra các hậu quả không nhỏ. Thuốc trừ sâu hóa học tồn tại lâu trên nông sản ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng, đồng thời một lượng lớn thuốc trừ sâu khi phun cho cây đã phát tán vào môi trường đất, nước gây ô nhiễm nghiêm trọng. Ô nhiễm do thuốc trừ sâu kết hợp với các loại ô nhiễm khác đã làm cho môi trường của chúng ta đang ở trong tình trạng đáng báo động. Trước tình hình này, việc sử dụng phương pháp đấu tranh sinh học trong trồng trọt để bảo vệ mùa màng đang được áp dụng mạnh mẽ. Trong số những bệnh côn trùng, bệnh gây ra do vi sinh vật chiếm 80- 90%, nên vi sinh vật là đối tượng lý tưởng để lợi dụng đấu tranh sinh học trong bảo vệ cây trồng. Xuất phát từ những lý do trên, tôi quyết định tìm hiểu đề tài: “Tìm hiểu công nghệ vi sinh sản xuất thuốc trừ sâu” Phần 2. NỘI DUNG I. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn 1.1. Một số vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại [2] 1.1.1. Vi khuẩn sinh bào tử điển hình Clotridium brevifaciens Clotridium malacosomae Baciluss cereus Baciluss thuringiensis Baciluss var. entomocidus Baciluss var. galleriae Baciluss var. isralensis (Bti) Baciluss sphaericus (Bs) Baciluss popilliae 1.1.2. Vi khuẩn không sinh bào tử điển hình Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa P. putida Proteus vulgaris Proteus mirabilis Nhiều loài của chi Aerobacter Nhiều loài của chi Cloaca Trong số những vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại, Baciluss thuringiensis (Bt) là tác nhân sinh học đầu tiên được nghiên cứu sản xuất thành thuốc trừ sâu vi sinh trên thế giới. * Một số loài sâu bị Bac. Thuringiensis gây chết [1] Có khoảng hơn 200 loài côn trùng có thể bị vi khuẩn Bt gây chết trong đó đa số là sâu hại cây trồng và cây rừng. Con số này không ngừng gia tăng do các nhà khoa học không ngừng tìm kiếm các chủng vi sinh vật có khả năng diệt côn trùng và thử nghiệm trên các loài sâu khác nhau. Sâu xanh hại bông (Heliothis armigera) Sâu xám hại rau (Agrotis upsilon) Ngài đêm hại su hào, bắp cải (Barathra brassicae) Sâu xanh hại ớt (Heliothis assulta) Bọ lá khoai tây (Leptinotarsa decemlineata) (H.1-Phụ lục) Bọ xít rùa (Eurygaster integriceps) Sâu cắn lá ngô (Leucania separate Walker) Mọt lúa mì (Sitophilus granaries Linne) Sâu non đục củ khoai tây (Gnorimoschema opereulella Zeller) Sâu đục thân bắp (Pyrausta nubilalis Hiibner) (H.3-Phụ lục) 1.2. Chế phẩm thuốc trừ sâu Bt 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bt [2] - Bt là trực khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, nhuộm gram dương, kích thước 3-6 µm, có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi. - Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Bt không cao, chất dinh dưỡng chủ yếu là protein động thực vật. Bt có thể phát triển bình thường trong nhiều nguồn nitơ, cacbon và muối vô cơ. + Nguồn cacbon: tinh bột, maltose, glucose + Nguồn nitơ: nitơ hữu cơ: cao thịt bò, peptone, bột men, bột bánh lạc, bột cá v.v... + Muối vô cơ: K2HPO, MgSO4, CaCO3. - Biên độ nhiệt sinh trưởng của Bt là 120C – 400C, nhiệt độ thích hợp là 270C- 320C, ở 350C- 400C sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hóa, nhiệt độ thấp sinh trưởng rất chậm. - Bt thích hợp với điều kiện kiềm, pH thích hợp là 7,5; ở pH 8,5 vẫn có thể hình thành bào tử; pH= 5 không hình thành bào tử. - Phản ứng sinh lý, sinh hóa của Bt: + làm ngưng kết sữa; + trong đường glucose, fructose, glycerol, tinh bột, maltose sẽ hình thành acid + có phản ứng dương với methyl đỏ, phản ứng VP dương (ethiryl methyl methanol) + có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết ngựa agar + có thể mọc trên môi trường muối xianat, khử muối nitrat thành nitrit, không khử muối sulphat, sản sinh ra enzyme phospholypase. Quá trình sống có thể chia làm 3 giai đoạn: Thể sinh dưỡng, nang bào tử, bào tử và tinh thể. 1.2.1.1. Thể sinh dưỡng Dạng que, hai đầu tù, kích thước 1,2- 1,8 μm x 3- 5 μm, bắt màu gram dương. Lông mọc xung quanh, hơi động hoặc không động. Thường tồn tại 1 hoặc 2 cá thể liền nhau. Thể sinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang. Trong thời kì sinh sản, thường có 2,4,8,v.v.. thể sinh dưỡng liền nhau thành một chuỗi. Lúc này vi khuẩn sinh trưởng nhanh, trao đổi chất mạnh, dễ nuôi cấy trên môi trường. 1.2.1.2. Nang bào tử Khi các thể vi khuẩn già, một đầu sẽ hình thành bào tử hình bầu dục, đầu kia hình thành tinh thể hình thoi. Đây là giai đoạn nang bào tử, nang bào tử hình trứng dài, to hơn thể sinh dưỡng. 1.2.1.3. Bào tử và tinh thể (H.1) Nang bào tử phát triển nứt ra giải phóng bào tử và tinh thể. Bào tử ở dạng ngủ có thể chống chịu với môi trường bất lợi, do đó chế phẩm bào tử thường được bảo quản ở dạng bào tử. Bào tử Tinh thể độc Tinh thể thường có dạng hình thoi, tùy theo loài và môi trường tinh thể có thể có dạng tròn hoặc bầu dục. Tinh thể có bản chất protein, là chất diệt sâu có hiệu quả. Hình 1: Nang bào tử của Bacillus thuringiensis [8] 1.2.2. Độc tính và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bt 1.2.2.1. Các nhóm độc tố của Bt Các chủng khác nhau của loài Bacillus thuringiensis sinh ra 2 loại chất độc chính + Các chất độc tinh thể (Cry) được mã hóa bởi các gene cry khác nhau. + Các chất độc phân giải tế bào (Cyt), loại chất độc này tác động riêng rẽ hoặc cùng với Cry làm tăng tác dụng của tinh thể độc. * Nhóm chất độc phân giải tế bào (Cyt) Gồm các ngoại độc tố do vi khuẩn tiết ra - Ngoại độc tố α (alpha- exotoxin): là enzim phospholipase được tiết ra trước khi bào tử và tinh thể độc được hình thành gây phân hủy mô trong cơ thể côn trùng bị tác động. - Ngoại độc tố β (beta- exotoxin): là loại ngoại độc tố của Bt được nghiên cứu kỹ nhất. Độc tố này có tính bền nhiệt, được tạo ra trước khi tinh thể độc hình thành. Vi khuẩn Bt có một số type huyết thanh là H1, H4a, H4c, H5, H8, H9 và H10 có khả năng sinh ngoại độc tố β [1]. Ngoại độc tố này có cấu trúc tương tự ATP, có tác dụng cạnh tranh với ATP à ức chế hoạt động của ARNpolymerase. Cùng với tinh thể độc ngoại độc tố β xâm nhập vào huyết tương của côn trùng, đến các cơ quan làm tăng tính độc của vi khuẩn. Hiệu quả của ngoại độc tố β thể hiện rõ nhất trên tế bào sâu non của côn trùng chịu tác động à ngăn cản quá trình lột xác, hoặc gây dị thường trong phát triển. - Ngoại độc tố γ: là một loại phospholipase tác động lên phospholipid, phá hủy mô tế bào. * Tinh thể độc: Nội độc tố δ (delta- endotoxin) (H.3) Tinh thể độc Cry được tạo ra với một lượng lớn hơn nhiều so với chất độc Cyt và là tác nhân có hiệu quả chính trong việc gây độc cho côn trùng. Tinh thể độc không hòa tan trong nước hoặc các chất hữu cơ nhưng có thể hòa tan trong dung dịch kiềm. Có hơn 50 gene mã hóa các protein tinh thể độc, có thể chia protein tinh thể độc thành 15 nhóm dựa trên sự giống nhau trong trình tự gene 1.2.2.2. Cơ chế gây độc của tinh thể độc (H.2) Tinh thể Bào tử Quá trình hòa tan tinh thể và hoạt hóa chất độc Nội độc tố δ tiền độc tố độc tố hoạt động Độc tố liên kết với receptor trên biểu bì ruột receptor độc tố Xuyên thủng màng ruột D. Bào tử nảy mầm và vi khuẩn sinh sôi Hình 2: Cơ chế hoạt động của tinh thể độc tố diệt côn trùng [6] A: Sâu ăn lá có vi khuẩn à tinh thể độc và bào tử xâm nhập vào cơ thể sâu. Trong điều kiện bình thường, tinh thể độc không hòa tan. B. Quá trình hòa tan tinh thể và hoạt hóa chất độc: xảy ra ở ruột giữa nơi có pH kiềm cao (> 9,5), ở pH này tinh thể độc tan ra à tiền độc tố có kích thước 135- 140 kDa à protease trong ruột giữa của sâu hoạt hóa thành dạng hoạt động là độc tố δ (kích thước 60- 66 kDa). C. Độc tố liên kết với thụ thể (receptor) trên biểu bì ruột à đâm qua màng tạo thành lỗ xuyên màng à mất cân bằng ion nội bào của tế bào biểu mô à tế bào nội mô bị phân giải à sâu ngừng ăn à chết đói D. Lỗ xuyên màng xuất hiện trên thành ruột à pH trong ruột giảm xuống bằng pH nội môi trong huyết tương à cho phép bào tử nảy mầm, xâm chiếm vật chủ à gây chết. Nội độc tố δ có 3 vùng chức năng: + Vùng I: là một bó gồm 7 chuỗi xoắn α, một vài chuỗi hoặc tất cả các chuỗi có thể cài vào màng tế bào ruột, tạo ra các lỗ à các ion qua lại tự do + Vùng II: chứa 3 dải β không song song tương tự như vùng gắn kháng nguyên của globulin miễn dịch, vùng này có chức năng gắn với thụ thể trên bề mặt tế bào biểu mô ruột. + Vùng III: bảo vệ độc tố đã được hoạt hóa khỏi bị phân hủy bởi protease ruột. Với cấu trúc và hoạt tính như vậy, tinh thể độc liên kết một cách đặc hiệu với màng tế bào biểu mô ruột của sâu, do đó phổ tác động của Bt khá hẹp, tùy từng loại tinh thể độc mà các chủng Bt tác động với các sâu của nhóm côn trùng chủ yếu thuộc bộ Lepidoptera. Vùng I Vùng II Vùng III Hình 3: Tinh thể độc của Bacillus thuringiensis [8] 1.2.3. Phương pháp sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt: [2] Bt được sản xuất chủ yếu theo hai cách : lên men thường (lên men bề mặt) và lên men chìm có sục khí. Hiện nay người ta sử dụng phương pháp lên men chìm vì mang lại hiệu quả cao. Bước chọn chủng lên men: tùy theo việc phòng trừ loài sâu hại nào mà nhà sản xuất chọn chủng vi khuẩn phù hợp để lên men. Bước chọn môi trường lên men: trên cơ sở môi trường cơ bản, tùy thuộc chủng vi khuẩn cần lên men mà thêm các chất phù hợp. Quy trình tổng quát sản xuất chế phẩm Bt Chủng Bt thuần khiết Nhân giống cấp 2 Nhân giống cấp 1 Thời gian lên men: 48- 72 h, pH = 7, nhiệt độ: 300C Lên men Lọc và ly tâm Thu sinh khối Hoàn thiện sản phẩm Lên men chìm tiến hành trong các nồi lên men 500l, 1000l, 2000l, ngoài môi trường dinh dưỡng cần chú ý tới một số thông số khác như: chế độ thổi khí, chế độ nhiệt độ, chế độ luân chuyển giống v.v.. để hạn chế các thực khuẩn thể phá hủy các bào tử và tinh thể độc. + Chế độ thổi khí: là chỉ tiêu quan trọng trong quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc. Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5- 0,6 m3 môi trường / m3 không khí. Chế độ thổi khí thấp à bào tử phát triển yếu, mật độ thưa. Chế độ thổi khí cao à bào tử phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn, tinh thể độc nhỏ à hiệu quả diệt sâu không cao. + Nhiệt độ: ảnh hưởng đến quá trình hình thành bào tử, nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp sẽ rút ngắn hoặc kéo dài quá trình lên men, nhiệt độ phù hợp là 300C. + Chế độ luân chuyển giống: nếu sử dụng giống liên tục sẽ xảy ra hiện tượng nhiễm thực khuẩn thể. Bình thường chỉ lên men 10- 15 lần giống cũ thì phải thay giống mới để khắc phục hiện tượng phân đốt, hiện tượng tạo ra ít bào tử và ít tinh thể độc tố. Sau khi lên men, người ta lọc và ly tâm dịch lên men để thu sinh khối. Bước hoàn thiện sản phẩm: sản phẩm được đóng gói và chế thành các dạng chế phẩm khác nhau. Dạng chế phẩm cũng là một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phòng trừ sâu bệnh. Chế phẩm Bt có các dạng: nước, bột, bột thấm nước, nang keo. 1.2.4. Một số chế phẩm Bt trừ sâu * XENTARI 35 WDG trừ sâu hại cây Rau [4] Xentari 35 WDG (Bacillus thuringiensis var.aizawai), là một sản phẩm của Công ty Valent BioSciences-Hoa Kỳ đã được phép sử dụng trên rau theo Quyết định số 19/2005/QĐ-BNN ngày 24/3/2005 của Bộ Nông nghiệp và PTNT. - Xentari có tính chọn lọc cao, diệt trừ rất hữu hiệu hơn 60 loài sâu hại thuộc bộ cánh phấn đã kháng các loại thuốc hóa học khác trên 200 loài cây trồng khác nhau. - Thuốc an toàn đối với người sử dụng, phân giải dễ dàng, không ảnh hưởng đến quần thể thiên địch. * Agritol (Hoa Kỳ) : 60- 70 bào tử/g * Larvatrol (Hoa Kỳ) : 5- 150 bào tử/g * Thuricide (Hoa Kỳ) : 5- 50 bào tử/g * Bathurin (Tiệp Khắc) : 3- 300 bào tử/g * Entobakterin (Nga) : 50- 90 bào tử/g * Biospore (CHLB Đức) : 20- 30 bào tử/g II. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc virus 2.1. Cơ sở khoa học: * Đặc điểm đặc trưng của virus là kí sinh bắt buộc với một hoặc một số vật chủ nhất định, gây hại hoặc làm chết vật chủ kí sinh. Dựa vào đặc điểm này các nhà khoa học đã sử dụng virus để sản xuất thuốc trừ sâu. Có hai nhóm virus được quan tâm trong công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu: Baculovirus thuôch họ Baculoviridae Cytoplasmis polyhedrosis virus (CPV) thuộc họ Reoviridae. * Nhóm Baculovirus được sử dụng phổ biến nhất do các ưu điểm nổi trội sau: - Baculovirus chỉ tấn công động vật không xương sống và có tính đặc hiệu cao nên không gây hại cho các côn trùng có ích khác - Có cấu trúc thể bọc bảo vệ tránh điều kiện bất lợi của môi trường à có khả năng sống tiềm sinh ngoài cơ thể vật chủ. - Có thể đạt được nồng độ cao trong cơ thể ấu trùng (1010 virus/ ấu trùng) nên thuận lợi trong sản xuất chế phẩm sinh học. Chế phẩm có thể giữ hoạt tính sinh học trong thời gian dài (10-15 năm) ngoài cơ thể vật chủ. 2.1.1. Đặc điểm cấu trúc và hệ gene Baculovirus - Baculovirus có hình que điển hình, đường kính 30- 60 nm, dài 250- 300 nm. - AND vòng, kép. Trên khắp hệ gene có nhiều trình tự ngắn lặp lại (vùng tương đồng), tăng cường khả năng phiên mã sớm của gene và có vai trò như các promotor. Trong hệ gene có nhiều gene gối nhau cho phép mã hóa nhiều gene trong khi kích thước hệ gene nhỏ. * Polyhedra: Các virus tập trung lại trong một thể đa diện (thể bọc), được quan sát thấy dưới kính hiển vi quang học. Thể bọc được tạo ra ở giai đoạn muộn trong chu kì lây nhiễm của virus, thể này được bọc trong một lớp giàu protein, cấu trúc này được gọi là polyhedra, giúp virus lây nhiễm sang tế bào mới và giúp chúng chống chịu được với điều kiện tự nhiên (H.4). * Virus nảy chồi: gặp khi virus lây nhiễm vào cơ thể côn trùng hoặc được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Virus nảy chồi chỉ mang duy nhất một nucleocapsid được bao bọc bởi lớp vỏ có nguồn gốc từ màng sinh chất của vật chủ. Các protein trên lớp vỏ này như protein GP64 có vai trò quan trọng trong việc giúp virus lây nhiễm [H.4]. vỏ virus từ màng tế bào vật chủ Virus nảy chồi AND virus thể vùi vỏ bọc virion vỏ của polyhedra (calyx) Virus trong cấu trúc polyhedra Hình 4: Cấu tạo các dạng tồn tại của virus [7] 2.1.2. Chu trình sống và cơ chế lây nhiễm gây độc của nucleopolyhedrovirus (NPV) (H.5) Polyhedra vỡ à virionà phá hủy thành ruột Các tế bào ruột giữa Thành ruột Polyhedra chứa nhiều virion Côn trùng ăn polyhedra ruột sau Thành ruột Môi trường ruột giữa có pH kiềm ruột trước Hình 5: Sự lây nhiễm NPV vào vật chủ là côn trùng [7] Baculovirus có chu trình phân chia hai pha. Hai dạng tồn tại, một dạng giúp cho virus này lây nhiếm trong môi trường tự nhiên từ vật chủ này sang vật chủ khác (Polyhedra) và một dạng là virus nảy chồi liên quan đến sự lan truyền của virus giữa các tế bào trong chính cơ thể vật chủ. - Khi vật chủ ăn thức ăn có chứa virus thể bọc, virus sẽ theo đường tiêu hóa đi vào ruột giữa. - Môi trường kiềm tại ruột giữa sẽ phá tan thể bọc, giải phóng các virion. Virion xâm nhập qua tế bào thành ruột vào trong tế bào. Tại đây chúng sử dụng bộ máy tế bào chủ thực hiện các quá trình sao chép, phiên mã và dịch mã tạo ra các virion mới. - Virion mới nảy chồi, thoát ra khỏi tế bào thành ruột trở thành dạng virus nảy chồi. Do lớp bọc ngoài là từ màng tế bào thành ruột nên các virus này có thể xâm nhập tiếp vào các tế bào thuộc các mô khác của côn trùng. - Virus tấn công vào tất cả các loại tế bào khác nhau trong cơ thể vật chủ, ở mỗi tế bào chu trình trên lại được tiếp tục. Tuy nhiên, thay vì tạo ra các virion nảy chồi, các virus mới tạo ra tập hợp lại, được bao bởi các protein polyhedrin đặc biệt tạo ra cấu trúc thể bọc gây tan tế bào. Vật chủ bị tiêu diệt giải phóng hàng loạt thể bọc. Các thể bọc này lại tiếp tục tấn công vào cơ thể mới. 2.2. Nguyên tắc sản xuất thuốc trừ sâu virus Nuôi sâu làm vật chủ để nhân bản virus vì virus chỉ nhiễm vào tế bào sống. Sâu kí sinh được nuôi trong buồng nuôi bằng thức ăn nhân tạo, đến giai đoạn ấu trùng thì dịch huyền phù virus được cây vào thức ăn để lây nhiễm cho sâu. Sau 7- 9 ngày, ấu trùng chết sẽ được thu , sấy nhẹ ở 33-350C đến khô.Xác sâu mang nhiều virus được nghiền thành bột, thêm dịch sinh lý, trộn đều rồi lọc. Sản phẩm lọc được ly tâm lấy cặn chứa virus, thêm nước cất tạo thành dịch huyền phù, glycogen vô trùng được thêm vào để bảo quản. III. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ nấm sợi 3.1. Một số đại diện nấm sợi có khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng Sâu hại phát triển nhanh nhưng số lượng luôn được giới hạn bởi hiện tượng khống chế sinh học thông qua các thiên địch. Nấm sợi là một trong những thiên địch phổ biến, có nhiều loài thuộc các lớp nấm khác nhau có khả năng diệt côn trùng, tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loài được nghiên cứu dùng trong nông nghiệp [2]. 3.1.1. Một số loài nấm sợi được sử dụng: [1] + Aschersoria spp. + Beauveria bassiana + Conidiobolus obscurus + Culicinomyces clavosporus + Metarrhizium anisopliae + Hirsutella thompsonu Trong các loài trên, có một số được sử dụng phổ biến và có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu hại cây trồng và cây rừng: Beauveria bassiana: nấm bạch cương Metarrhizium anisopliae: nấm lục cương 3.1.2. Một số đặc điểm đặc trưng của nấm [2] - Xâm nhập vào côn trùng không qua đường miệng mà qua tầng cutin tại khớp nối giữa các đốt. - Côn trùng thường bị nhiễm nấm ở giai đoạn ấu trùng và không thấy có tác động qua lại với các vi sinh vật khác. - Nấm sinh trưởng nhanh, dạng bào tử có thể tồn tại lâu dài trong thiên nhiên mà hầu như không mất hoạt tính diệt côn trùng. - Có tính đặc hiệu cao đối với một số loài côn trùng nhất định. 3.2. Beauveria bassiana (Bals) Vuill (H.6) 3.2.1. Đặc điểm Nấm bạch cương được phát hiện trong trường hợp gây bệnh làm chết hàng loạt tằm. Nấm bạch cương có dạng sợi phân nhánh, màu trắng, có vách ngăn ngang. Hệ sợi nấm phát triển nhanh, tạo khối xốp màu trắng nên gọi là nấm bạch cương hay nấm vôi. Trên cơ thể côn trùng, khi sợi nấm khô chuyển sang màu kem, đôi khi pha thêm ít màu đỏ hoặc da cam. Bào tử trần, đơn bào, không màu, hình cầu hoặc hình trứng. Chứa độc tố beauvericin, có công thức C45H57O9N3. Đây là một loại depsipeptid vòng b a Hình 6: Beauveria bassiana (Bals) Vuill [9] a. Bào tử trần và cuống sinh bào tử; b. Sợi nấm mọc trên cơ thể côn trùng 3.2.2. Cơ chế tác động (H.7) Bào tử đính lỗ phôi Bào tương biểu bì Các sợi nấm tầng trung gian kitin Phun chế phẩm nấm à bào tử nấm phát tán, gặp cơ thể sâu à bào tử nảy mầm thành các sợi nấm đâm xuyên qua tầng vỏ kitin của sâu vào trong cơ thể à Sợi nấm phát triển rất nhanh, tạo các bào tử đính trong cơ thể côn trùng, các bào tử này lại nảy mầm, phát triển phủ kín bề mặt côn trùng. Hình 7: Cơ chế xâm nhập của bào tử đính vào cơ thể côn trùng [5] 3.3. Tạo chế phẩm nấm diệt sâu Beauverin là chế phẩm diệt sâu sản xuất từ Beauveria, có màu trắng ngà, chứa 1,5 -6 x 109 bào tử/ g. Để nâng cao hiệu quả diệt sâu đôi khi người ta bổ sung thêm 10% thuốc hóa học [2]. Quy trình lên men chìm tạo chế phẩm nấm diệt sâu [1] ống giống nuôi 5-7 ngày Nhân giống trong bình 250 ml có 100 ml môi trường. Lắc 20 v/ phút, t0: 28- 300C/ 24 h Nhân giống trong bình 1000 ml có 500 ml môi trường. Lắc 200 v/ phút, t0: 28- 300C/ 24h Lên men trong hệ thống 10l tự động có 7-8 l môi trường. Khuấy 550 v/ phút, t0: 29- 300C/ 72 h Li tâm lạnh 3000 v/ phút/ 40 phút Sinh khối + chất phụ gia Sấy khô ở 30- 350C Nghiền nhỏ, vô bao kín, bảo quản ở 5- 100C IV. Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu vi sinh 4.1. Ưu điểm [1] Không độc hại cho người, động vật và cây trồng, tiêu diệt một cách chọn lọc các loài sâu hại Không gây tính kháng thuốc với sâu hại, không làm mất đi một quần thể thiên địch có ích trong tự nhiên. Khả năng phát tán rộng. Không cần phun nhiều lần mà vẫn duy trì được hiệu quả. Các vi sinh vật diệt côn trùng có thể lây nhiễm lên côn trùng bằng nhiều cách do đó tăng cường khả năng nhiễm thành công vi sinh vật vào côn trùng. 4.2. Nhược điểm Thuốc trừ sâu vi sinh có tính đặc hiệu cao nên phổ tác động hẹp. Do đó để tiêu diệt nhiều loại côn trùng thì phải sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu virus, điều này không mang lại hiệu quả về kinh tế. Diễn biến chậm, khi gặp điều kiện thời tiết bất thuận thì khó đạt kết quả tốt. Chịu những tác động của môi trường rất lớn như ánh sáng, lượng nước tưới, nước mưa, nhiệt độ v.v... Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn, thường 1 - 2 năm, trong những điều kiện lạnh, khô. Giá thành còn cao. Phần 3. KẾT LUẬN Việc sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh đã đem lại hiệu quả tốt trong công tác bảo vệ thực vật và không ảnh hưởng đến môi trường nên ngày càng được sử dụng rộng rãi. Công nghệ vi sinh ở nước ta chủ yếu vẫn là công nghệ truyền thống do đó cần cải thiện cộng nghệ để tạo ra các sản phẩm phục vụ tốt hơn cho nông nghiệp. Cần nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp nhằm tạo ra các virus, vi khuẩn, vi nấm có phổ tác động rộng hơn và độc tính mạnh hơn đối với các côn trùng. Bên cạnh những ưu điểm, thì những nhược điểm của thuốc trừ sâu vi sinh có thể được cải thiện bằng cách chuyển gene mã hóa độc tố vào cây trồng (H.2-Phụ lục). Bằng cách này các côn trùng ăn sâu vào các mô không chịu tác dụng của thuốc phun bề mặt đều có thể bị tiêu diệt. Một số loài cây đã được chuyển gene Bt và trồng phổ biến như ngô, bông, khoai tây v.v... TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Thị Thanh, 2001. Công nghệ vi sinh, nhà xuất bản Giáo dục. 2. GS. TS. Phạm Văn Ty- TS. Vũ Nguyên Thành, 2007. Công nghệ sinh học, tập 5- Công nghệ vi sinh và môi trường. Nhà xuất bản Giáo dục. 3. Hữu Điển- Bộ NN&PTNT. Thuốc bảo vệ thực vật và vấn đề ô nhiễm môi trường 4. 5. Matthew B. Thomas & Andrew F. Read, 2007. Can fungal biopesticides control malaria? Nature Reviews Microbiology 5, 377-383. 6. Erlandson Marcus & Theo Litowski. How does Bt Work? 7. Kalmakoff & Ward, (2003) 2007.Baculoviruses 8. Professor DJ Wright 9. 10. 11. 12. 13. PHỤ LỤC a b c Hình 1: Bọ lá khoai tây Leptinotarsa decemlineata a. trứng [10]; b. Sâu [8]; c. Con trưởng thành [9] Gene Bt được chuyển từ Bacillus vào ngô Gene Bt biểu hiện tạo protein Bt Protein Bt bảo vệ tế bào khỏi sự phá hại của côn trùng Vi khuẩn Bt Hình 2: Ngô chuyển gene Bt kháng cô trùng trứng sâu đục thân trên lá ngô Sâu đục thân nằm trong thân ngô Con trưởng thành Hình 4: Sâu đục thân bắp (Pyrausta nubilalis Hiibner) [7] MỤC LỤC Trang Phần 1. MỞ ĐẦU 1 Phần 2. NỘI DUNG 2 I. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc vi khuẩn 2 1.1. Một số vi khuẩn có khả năng diệt sâu hại 2 1.1.1. Vi khuẩn sinh bào tử điển hình 2 1.1.2. Vi khuẩn không sinh bào tử điển hình 2 1.2. Chế phẩm thuốc trừ sâu Bt 3 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bt 3 1.2.2. Độc tính và cơ chế gây độc của vi khuẩn Bt 4 1.2.3. Phương pháp sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu Bt 7 1.2.4. Một số chế phẩm Bt trừ sâu 9 II. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc virus 9 2.1. Cơ sở khoa học: 9 2.1.1. Đặc điểm cấu trúc và hệ gene Baculovirus 10 2.1.2. Chu trình sống và cơ chế lây nhiễm gây độc của nucleopolyhedrovirus (NPV) 11 2.2. Nguyên tắc sản xuất thuốc trừ sâu virus 12 III. Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ nấm sợi 12 3.1. Một số đại diện nấm sợi có khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng 12 3.1.1. Một số loài nấm sợi được sử dụng 13 3.1.2. Một số đặc điểm đặc trưng của nấm 13 3.2. Beauveria bassiana (Bals) Vuill 13 3.2.1. Đặc điểm 13 3.2.2. Cơ chế tác động 14 3.3. Tạo chế phẩm nấm diệt sâu 14 IV. Ưu và nhược điểm của thuốc trừ sâu vi sinh 15 4.1. Ưu điểm 15 4.2. Nhược điểm 16 Phần 3. KẾT LUẬN 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 PHỤ LỤC 19