Đề tài Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng

enzyme. Việc sản xuất enzyme từ các nguồn động, thực vật và vi sinh vật có vai trò quan trọng vì được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp và đời sống, đặc biệt có thể giúp cải tiến được nhiều quy trình chế biến, nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, rút ngắn thời gian sản xuất và đáp ứng được những nhu cầu như an toàn sinh học, không gây bệnh đối với người. Một trong những enzyme quan trọng trong cuộc sống đó là enzyme Bromelain nó được ứng dụng trong công nghiệp, thực phẩm và quan trọng nhất là trong y dược. Với những đặc điểm và tầm quan trọng của enzyme Bromelain Đề tài “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” được thực hiện nhằm ly trích và giúp hiểu được tầm quan trọng của enzyme Bromelain trong cuộc sống. CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, có nguồn gốc ở Nam Mỹ (Brazil, Argentina, Paraguay), hiện ở những vùng này vẫn có thể tìm thấy nhiều giống dứa hoang dại. Hiện nay trên thế giới, cây dứa được trồng hầu hết ở các nước trừ ở Châu Âu. Các nơi trồng nhiều như là: Hawaii, Brazil, Philipines, Thailand…Ở nước ta, dứa trồng từ Bắc đến Nam, diện tích trồng cả nước khoảng 40.000 ha với sản lượng khoảng 500.000 tấn, trong đó 90% ở khu vực phía Nam. Các tỉnh trồng dứa nhiều ở miền Nam là Kiên Giang, Tiền Giang, Cà Mau…miền Bắc có Thanh Hóa, Tuyên Quang, Phú Thọ…miền Trung có Nghệ An, Quảng Nam… Trên thế giới có khoảng 60-70 giống dứa và được chia thành 7 nhóm, trong đó có 3 nhóm trồng phổ biến là nhóm Cayenne, nhóm Queen và nhóm Spanish. - Nhóm Cayenne là nhóm dứa trồng phổ biến nhất trên thế giới, chiếm khoảng 80% diện tích. Ở nước ta mới trồng ở một số ít nơi như Vĩnh Phúc, Nghệ An, Lâm Đồng. Dứa thuộc nhóm này có quả lớn nhất, mắt phẳng và nông. Thịt quả kém vàng, nhiều nước, ít ngọt và kém thơm hơn dứa Queen. - Nhóm Queen còn gọi là dứa Hoàng Hậu, dứa hoa, dứa tây. Đây là nhóm dứa trồng phổ biến nhất ở nước ta hiện nay, với các giống dứa tây, giống dứa Na Hoa ở phía Bắc, các giống Queen Long An, Kiên Giang ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (còn gọi là khóm hoặc thơm). Dứa thuộc nhóm này có quả tương đối nhỏ, mắt lồi. Thịt quả vàng đậm, giòn, hương thơm, vị chua và ngọt lâu. Nhóm này có chất lượng cao nhất, trên thế giới thường dùng để ăn tươi. - Nhóm Spanish còn gọi là dứa Tây Ban Nha, dứa ta. Nhóm này được trồng ở Thailand, Cuba… Quả dứa thuộc nhóm này lớn hơn dứa Queen, mắt sâu. Thịt quả vàng nhạt, có chỗ trắng, vị chua ít thơm nhưng nhiều nước hơn dứa hoa. Dứa nhóm này chịu bóng râm, ít dập nát khi vận chuyển và hàm lượng đường thấp nên không được phát triển. 1.2 Enzyme - Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất mà ngừng lại thì sự sống sẽ không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. - Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học. - Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong các lĩnh vực khác như: công nghệ chế biến thực phẩm, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen vào bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong y học với ứng dụng sản xuất dược phẩm. 1.2.1 Phân loại - Ngày nay ngày càng nhiều enzyme mới được phát hiện, và để thống nhất tên gọi enzyme người ta đã phân tất cả enzyme làm 6 loại: Oxidoreductase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hoá khử. Transferase: là nhóm enzyme xúc tác phản ứng chuyển vị một nhóm (gốc) nào đó từ chất này sang chất khác. Hydrolase: là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (phản ứng cắt có sự tham gia của nước). Lyase: là nhóm các enzyme xúc tác quá trình phân cắt một nhóm nào đó ra khỏi hợp chất mà không có sự tham gia của nước. Izomerase: là nhóm enzyme xúc tác sự đồng phân hoá, chuyển dạng đồng phân này sang dạng đồng phân khác. Ligase: là nhóm enzyme xúc tác sự tổng hợp chất hữu cơ nhờ năng lượng ATP và các chất tương tự. 1.3 Enzyme Bromelain - Bromelain là protein-enzyme có nhiều trong quả dứa và có một ít trong quả chuối, enzyme này được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỷ 20. Ở nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968 -1970. - Bromelain là nhóm protease thực vật có mã số EC-3.4.22.33 được thu nhận từ họ bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. Ở mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau. - Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide [5]. - Thành phần chủ yếu của bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein. Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfurhydryl của bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro [1]. 1.3.1 Cấu tạo hoá học - Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose [1]. - Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của bromelain thân có acid amin đầu –NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với bromelain quả, acid amin đầu –NH2 là alanine [1]. Hình 1.1: Cấu trúc sợi hydrate carbon của bromelain 1.3.2 Cấu trúc không gian - Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau: - Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp - - Gly – Cys – Lys - - Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối - S – S -. Phân tử có dạng hình cầu do có cách sắp xếp phức tạp. - Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfurhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite. Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn 2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc không gian của enzyme. 1.3.3 Tính chất vật lí - Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau: Bảng 1.1 Những tính chất vật lý của bromelain thân Tính chất Ký hiệu Số liệu Hằng số sa lắng S (s) 2.73 Hằng số khuếch tán D (cm2 / s) 7.77 x 10 -7 Thể tích riêng phần V (ml/g) 0.743 Độ nhớt bên trong [ I ] (dl/g) 0.039 Tỷ số ma sát f / fo 1.26 Điểm đẳng điện pI 9.55 Sự hấp thu A1%cm ở 280nm 20.1 Trọng lượng phân tử 32.000 * 32.100 ** 35.500 *** * : Tính bằng phương pháp sa lắng - khuếch tán ** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong *** : Tính bằng phương pháp Archibald 1.3.4 Hoạt tính của bromelain a. Hoạt tính phân giải - Bromelain có 3 hoạt tính: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain trong đu đủ và ficin trong cây thuộc họ Sung[1]. - Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelain. Bảng 1.2: Hoạt tính phân giải casein của bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải casein ( UI/mg) Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelain quả chín Casein 7.4 4.0 3.0 - Đối với cơ chất là casein, hoạt tính phân giải của bromelain thân cao hơn trong quả xanh và quả chín. - Khả năng phân giải các cơ chất nhân tạo của bromelain. Bảng 1.3 Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide (BAA) của bromelain Cơ chất Hoạt tính phân giải BAA ( UI/mg) Bromelain thân Bromelain quả xanh Bromelian quả chín BAA 3.7 9.1 7.2 - Qua bảng trên ta thấy bromelain quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelain thân và quả chín. b. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain - Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch, phương pháp tinh khiết... - Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như: bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của các chất hoạt hóa… Ảnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, pH tối thích của bromelain không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch enzyme…Ví dụ: Khi thu thập bromelain thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là (NH4)2SO4 thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH = 4.8, ổn định ở pH = 4.6 - 5.4. Bromelain đã được tinh sạch một phần có hoạt tính cao nhất ở pH = 6.0 và pH = 8.0, ổn định ở pH = 3.5 – 5.6 với nhiệt độ 63ºC. Bromelain có biên độ pH rộng (3 -10), tốt nhất là pH = 5 – 8 tuỳ thuộc vào cơ chất. Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelain có hoạt tính khác nhau. Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelain tương tự như papain. Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA (Benzoyl-L-Arginine amide), BAEE (Benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thuỷ giải của bromelain yếu hơn papain. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ ít nhiều ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme. Ví dụ: Ở dịch chiết quả dứa (pH = 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60ºC thì bromelain vẫn còn hoạt tính nhưng nếu tăng cao quá thì bromelain sẽ mất hoạt tính. Ở 5ºC, pH = 4 - 10 thì enzyme giữ hoạt tính tối đa trên casein trong 24h. Ở 55ºC, pH = 6.1 thì enzyme mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút. Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúng gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme. Chẳng hạn muối thuỷ ngân có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme bromelain và mức độ kìm hãm tuỳ thuộc vào nồng độ của muối. CHƯƠNG 2 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA ENZYME BROMELAIN - Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng ngàn chế phẩm enzyme bán trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… - Chế phẩm enzyme không chỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như trong công nghiệp thực phẩm, dệt may, thuộc da… 2.1 Ứng dụng trong y dược - Enzyme có một vị trí quan trọng trong y học. Đặc biệt là các phương pháp định lượng và định tính enzyme trong hóa học lâm sàng và phòng thí nghiệm chẩn đoán. Do đó, hiện nay trong y học đã xuất hiện lĩnh vực mới gọi là chẩn đoán enzyme, có nhiệm vụ: Phân tích xác định nồng độ cơ chất như glucose, ure, cholesterol… với sự hỗ trợ của enzyme. Xác định hoạt tính xúc tác của enzyme trong mẫu sinh vật. Xác định nồng độ cơ chất với sự hỗ trợ của thuốc thử enzyme đánh dấu. - Ngoài ra còn dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc tắc nghẽn tim mạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc tăng tiêu hóa protein, thành phần của các loại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm… - Trong y học các protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc… Ngoài ra người ta còn dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. 2.1.1 Bromelain giảm thiểu viêm xoang - Ở Đức, trẻ em bị viêm xoang thường được chữa trị bằng bromelain chiết xuất từ dứa, và thấy cho kết quả tốt, nó làm giảm thời gian trị bệnh (từ 8 ngày xuống còn 6 ngày) - Bromelain còn được dùng làm thuốc tấy giun, một loại giun nhỏ thường gặp ở trẻ em. Qua nghiên cứu của Hordegen.P thì bromelain cũng cho kết quả tốt như pyratel. 2.1.2 Bromelain làm liền sẹo Enzyme Bromelain có tác dụng làm mau lành các vết thương ở da hay các vết phỏng. Một số thí nghiệm cho thấy, ở chuột bị phỏng, chất chiết xuất bromelain từ dứa giúp tiến trình làm sạch một vết thương chỉ sau 4h, lấy đi các vật lạ và mô chết để không còn trở ngại nào cho quá trình làm lành vết thương. 2.1.3 Bromelain giảm đau nhức do hư khớp - Ở Đức, trên thị trường có một sản phẩm chứa 90mg bromelain, 48mg trysin (enzyme nguồn động vật) và 100mg rutin (một flavonoid bảo vệ mao mạch) - Thử nghiệm nhằm so sánh sản phẩm này trong 6 tuần trên 90 người bị hư khớp háng với diclofenac (100mg/ngày). Và kết quả điều trị tốt như diclofenac về đau nhức do hư khớp, không có tác dụng phụ. 2.1.4 Bromelain làm tăng hệ miễn dịch Bromelain làm tăng hệ miễn dịch giúp cho người bị ung thư (phổi, bàng quang, vú, buồng trứng…) giảm được hiện tượng di căn. Đồng thời bromelain còn ức chế quá trình viêm, làm giảm hiện tượng phù nề và tụ huyết, cũng như giảm đau nhức. Do đó, các chuyên gia y tế đề nghị sử dụng bromelain như chất làm giảm đau, kháng viêm và kháng sưng. Hiệu quả của bromelain là làm giảm lượng prostaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua mô bằng cách ngăn cản những tiền chất gây viêm. 2.1.5 Bromelain và bệnh hen suyễn Bromelain phối hợp với các thuốc kháng sinh trong điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn sẽ làm tăng hiệu quả kháng sinh, phối hợp với một số thuốc điều trị hen (theophyllin, ephedrin...) làm tăng tác dụng chống hen. Mới đây, một số nghiên cứu đăng trên tạp chí y học Anh cho biết, qua thử nghiệm trên chuột, các nhà khoa học đã nhận thấy bromelain làm giảm hơn 50% dấu hiệu viêm phổi đối với bệnh hen. 2.1.6 Bromelain và HIV Trong quá trình sinh sản trong tế bào người bệnh, virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV) cần một enzyme hoạt hóa protease (protein-digesting enzymes) để sao chép ngược để cô đọng nhân protein để nhân bội virus. Thuốc điều trị HIV/AIDS theo cơ chế ức chế protein-digesting enzymes này gọi là protease inhibitor hay anti-protease khá hữu hiệu nhưng rất đắc tiền và cũng gây nhiều phản ứng phụ. Các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế protease HIV và đã tìm thấy 19 hợp chất thiên nhiên có tác dụng tương tự thuốc anti protease, trong đó bromelain trong dứa được coi là có giá trị nhất và có thể ăn, uống để điều trị HIV/AIDS. 2.2 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 2.2.1 Bromelain làm mềm thịt  Enzyme Bromelain: có tác dụng thủy phân chất đạm, nghĩa là nó phân cắt protein thành các acid amin dễ tiêu hóa. Để cho thịt bò, thịt trâu… trở nên mềm thường phải nấu sôi hàng giờ. Nhưng nếu trước khi nấu ta ướp (trộn) thịt với thơm bằm (hay đu đủ bằm) độ 20-30 phút thì chỉ cần nấu lửa riu riu cho đến sôi lên là thịt mềm ngay rất dễ tiêu hóa hấp thu.... 2.2.2 Bromelain sử dụng trong quá trình đông tụ sữa Để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta thường dùng renin. Renin là enzyme làm đông tụ sữa truyền thống. Tuy nhiên, lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong sản xuất sữa. Gần đây người ta sử dụng enzyme thực vật vào trong chế biến sữa và đang được nghiên cứu. Trong đó, enzyme Bromelain đang được quan tâm với mục đích này. 2.2.3 Bromelain trong chế biến thủy sản Trong sản xuất nước mắm thì thời gian chế biến thường dài và hiệu suất thủy phân độ đạm không cao nên hiện nay người ta chú ý đến qui trình sản xuất nước mắm ngắn ngày có enzyme Bromelain sẽ giúp thời gian sản xuất nước mắm được giảm bớt và cải thiện được hương vị của nước mắm. 2.3 Ứng dụng trong công nghiệp dệt may Trong sản xuất tơ tằm, người ta dùng protease để làm sạch sợi tơ. Với công đoạn xử lý bằng enzyme sau khi xử lý bằng dung dịch xà phòng sẽ giúp lụa có tính đàn hồi tốt, bắt màu đồng đều và dễ trang trí trên lụa. 2.4 Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da Trong công nghiệp da, enzyme được dùng để làm mềm da, làm sạch da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường. Việc xử lý đã được tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịch enzyme lên bề mặt da. Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liên kết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn. Thực tế cho thấy khi xử lý da bằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm và tách lông xuống nhiều lần. Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn khi cắt. 2.5 Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protease Bromelain dùng để thu nhận các chất ức chế protein có chứa nhóm –SH. Các chất ức chế này được sử dụng nhiều trong công nghiệp và y tế. 2.6 Ứng dụng làm thực phẩm chức năng Bromelain kết hợp với Curcumin (chiết suất từ củ nghệ vàng) điều chế thành thực phẩm chức năng an toàn Brocurma C-B có tác dụng tăng cường miễn dịch và khảng năng đề kháng của cơ thể, tăng khả năng phòng một số bệnh đồng thời hỗ trợ trong điều trị các bệnh nan y, hiểm nghèo nhờ hoạt tính sinh học cộng hưởng của Curcumin-Bromelain. Sản phẩm rất đặc hiệu đối với bệnh viêm dạ dày, đại tràng. Có chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số: 919/2006/YT-CNTC do Cục An Toàn vệ sinh thực phẩm – Bộ Y Tế cấp ngày 05/4/2006. Một số Enzyme Bromelain thương mại Hình 2.1 Dược phẩm Bromelain có hoạt lực cao (1200 gdu/g hay 1800 mcu/g) Hình 2.2 Dược phẩm chứa hàm lượng Bromelin cao Hình 2.3 Thực phẩm chức năng gồm tinh chất Bromelain và Curcumin Hình 2.4 Quercetin & Bromelain: Thuốc trị bệnh Gút Hình 2.5 Medizym: chống viêm, liền sẹo Hình 2.6 Dứa Enzyme Complex - 800 GDU CHƯƠNG 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN 3.1 Các phương pháp thu nhận enzyme Bromelain 3.1.1 Phương pháp siêu lọc - Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách phân đoạn các thành phẩm trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng. - Dung dịch enzyme thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau. Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại trừ các chất bẩn. Sau đó chuyển sang phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được các chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein, enzyme và đồng thời cô đặc được enzyme. Chất rắn - Màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi rỗng. Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều lỗ rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành những lỗ để các chất thấm qua. Các sợi này được chế tạo từ các lọai polime bền như fluoropolime (FS: Fluorosurfactant), Cenlulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sử dụng lọai màng thích hợp. Ví dụ: cô đặc protein (dùng màng FS, GR); Cô đặc enzyme (dùng màng GR). Dịch học Vật liệu học Hình 3.1: Lọc cross - flow a. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc - Nhiệt độ: Nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng. Khi chọn nhiệt độ sử dụng cần lưu y đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá tình siêu lọc vì quá trình này có thể làm kín màng. - Áp suất: Thường tốc độ của dòng chảy (số lít chất lỏng qua 1m2 màng trong 1h) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị (tốc độ) cực đại. Nếu áp suất tăng lên cao hơn nữa thì dòng chảy sẽ giảm. Người ta đề nghị tốc độ dòng chảy nên được điều chỉnh từ 4 - 5 lít/phút, tương ứng với hiệu suất PI1 - PI2 ở trong khoảng 0.5 - 3bar. Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1max) là 7bar (tương đương 102Psi), áp suất dòng ra nhỏ nhất (PI2min) là 0.5bar (tương đương 7.25Psi). b. Các kiểu siêu lọc : có ba kiểu hệ thống siêu lọc - Kiểu một bước (single pas operation) Hình 3.2: Kiểu một bước - Kiểu lô (batch operation): Chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ của dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu . Hình 3.3: Kiểu lô - Kiểu thể tích không đổi (constant volume operation): Dòng chất lỏng được cung cấp liên tục để thể tích ở trong chậu chứa không thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nồng độ dung dịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu. Hình 3.4: Kiểu thể tích không đổi c. Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc - Có thể lựa chọn màng thích hợp với từng mục đích cụ thể. - Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính. - Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme. Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch của enzyme càng cao. - Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do đó nhiệt độ 10 - 20ºC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất cao mà không làm mất hoạt tính enzyme. Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ở nhiệt độ thấp (5ºC). 3.1.2 Phương pháp kết tủa - Nguyên tắc: Dựa trên tính hoà tan. Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH = 7 do đó trong điều kiện sinh lý, các phân tử protein có thừa điện tích âm đã kết hợp với các đầu mang điện tích dương của phân tử nước lưỡng cực, cũng như các ion dương khác có trong dung dịch. Sự kết hợp với nước tạo ra một lớp nước bao quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa của chúng và để có thể kết tủa được các enzyme thì ta nhất thiết phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch các dung môi hoặc các hoá chất ưa nước có ái lực mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó, giúp cho protein tủa xuống. - Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelain. Bromelain trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ, do đó để sự kết tủa đạt hiệu quả cao thường tiến hành trong điều kiện lạnh. Như vậy dịch dứa phải được làm lạnh ở 0ºC đến 4ºC và acetone tinh khiết ở - 20ºC. Ethanol cũng được sử dụng để làm kết tủa bromelain và cũng phải giữ ở nhiệt độ thấp. Sau khi thu được kết tủa, tủa bromelain phải rửa bằng acetone và làm khô thật nhanh để bromelain không bị biến tính. - Thông thường những yếu tố chính có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng của chế phẩm enzyme đó là: Nồng độ của tác nhân kết tủa pH của dịch chiết Nhiệt độ kết tủa Thời gian tiếp xúc của tác nhân và dịch chiết Ngoài ra, ta còn sử dụng ammonium sulfate. Sự kết tủa với tác nhân này là một quá trình thuận nghịch và có thể thực hiện ở nhiệt độ thường. Do có những ưu điểm như vậy nên tác nhân ammonium sulfate thường được dùng để kết tủa bromelain thu về chế phẩm enzyme thô. - Hiện nay người ta kết tủa enzyme bromelain bằng CMC (carboxyl methyl cellulose) do enzyme thu được có độ tinh khiết cao, thời gian đợi kết tủa ngắn và tiến hành thuận lợi hơn. - Quá trình tạo ra CMC [4]: Carboxylmethylcellulose ClCH2COOH NaOH (CMC) Vải màn Alkalicellulose - Quy trình thu nhận enzyme Bromelain. Xay nhuyễn Rửa sạch Bã Dịch ép Ly tâm Ly tâm lạnh Kết tủa Bromelain Sấy đông khô Lọc Dịch ly tâm Tác nhân kết tủa Enzyme Bromelain Dứa Hình 3.5: Quy trình thu nhận enzyme Bromelain Mô tả sơ đồ : Thân, chồi và quả của trái dứa sẽ được rửa sạch sau đó tiến hành đem xay nhuyễn những phần đó thu được hệ huyền phù. Đem lọc sẽ thu được dịch ép, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút sẽ thu được dịch ly tâm, khi đó sẽ cho tác nhân kết tủa (acetone tinh khiết -20°C, ethanol -4°C hoặc ammonium sulfate 70% bão hòa) vào dung dịch trên để làm kết tủa enzyme Bromelain với thời gian 30 phút rồi tiến hành ly tâm lạnh 6000 vòng/phút trong 20 phút thu được kết tủa enzyme này cuối cùng đem sấy đông khô sẽ được enzyme Bromelain thô. 3.1.3 Phương pháp hấp phụ Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzyme như kaolin hay bentonite để hấp phụ bromelain. Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt, kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều. Một lí do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH- và O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với chất bị hấp phụ. Hình 3.6: Cấu tạo của kaolin 3.2 Các phương pháp tinh sạch enzyme Bromelain 3.2.1 Phương pháp thẩm tích Tiến hành: - Cân 1g enzyme thô. - Dung dịch đệm sử dụng là 10ml dung dịch Na3PO4 0,03M có pH = 7.2. - Cho protein vào túi cellophane rồi tiến hành thẩm tích trong 6h và cứ sau 2h thay thế dung dịch đệm bên ngoài 1 lần. Dung dịch đệm phía ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 máy khuấy từ, cuối cùng thu được enzyme trong túi. 3.2.2 Phương pháp lọc Sephadex G-50 Ta đem cân 100mg enzyme thô hòa tan vào 1ml dung dịch đệm Na3PO4 0,03M, pH = 7.2. Khi enzyme đã hoà tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột. Cho dung môi phân ly enzyme q