Đề tài Tìm hiểu hệ vi sinh vật có lợi trong sản xuất các sản phẩm từ rau quả

trong nước quả. Bản thân việc lên men tạo cồn ethylic cũng tạo điều kiện thuận lợi để quá trình lên men diễn biến bình thường. Nếu vì một nguyên nhân nào đó, men Saccharomyces ngừng hoạt động nửa chừng, còn lại đường khử, rất dễ bị khuẩn và các men dại phá hủy làm hỏng rượu. Vì vậy một trong những nguyên tắc kỹ thuật chế rượu vang quan trọng nhất là tạo điều kiện cho men Saccharomyces sinh sản nhanh, chuyển toàn bộ đường thành rượu trong thời gian ngắn nhất; sau khi đường đã chuyển hóa hết, lượng cồn etylic sản sinh đã cao thì khuẩn khó hoạt động. - Theo dõi quá trình lên men qua một số chỉ tiêu sau: + Hàm lượng đường: khi lên men phải tạo điều kiện để nấm men hoạt động mạnh, cho lên men nhanh, tiêu thụ hết đường. Vì vậy cần theo dõi hàm lượng đường thay đổi trong quá trình lên men. Nếu vì một lí do nào đó nấm men ngưng hoạt động, trong môi trường còn nhiều đường khử các vi sinh vật khác (không phải nấm men) phát triển dễ dàng, đưa đến thành phần rượu không còn như bình thường. + Nhiệt độ: nếu thực hiện lên men trong những thiết bị có dung tích lớn, người sản xuất phải đo nhiệt độ nhiều lần trong ngày, vì trong quá trình lên men nhất là ở giai đoạn đầu, quá trình lên men mạnh, sủi bọt nhiều, năng lượng tỏa ra nhiều, lúc ấy nhiệt độ cũng tăng lên nhiều. Quá trình lên men thích hợp với khoảng to = 20 - 30oC. Qua thực nghiệm và sản xuất, người ta thấy rằng: tốt nhất là từ đầu đến cuối quá trình cho lên men ở cùng một nhiệt độ. Độ nhiệt ổn định tuy ở mức khá cao to = 30oC, nhưng giữ ổn định liên tục vẫn tốt hơn là lúc đầu to = 20oC sau tăng lên 30oC. + Hàm lượng O2: mặc dù lên men rượu là một quá trình yếm khí nhưng nhất thiết trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho nước quả tiếp xúc với O2 không khí bằng cách sục khí. Giai đoạn sau cho lên men yếm khí. Trong lên men ở quy mô sản xuất nhỏ người ta cho lên men ở bình có miệng to và nút bình bằng nút bông. Khi lên men ở quy mô lớn, người ta sử dụng các nồi lên men hay các bể, khi đổ môi trường lên men vào phải để trống một thể tích thích hợp khoảng 1/3 - 1/5 thể tích nồi hay bể lên men. -Các giai đoạn lên men rượu vang: + Giai đoạn hình thành rượu: là giai đoạn từ lúc cấy men giống vào, cho lên men đến khi dịch lên men hết sủi bọt mạnh. Nếu giữ được nhiệt ổn định, thời gian lên men này kéo dài từ 4 - 5 ngày. Kết quả của giai đoạn này ta được “rượu non”. Trong thời gian này nấm men hoạt động mạnh nhất, tiêu thụ nguyên liệu (đường, đạm, vitamin) mạnh, biến đường thành rượu, giải phóng CO2. Kết thúc giai đoạn này thành phần nước quả thay đổi rất lớn. + Giai đoạn phát triển: khi kết thúc lên men ở giai đoạn một, người ta tiến hành gạn cặn, tách xác quả bằng biện pháp lọc (đối với vang đỏ - vang thu được do lên men dịch quả có kèm xác quả). Trong các cơ sở lên men ở quy mô lớn người ta dùng hệ thống ống hút xiphong để hút dịch lên men sang nồi hay bể lên men khác. Đây là gạn thứ nhất. Khi được “rượu non”, ta tiếp tục cho lên men, nhưng ở giai đoạn này quá trình lên men xảy ra không ồ ạt, người ta còn gọi là lên men phụ, phân hủy những gam đường cuối cùng có trong dịch lên men. Đồng thời ở giai đoạn này có quá trình lên men malolactic. Kết quả của quá trình này, acid malic chuyển thành axit lactic, làm cho rượu chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ dễ chịu (của acid lactic), CO2 còn được tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng ít dần. Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh lặng, xác men lắng xuống đáy bình hay bể. Tiếp theo thực hiện gạn cặn lần hai (sau lần một khoảng từ 20 – 30 ngày), lần ba (sau lần hai hơn 30 ngày). Nếu rượu còn đục ta gạn tiếp… để có dung dịch trong suốt. Sau lần gạn cuối rượu cơ bản ổn định về thành phần. Ở giai đoạn nay nếu nếm thử ta thấy rượu chưa thể uống được, vì có vị cay, hơi chua, đắng. Ta gọi là “rượu sống”. Lưu ý: sau mỗi lần gạn cặn, các dụng cụ đựng dung dịch lên men như chai, bình (lên men ở quy mô nhỏ), nồi lên men (ở quy mô công nghiệp) được đổ dịch lên men đầy hơn, tạo điều kiện lên men yếm khí nghiêm ngặt hơn. Đến lần cuối cùng đậy kín hoàn toàn, tạo sự cách ly nghiêm ngặt với O2. + Giai đoạn vang chín: sau giai đoạn hai, “rượu non” đã ổn định thành phần nhưng rượu vẫn còn “sống”, người ta phải áp dụng một số biện pháp kĩ thuật để làm tăng chất lượng của rượu, để rượu được “chín”. Những biện pháp này rất đơn giản nhưng lại quyết định chất lượng của rượu thành phẩm. Cụ thể cách tiến hành: Nút chai, bình đựng “rượu non” thật chặt. Hạ thổ ở độ sâu 50 - 60cm ở vùng đất cao, mát, không bị ngập nước. Vị trí tốt nhất là dưới hầm ở trong nhà nơi nhiệt độ ít dao động. Nếu không có điều kiện chôn sâu thì có thể để ở trong thùng đổ cát vùi kín. Hạ thổ với thời gian từ 4 - 5 tháng, rượu có thể uống được tuy chất lượng chưa hoàn hảo. Nếu qua hai năm trở lên rượu có chất lượng hoàn hảo gọi là “rượu chín”. Trong thời gian chuyển từ rượu vang “sống” sang rượu vang “chín” đã xảy ra rất nhiều biến đổi sinh hóa phức tạp để chuyển từ rượu ít ngọt, ít thơm có vị chua lấn át, có vị đắng của CO2 và aldehyde sang rượu chín trong vắt, có màu đỏ (hoặc vàng), có vị ngọt cân đối của cồn - đường, vị đắng nhẹ của glycerin, vị chát của polyphenol. Khi có đầy đủ những tính chất như vậy ta được rượu thành phẩm. CHƯƠNG II: LÊN MEN LACTIC TRONG MUỐI DƯA, MUỐI CÀ. I.Giới thiệu chung về muối dưa, muối cà: Rau quả đóng một vai trò quan trọng trong bữa ăn của con người. Trong rau quả có chất dinh dưỡng quý, như hydrat cacbon, các axit hữu cơ, vitamin, các chất khoáng, tanin, pectin v.v… Khó có thể giữ được các loại rau bắp cải, su hào, rau cải, dưa chuột, cà chua trong thời gian dài để cung cấp cho người tiêu dùng ở các thành phố hoặc khu công nghiệp trong lúc giáp vụ hoặc vì thời tiết khan hiếm rau tươi. Ngoài các hóa chất để bảo quản rau quả người ta còn muối chua rau quả để kéo dài thời gian cất giữ cũng cho kết quả khả quan và có ý nghĩa lớn trong việc cất giữ rau quả và giải quyết cho việc phục vụ bữa ăn của nhân dân. Muối chua rau, quả là một quá trình lên men lactic mà nguyên liệu là rau, quả, đường, muối và gia vị.Quá trình lên men này hoàn toàn là quá trình lên tự nhiên, gây ra bởi nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau. Muối chua rau dưa có từ xưa. Song, ở nước ta việc tìm hiểu các quá trình hóa sinh – vi sinh ở đây chưa được chú trọng và tới nay công việc này vẫn ở tình trạng thủ công dựa vào kinh nghiệm dân gian. Trong rau dưa thường có sẵn vi khuẩn Lactic và những tạp khuẩn gây hỏng quá trình muối chua (vi khuẩn axetic, butyric, vi khuẩn hoại sinh và nấm mốc). Vì vậy, trong việc này cần tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Lactic phát triển và đến khi đã tích tụ được axit lactic trong nước dưa sẽ ức chế các vi khuẩn khác. Công việc đầu tiên là phải chọn rau, rửa sạch, làm vệ sinh dụng cụ và đồng thời cũng lựa chọn nước, muối ăn. II. Lên men lactic là gì? 1) khái niệm chung : Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kỵ khí chứa các hợp chất đường thành axit lactic nhờ vi sinh vật (chủ yếu) và một số sản phẩm khác nữa. Con người từ lâu đã sử dụng vi sinh vật lên men lactic để bảo quản và chế biến các loại thức ăn. Năm 1780, nhà bác học Thủy Điển Schaele lần đầu tiên đã tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1857, L. Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn Lactic. Năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn Lactic và đặt tên là Bacterium lactic, gọi là Streptococcus lactic. 2.Tác nhân lên men lactic: Nhóm vi khuẩn Lactic đã được xác định bởi ORLA-JENSEN (1919), bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên men gluxit thành axit lactic. Lên men lactic có hai dạng:lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình. Lên men lactic đồng hình là loại lên men lactic hầu như chỉ cho sản phẩm là axit lactic. Quá trình lên men phụ thuộc vào giống vi khuẩn sử dụng. Trong quá trình lên men đồng hình, sự chuyển hóa đường glucose thành axit lactic xảy ra theo chu trình Embden – Meyerhof để tạo thành axit pyruvic, sau đó dưới tác dụng của lactadehydrogenase axit lactic hình thành. Quá trình này có ý nghĩa lớn trong công nghiệp thực phẩm. Lên men lactic dị hình là quá trình lên men, ngoài axit lactic còn có các sản phẩm khác như, atanol, CO2…Thông thường, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit succinic chiếm gần 20%, rượu etylic khoảng 10%, axit acetic 10% và các chất khác khoảng 20%. Tùy theo cơ chế lên men bắt buộc hay chủ yếu, mà người ta xác định là lên vi khuẩn lên men đồng hình (homofermentaires) hay vi khuẩn lên men dị hình (heterfermentaires). Một số vi khuẩn lên men đồng hình cũng có khả năng lên men dị hình trong những thời gian sinh trưởng không thuận lợi hoặc tùy thuộc vào nguồn đường sử dụng. 3. Vi khuẩn Lactic: a) Cấu tạo vi khuẩn Lactic: Vi khuẩn Lactic là những vi khuẩn Gram dương (G+): có thành phần cấu tạo cơ bản là peptidoglycan (PG), còn gọi là glucopeptit, murein,… chiếm 95% trọng lượng khô của thành tế bào, tạo ra một màng polime xốp, không hòa tan và rất bền vững, bao quanh tế bào thành mạng lưới. Cấu trúc của PG gồm ba thành phần: N. acetylglucozamin, N. acetylmuramic và galactozamin. Các vi khuẩn G+ có thành tế bào (cell wall) dày hơn, khoảng từ 14 – 18nm, so với thành tế bào của vi khuẩn G- (khoảng 10nm). (1nm = 10-3µm = 10-6mm), trọng lượng có thể chiếm 10 – 20% trọng lượng khô của vi khuẩn. Vách tế bào vi khuẩn có cấu tạo gồm hai chất dị cao phân tử là glucopeptit và nhóm polysaccarit. Nhóm polysaccarit đặc biệt của vách tế bào vi khuẩn G+ là axit techoic (là các polime của glycerol và ribitol photphat), gắn với PG hay màng tế bào. So sánh thành phần vách tế bào vi khuẩn Gram(+) và Gram (-): Thành phần Tỷ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn G+ G- Peptidoglycan Axit teicoic Lipid Protein 30-95 Cao Hầu như không Không hoặc ít 5-20 0 20 Cao Hình 1: Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn Lactic(Vi khuẩn Gram +) Màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, viết tắt là CM ) dày 7 – 8nm, có cấu tạo gồm 3 lớp: +Hai lớp phân tử protein (chiếm hơn 50% trọng lượng khô của màng và 10 – 20% protein tế bào), gồm có hai dạng: protein cấu trúc và enzyme. +Một lớp kép photpholipid (20 – 30% trọng lượng khô của màng), nằm ở giữa: một lớp có gốc photphat quay vào trong, một lớp có gốc photphat quay ra ngoài (mô hình khảm lỏng) làm màng hóa lỏng và cho phép các protein di động tự do. Khoảng 70 – 90% lipid của tế bào tập trung ở lớp photpholipid của màng. Chức năng chủ yếu của màng tế bào chất là tấm bình phong ngăn trở dòng các chất ra cũng như cho đi qua các hợp chất từ phía ngoài vào. Nó đảm bảo tế bào hấp thụ được các chất dinh dưỡng, các nguyên tố có lợi cho quá trình trao đổi chất. Màng tế bào chất chứa các enzyme sinh tổng hợp kiểm soát các khâu kết thúc tổng hợp lipid của màng và các hợp chất kiến tạo thành tế bào. Hình 2: Cấu trúc màng tế bào chất của vi khuẩn(theo Thuyết dòng khám) Vùng ưa nước Vùng kị nước Cuối cùng, màng tế bào chất là nơi định vị của nhiều enzyme tham gia tổng hợp ATP. Tế bào chất (Cytoplasm) là thành phần chính của tế bào vi khuẩn. Tế bào chất của vi khuẩn nhân nguyên nói chung, của vi khuẩn Lactic nói riêng gồm có 80 - 90% là nước, nước có thể ở trạng thái tự do (chiếm phần lớn) làm nhiệm vụ hòa tan các chất và tạo nên dung dịch keo với các chất cao phân tử. Nước ở trạng thái kết hợp (chiếm phần nhỏ) thường liên kết trong các vi cấu trúc như protein, lipid và hydratcarbon. Đây là vùng dịch thể dạng keo đồng nhất khi tế bào non và có cấu trúc phức tạp khi tế bào già. Nguyên sinh chất có hai bộ phận chính: +Cơ chất tương bào: dịch keo lỏng chủ yếu chứa các enzyme. +Các cơ quan con: mesosom, ribosom, không bào, hạt sắc tố, chất dự trữ. Mesosom là thể hình cầu, đường kính khoảng 250nm, gồm nhiều lớp bện chặt với nhau, nằm sát vách tế bào và chỉ xuất hiện khi tế bào phân chia. Hình 3: Cấu trúc của Mesosome Trong mesosom có nhiều hệ thống enzym vận chuyển điện tử. Hình 4: Cấu trúc của Ribosome Ribosom có đường kính 15 – 20nm, hằng số lắng 70S, (S là chữ đầu của Sverberg: Hệ số lắng, 1S = 10-13cm /giây trong siêu li tâm), trọng lượng phân tử 3.106 daltons. Mỗi ribosom, khi giảm nồng độ Mg2+ của dung dịch sẽ tách ra thành 2 tiểu phần trong siêu li tâm: tiểu phần lớn (50S) và tiểu phần nhỏ (30S). Ribosom chứa 40 – 60% ARN và 35 – 60% protein, một ít lipid, một số men như ribonuclease…và một ít chất khoáng giàu Mg và nghèo Ca. Mỗi tế bào chứa khoảng 10.000 ribosom, chiếm 40% trọng lượng khô tế bào. Ribosom là trung tâm tổng hợp protein của tế bào. Các chất dự trữ: +Các hạt hydrat cacbon: các hạt này chứa tinh bột hoặc glycogen hoặc các chất tương tự nắm trong tế bào chất như những chất dự trữ. H ình 5: L.acidophilus +Hạt volutin: đây là các chất dị nhiễm sắc. Volutin là một phức chất, cấu tạo bởi polyphotphat, lipoprotein, ARN và Mg+2… +Chất ức chế sự sinh trưởng của các vi sinh vật khác: Trong một vài vi khuẩn có thể chứa thêm một loại chất đặc biệt. Ví dụ như Lactobacillus acidophilus sản xuất axit lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột. Chất nhân (nuclear body) là nhân nguyên thủy chưa có màng nhân. Hình 6: Cấu trúc của thể nhân Chất nhân là một cấu trúc ADN kép, xoắn lại khép kín thành hình vòng tròn. NST của vi khuẩn có chiều dài thay đổi trong khoảng 0,25 - 3µm và chứa 6,6 - 13×106 cặp base nito, số lượng hệ gen của vi khuẩn thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy. Ngoài NST, nhiều vi khuẩn còn chứa ADN ngoài NST, đấy cũng là những sợi ADN kép, dạng vòng kín, có khả năng sao chép độc lập gọi là plasmid. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn Lactic. b) Đặc điểm chung: Vi khuẩn Lactic thuộc họ Steptococcaceae hay Lactobacillaceae và chúng được xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc. Chúng là những vi khuẩn Gram dương (G+), và trực khuẩn thường nhạy cảm hơn so với liên cầu khuẩn. H ình 7: Vi khuẩn lactic Hình 8: Lactococcus lactic Tất cả các vi khuẩn Lactic hầu hết không di động, không sinh bào tử (trừ Sporolactobacillus có khả năng hình thành nội bào tử khi gặp điều kiện môi trường khắc nghiệt). Để thu năng lượng chúng hoàn toàn phụ thuộc vào các hiđrat cacbon và tiết ra axit lactic (lactat). Khả năng sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu. Vì vậy, chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng (polyauxotrophie) đối với nhiều axit amin, đối với nhiều bazo nucleic, nhiều loại vitamin… Cho nên, vi khuẩn Lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao và một môi trường sinh trưởng phức tạp. Đồng thời, chúng cũng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các pophyrin, bình thường chúng không có cytocrom. Vi khuẩn Lactic lên men được monosacarit và disacarit, nhưng không phải tất cả các vi sinh vật này đều sử dụng được bất kỳ loại disacarit nào. Các vi khuẩn Lactic không lên men được tinh bột và các polysacarit khác (chỉ có loài L. delbruecki là đồng hóa được tinh bột). Một số khác sử dụng được pentoza và axit citric, mà chủ yếu là các vi khuẩn lên men lactic dị hình. Các vi khuẩn Lactic ngoài việc tạo thành axit lactic còn có một số loài tạo chất thơm (diaxetyl, axetoin, axit bay hơi…) như Streptococcus diaxetylactic. Đối lập với các Enterobacteriaceae là bọn cũng sản sinh axit lactic, chúng thuộc bọn lên men bắt buộc. Mặc dù vậy, các vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae có khả năng sinh trưởng khi có mặt oxi không khí. Chúng thuộc bọn kị khí song đồng thời cũng là bọn hiếu khí. Một vi khuẩn sinh trưởng hiếu khí mà không chứa catalase thì gần như chắc chắn đó là một vi khuẩn Lactic (trừ ngoại lệ Acetobacter peroxydans và Shigella dysenteriae). Nhóm vi khuẩn Lactic rất đa dạng (heterogene), gồm nhiều giống rất khác nhau. Riêng Lactococcus lactic gồm 6 loài; Lactobacillus gồm 40 loài. c) Cơ chế sinh trưởng: Các loài vi khuẩn Lactic có khả năng rất khác nhau để tạo thành axit trong môi trường và như vậy, sức chịu axit (hay độ bền với axit) của chúng cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành axit cao hơn (khoảng 2 – 3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4. Cầu khuẩn không thể phát triển được ở môi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH = 5,5 – 6. Khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn Lactic thuộc loại yếu. Không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucozo và các muối amon . Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin: riboflavin (Lactobacillus casei), tiamin (Lactobacillus fermenti), axit pantotenic (Leuconostoc mesenteroides), axit nicotinic (Lactobacillus arabinosus), axit folic (Streptococcus faecalis), biotin (Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides) và các axit amin. Vì thế người ta thường nuôi cấy chúng trên các môi trường phức tạp chứa một khối lượng tương đối lớn cao nấm men, dịch cà chua, dịch đường sữa hoặc thậm chí cả máu. Điều ngạc nhiên là một số vi khuẩn Lactic (và cả các vi khuẩn lên men khác) khi sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng chứa máu có thể tạo thành các xitocrom và thậm chí có thể tiến hành quá trình photphorin hóa chuỗi hô hấp. Vì vi khuẩn Lactic thiếu năng lực tổng hợp các pocphirin nên khi các pocphirin được bổ sung vào môi trường thì một số vi khuẩn Lactic có thể tạo thành các sắc tố hem tương ứng. Lactozo + H2O D-glucozo + D-galactozo β-Galactozidase Có thể cho rằng, do hậu quả của sự chuyên hóa sinh trưởng trong sữa hoặc trên những môi trường giàu chất dinh dưỡng và chất sinh trưởng, chúng đã mất đi khả năng tổng hợp nhiều chất trao đỗi. Trong khi đó chúng lại có khả năng mà đa số các vi khuẩn khác không có, đó là khả năng sử dụng đường lactozo. Lactozo là một đisaccarit, trước khi đi vào các con đường phân giải hexozo nó phải được phân cắt : Sau khi được photphorin hóa galactozo được chuyển thành glucozo + photphat. Để sinh trưởng bình thường,ngoài một nguồn cacbon, nito, một phần dưới dạng các axit min, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng…Do có sự sản sinh một lượng lớn lactat nên môi trường dinh dưỡng cần phải được trung hòa. Thường người ta dùng cacbonat canxi (CaCO3). Trên một môi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung cacbonat canxi có thể nhận ra sự tạo thành axit qua các vòng trong suốt bao quanh các khuẩn lạc. Có thể dùng phương pháp CaCO3 để nhận biết sự có mặt của vi khuẩn Lactic: Nuôi cấy vi khuẩn Lactic trong môi trường MRS có bổ sung CaCO3 (nuôi cấy trên đĩa thạch), nếu vi khuẩn này sinh ra axit lactic thì nó sẽ phân giải được CaCO3 theo phương trình: 2H+  + CO32- CO2 + H2O Dựa vào sự biến đổi về màu sắc trên đĩa thạch mà người ta đánh giá được khả năng sinh axit lactic của vi khuẩn đó. Môi trường MRS: (Môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn Lactic): Casein peptone, tryptic digest 10.00 g Cao thịt (Meat extract) 10.00 g Cao nấm men (Yeast extract) 5.00 g Glucose 20.00 g Tween 80 1.00 g K2HPO4 2.00 g CH3CO2Na (Acetat Natrium) 5.00 g (NH4)2 citrate (Citrat ammonium) 2.00 g MgSO4 x 7 H2O 0.20 g MnSO4 x H2O 0.05 g Nước cất 1000.00 ml Điều chỉnh sao cho pH khoảng 6.2 - 6.5. 1 : Vi khuẩn Lactic 2 : Axit lactic phân giải CaCO3 (có màu xanh) 3 : Môi trường MRS có bổ sung CaCO3 (có màu vàng) 4 : Đĩa thạch Hình 8: Khả năng phân giải CaCO3 của các vi khuẩn sinh axit lactic Từ trên ta thấy, hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sự tổng hợp các axit amin. Chẳng hạn nhiều vi khuẩn Lactic cần bổ sung axit aspactic khi sinh trưởng trong một môi trường thiếu biotin. Song trong một môi trường giàu biotin, các vi khuẩn này không đòi hỏi axit aspactic nữa. Mối tương quan tương tự cũng gặp giữa axit folic và serin. Vitamin B6 – một vitamin rất quan trọng trong sự sinh tổng hợp các axit amin ở các vi khuẩn Lactic – cũng có thể được thay thế bởi một axit amin khác. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng lòai vi khuẩn Lactic. Đối với nhiều lòai vi khuẩn Lactic, nhiều lọai vitamin vẫn được coi là các axit amin không thể thay thế, tức là buộc phải có mặt trong môi trường. Các peptic và các amit cũng có thể được dùng làm nguồn nitơ và trong nhiều trường hợp các hợp chất này mang đặc tính của các nhân tố sinh trưởng. Tốc độ sinh trưởng khi có mặt chúng có thể tăng gấp nhiều lần so với khi có mặt các axit amin tự do. Sự phụ thuộc của tốc độ sinh trưởng vào nồng độ các vitamin có thể được sử dụng cho phép dịnh lượng các vitamin này nhờ vi sinh vật. Những phép thử này thường rất nhạy . Phương pháp: trong một giới hạn nồng độ nhất định, tốc độ sinh trưởng của các vi khuẩn tỷ lệ thuận với nồng độ của nhân tố sinh trưởng, do vậy bằng cách xác định sinh trưởng (đo nồng độ tế bào) có thể suy ra nồng độ của chất sinh trưởng.Người ta đã dùng phương pháp này để định lượng hàm lượng của axit folic trong cao nấm men nhờ Lactobacillus casei trong môi trường tổng hợp chứa một dung dịch cơ sở (B) có bổ sung các thành phần khác như riboflavin và piridoxal. Trong công nghiệp sản xuất axit lactic và các loại lactat, người ta thường sử dụng loài Lactobacillus delbrueckii và loài Lactobacillus coagulans, thuộc vi khuẩn ưa nhiệt và có khả năng tích lũy nhiều axit lactic. Ngoài nguồn cacbon (đường, rỉ đường, dịch thủy phân tinh bột, dịch thủy phân inulin) cần sử dụng một số nguồn thức ăn bổ sung chứa đạm nito và các loại chất sinh trưởng (mầm đại mạch, cám, cao ngô…) với tỷ lệ thích hợp. Quá trình lên men được thực hiện thích hợp ở 48 – 500C trong 5 – 7 ngày với tỷ lệ môi trường là: nồng độ đường: 10 – 15%; lượng CaCO3 sử dụng là: 10%; mầm đại mạch: 0,375%; photphat amon: 0,25%. Nguồn nguyên liệu ban đầu là các chất có chứa tinh bột hoặc đường.Các nguyên liệu chứa tinh bột trước hết phải được phân giải bằng enzym hoặc bằng axit. Nếu nguồn nguyên liệu ban đầu là dịch đường sữa thì nên dùng Lactobacillus bulgaricus vì khả năng lên men lactozo của nó có hiệu quả hơn cả. Gần đây, người ta phát hiện ra rằng 1,2-propandiol có thể được sử dụng làm nguồn cacbon cho quá trình sản xuất axit lactic, nhưng chỉ với các chủng Arthrobacter oxidans, Alcaligenes faecalis hay Fusarium solani. Đây là một quá trình hiếu khí được thực hiện ở 25 – 370C trong môi trường chứa 3% 1,2-propandiol; 0,4% ure; 0,1% K2HPO4; 0,05% MgSO4.7H2O; 0,05% KCl; 0,001% FeSO4.7H2O; 0,05% cao nấm men, quá trình bắt đầu ở pH = 7 – 9. Vi khuẩn Lactic có hoạt tính protease: phân hủy được protein của sữa tới peptit và axit min. Hoạt tính này ở các loài là khác nhau, thường trực khuẩn là cao hơn. Vi khuẩn Lactic chịu được ở trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều loài vẫn sống được trong môi trường có 10 -15% cồn hoặc cao hơn; một số trực khuẩn bền với NaCl (7 – 10%). Các vi khuẩn Lactic có khoảng nhiệt độ sinh trưởng tương đối rộng: ở 28 – 320C (L.casei, L.plantarum, L.leichmanii, L. brevis, L.buchneri…); ở 35 – 400C (L. fermenti); ở 37 – 450C (L. causasicus, L. lactic, L.acidophilus…). Các loài ưa nhiệt – có nhiệt độ tối thích là 45 - 620C (L. bulgaricus, L. thermophilus, L. delbrueckii…); các loài ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (50C hoặc thấp hơn). Khi gia nhiệt tới 60 – 800C hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Một số loại có khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác lại có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy, ngoài khả năng tạo thành axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh (người ta gọi các hợp chất này là bacterioxin). Những chất kháng sinh này không dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm có hiệu quả khả quan. Trong tự nhiên vi khuẩn Lactic thường gặp ở trong đất, trong không khí, trong nước, nhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm (trên các loại quả, rau, sữa, thịt…). Có một số giống của vi khuẩn này thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật. Các dạng cầu khuẩn đường ruột được gọi là Enterococus (hoặc Streptococus fecalis). d) Phân loại : Phân loại vi khuẩn Lactic được coi là chưa hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật sinh axit lactic đều thuộc về họ lactobacillaceae và được xếp vào bốn chi:Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus và Bifidobacterium. Ngày nay người ta bổ sung vào nhóm vi khuẩn lactic những vi khuẩn Bifidobacterium. Vi khuẩn Lactic được chia làm 2 loại: các vi khuẩn lên men đồng hình và các vi khuẩn lên men dị hình. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85-95% axit lactic. Do thiếu porphyrin và cytocrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu thiếu năng lượng bằng con đường lên men bắt buộc. Nhóm vi khuẩn này gồm có các cầu khuẩn Streptococcus lactis,Streptococcus cremoris và các trực khuẩn Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum,Lactobacilus bulgaricus… Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh khoảng 50% axit lactic. Nhóm vi khuẩn này gồm có các vi khuẩn sinh hương Streptococcus votrovorus, Streptococcus paracotrovorus, Streptococcus diacetylactis, trực khuẩn Betabacterium… Thành phần AND cho ta biết tính gần gũi của