Đề tài Trích ly collagen từ da cá basa

và chất lượng fillet cá Basa. Thức ăn cho cá phải đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng phù hợp cho từng giai đoạn phát triển của cá. Ảnh hưởng của môi trường Các yếu tố nhiệt độ, hàm lượng oxy hòa tan trong nước, pH, mật độ nuôi... đều có ảnh hưởng đến sự phát triển và chất lượng cá. Giá trị thực phẩm của cá Basa Cá Basa không chỉ cung cấp nguồn thực phẩm cho con người, mà nó còn có thể được xem là một loài cá đặc sản của vùng sông nước đồng bằng sông Cửu Long vì có cơ thịt mềm mại, đặc biệt có hương vị riêng được thị trường trong và ngoài nước rất ưa chuộng, nhất là thị trường Mỹ. Cá Basa là loài cá có giá trị kinh tế cao hiện nay của Việt Nam và có khả năng cạnh tranh được với loài cá nheo của Mỹ. Tuy là loài cá quen thuộc, có giá trị... nhưng những nghiên cứu đã có về loài cá này chủ yếu tập trung các đặc điểm sinh lý, sinh thái phục vụ cho việc nuôi trồng và đánh bắt, còn những nghiên cứu có tính hệ thống về đặc tính kỹ thuật và giá trị dinh dưỡng còn rất ít, nhất là các nghiên cứu sử dụng các thành phần khác của cá Basa như mỡ cá, dầu cá... GS.TSKH Nguyễn Văn Thoa và các cộng tác viên của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã thực hiện nghiên cứu về các đặc tính kỹ thuật của cá Basa như fillet, da, mỡ lá...; giá trị thực phẩm của cá Basa như protein, lipid, ẩm, khoáng... nhưng là số liệu trung bình chung cho cá Basa. Các nghiên cứu về việc chế biến các thành phần có giá trị khác của cá Basa chưa được quan tâm nhiều, nhất là việc tận dụng thành phần mỡ cá. Viện Thủy sản II và Phân viện Công nghệ Thực phẩm tại Tp.Hồ Chí Minh đã nghiên cứu về thành phần các acid béo trong mỡ cá Basa, tìm cách chế biến mỡ cá Basa thành chất béo đủ tiêu chuẩn dùng trong thực phẩm. Tuy nhiên, quá trình tinh chế thực hiện chủ yếu bằng phương pháp hóa học theo quy trình công nghệ tinh luyện cơ bản. Tất cả nghiên cứu đều mang tính thăm dò, thử nghiệm... nhằm tìm ra các giải pháp tối ưu cho việc sử dụng các thành phần khác của cá Basa ngoài thành phần rất có giá trị là fillet cá. Trong thời gian gần đây, các công trình nghiên cứu của PGS.TS Hoàng Đức Như đã cho thấy trong mỡ cá Basa có sự hiện diện của DHA (decosa hexanenoic acid), một acid béo không no gồm 22 nguyên tử cacbon, 6 nối đôi, chuỗi cacbon mạch dài, thẳng... rất cần thiết cho sự phát triển của hệ thần kinh trung ương, phát triển thông minh, phát triển não bộ và võng mạc của thai nhi. Vì vậy, bên cạnh việc khai thác hiệu quả nguồn thịt cá, cần tập trung nghiên cứu để sử dụng hiệu quả nguồn mỡ cá. Cụ thể là nghiên cứu dùng các phương pháp tinh luyện phù hợp để khắc phục các nhược điểm vốn có của mỡ cá Basa như có mùi tanh và chóng ôi... nhằm biến mỡ cá Basa thành môt nguồn chất béo có thể sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, đời sống. Đây cũng chính là mục tiêu của các nhà nghiên cứu là muốn thử nghiệm phương pháp tinh luyện vật lý đối với mỡ cá Basa để loại trừ các acid béo tự do, các hợp chất peroxyde... nhằm đảm bảo cho mỡ cá thỏa mãn các chỉ tiêu về dầu mỡ thực phẩm. Bên cạnh đó, việc khử mùi tanh của mỡ cá cũng là vấn đề được tập trung nghiên cứu vì mùi tanh tự nhiên của cá gây cản trở rất lớn cho quá trình sử dụng trong thực phẩm. Các biện pháp bảo quản nhằm kéo dài thời gian trở mùi, ôi hóa của mỡ cá cũng được tiến hành nghiên cứu để đảm bảo cho mỡ cá có thể sử dụng trong một thời gian tương đối dài. Các sản phẩm được chế biến từ cá Basa Nguồn cá Basa trong tự nhiên không thể đủ để cung cấp cho chế biến công nghiệp mà chủ yếu là nguồn cá được nuôi trong lồng bè. Cá Basa thường được sử dụng để: Nấu chua, nấu lẩu trong các nhà hàng, khách sạn.. ít được tiêu thụ phổ biến trong gia đình vì giá tương đối cao. Chế biến công nghiệp: cá Basa thường được chế biến dạng fillet đông lạnh là chính và chủ yếu phục vụ cho thị trường xuất khẩu. Ngoài sản phẩm fillet đông lạnh, các sản phẩm khác chế biến từ cá Basa có mặt trên thị trường trước đây còn rất ít, có lẽ do quy trình kỹ thuật chưa được hoàn thiện để tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu của người tiêu thụ. Tuy nhiên, với việc ngày càng chú trọng mỡ rộng thị trường tiêu thụ nội địa nên các sản phẩm được chế biến từ cá Basa đã được đầu tư nghiên cứu và phát triển rất nhanh trong giai đoạn gần nay. Vừa qua, tại hội chợ thuỷ sản Việt Nam năm 2003, công ty Agifish An Giang (công ty xuất khẩu cá da trơn lớn nhất của Việt Nam) đã giới thiệu một loạt các sản phẩm mới được chế biến từ cá Basa như : - Dạng món ăn khai vị: cá viên Basa, cháo Basa, cháo mực Basa, chả giò Basa, chả quế Basa, bánh khoai moan nhân Basa, Basa bánh tròn tẩm bột, nấm đông cô nhân Basa, Basa cắt sợi tẩm bột, bánh chỉ Basa, hoành thánh Basa … - Dạng món ăn gia đình chế biến sẵn: cá Basa kho tộ, Basa fillet sốt cà, Basa cắt khoanh muối sả ớt, cà chua dồn Basa, khổ qua dồn Basa, ốc bươu nhồi Basa, vây cá Basa tẩm gia vị, bong bóng cá Basa tẩm gia vị, da cá Basa tẩm gia vị … - Dạng món ăn tự chế biến: Basa cắt khoanh, lẩu Basa, Basa fillet, Basa lột da rút xương, Basa xiên que, bao tử Basa, hải sản thập cẩm, chả thát lát … - Dạng sản phẩm khô: Basa nguyên con sấy khô, khô Basa, khô Basa ăn liền, chà bông Basa, lạp xưởng Basa, bánh phồng Basa … Hiện nay tình hình thị trường xuất khẩu cá Basa, cá tra Việt Nam vẫn chưa được ổn định. Vì thế cần điều chỉnh lại mục tiêu để ổn định ngành nghề và phát triển nghề nuôi loại cá này của Việt Nam. Nuôi cá Basa và cá tra trước hết dành cho xuất khẩu, nhưng đã đến lúc cần quan tâm hơn đến thị trường nội địa, ngoài dạng sử dụng cá tươi, cần nghiên cứu chế biến một số sản phẩm phù hợp với thị trường này. Nhất là nghiên cứu chế biến tận dụng các thành phần khác của cá Basa ngoài thành phần có giá trị là fillet như chế biến nguồn mỡ cá thành nguồn dầu mỡ sử dụng được trong thực phẩm, chế biến các phụ phẩm của cá Basa thành các sản phẩm khác … nhằm khai thác tối đa nguồn nguyên liệu này. CHƯƠNG 4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mục đích đề tài Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình loại màu da cá Basa: nồng độ dung dịch H2O2 trong NaOH 0,01 M, thời gian tẩy màu, tỉ lệ da/dung dịch H2O2 trong NaOH Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình trích chiết collagen: loại acid (citric acid và acetic acid), thời gian trích chiết và phương pháp trích chiết Đánh giá tính chất hóa lý của sản phẩm collagen thu được Hóa chất – Thiết bị Hóa chất NaOH H2SO4 Citric acid Sodium Lauryl Sulphate (LasNa) NaCl H2O2 Acetic acid Na2HPO4 Thiết bị Cân hai số Máy xay Philips HR 1361 Máy đo độ ẩm Sartorius MA 35 Máy ly tâm Hermle Z 200A Máy so màu CR - 300 Máy đo độ nhớt Brookfield HDBV – II Máy quang phổ Varian Carry Phương pháp nghiên cứu Phương pháp tiến hành thí nghiệm Phương pháp chuẩn bị mẫu Nguyên liệu da cá Basa được mua về, loại bỏ những phần mỡ thừa còn sót lại, rửa sạch sơ bộ với nước và trữ trong tủ đông ở nhiệt độ khoảng -200C để sử dụng cho các thí nghiệm. Phương pháp khảo sát Phương pháp khảo sát theo yếu tố từng phần. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, chỉ thay đổi một nhân tố còn các nhân tố khác cố định trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả tối ưu của thí nghiệm trước được áp dụng cho thí nghiệm sau. Phương pháp phân tích Phương pháp phân tích nguyên liệu Xác định hàm lượng ẩm trong nguyên liệu (Moisture) Cân một lượng mẫu có khối lượng khoảng 1 gram. Cho mẫu vào đĩa nhôm và đặt vào máy đo độ ẩm Sartorius MA 35. Đọc giá trị độ ẩm trên đồng hồ hiển thị của máy. Tiến hành đo 3 lần để lấy giá trị trung bình. Hàm lượng tro tổng (Total ash content) [11] Nguyên tắc Khi nung ở 550 ÷ 600 0C, các chất hữu cơ cháy hòan toàn, chất vô cơ còn lại gọi là thành phần tro. Tiến hành Cân một lượng mẫu (G) cho vào chén nung đã được nung và cân đến khối lượng không đổi (G1). Đưa chén nung chứa mẫu vào lò nung ở 500 ¸ 600 0C trong 3 h. Lấy chén nung ra để nguội trong bình hút ẩm và cân. Tiếp tục nung và cân cho đến khi khối lượng không đổi (G2). Công thức Độ tro được xác định theo công thức: % Tro = Trong đó G : khối lượng mẫu ban đầu, g G1 : khối lượng đĩa G2 : khối lượng đĩa + thành phần tro sau khi sấy Hàm lượng béo (Fat content) [11] Nguyên tắc Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã được sấy khô, nghiền nhỏ. Một số thành phần hòa tan trong chất béo cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, các vitamin tan trong chất béo, các chất mùi…tuy nhiên hàm lượng của chúng thấp. Do có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô. Dung môi sẽ được tách khỏi dịch trích bằng cách bốc hơi và phần còn lại chính là lipid, đươc đem cân để xác định hàm lượng. Tiến hành Cân một lượng mẫu chính xác, đem sấy khô. Dùng ethyl ether để trích lượng mẫu này trong thiết bị Soxhlet. Dịch trích được cho vào một đĩa đã biết khối lượng để làm bay hơi dung môi. Sau đó, đĩa này được sấy khô, làm nguội trong bình hút ẩm và được xác định khối lượng. Công thức % Lipid tổng (dầu thô) = Trong đó W1 : khối lượng đĩa W2 : khối lượng đĩa + thành phần của dịch trích sau khi sấy khô S : khối lượng mẫu ban đầu Hàm lượng đạm (Protein content) [11] Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl trên cơ sở xác định hàm lượng nitrogen protein (thường chiếm khoảng 16 % trong các protein khác nhau). Nhân giá trị nitrogen xác định được với hệ số 6,25 (100:16) sẽ ra hàm lượng protein tổng số. Để định lượng nitrogen protein người ta thường xác định nitrogen tổng số và nitrogen phi protein, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng này. Xác định nitrogen tổng Nguyên tắc: dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitrogen bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O, còn nitrogen chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulphate. Quy trình được tiến hành theo các bước sau: CuSO4 : K2SO4 (1:3) Vô cơ hóa nguyên liệu R-CHNH2-COOH + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 Cất đạm (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O Phản ứng xảy ra trong bình phản ứng NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 + H2SO4 dư (ở bình hứng) Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH có nồng độ 0.1N. Hàm lượng Nitrogen trong mẫu được tính bằng công thức Trong đó X : hàm lượng Nitrogen tính bằng g/l A : số ml H2SO4 đem hấp thụ NH3 B : số ml NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn độ H2SO4 thừa V : số ml mẫu đem vô cơ hóa 0,0014 : số gram nitrogen tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N F : hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0,1N (F là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nồng độ lý thuyết của NaOH) Xác định nitrogen phi protein Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitrogen phi protein, tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein. Vì vậy, cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hòa tan trong quá trình chiết rút. Định lượng protein trong nguyên liệu Protein(mg) = (Ntổng số - Nphi protein)6,25 Xác định tổng lượng collagen trong da cá Xác định bằng phương pháp định lượng hydroxyproline [12] Nguyên tắc Trong tổng lượng amino acid có trong collagen, hydroxyproline chiếm khoảng 14 %. Loại amino acid này gần như chỉ được tìm thấy trong collagen mà không có trong bất kỳ một loại protein nào khác của cơ thể, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin. Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyproline. Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole. Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino)benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà). Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline. Tiến hành Chuẩn bị dung dịch chuẩn: lấy 25 mg bột hydroxyproline tinh khiết hòa tan vào 250 ml nước (100 mg/ml). Kế tiếp, lấy 50, 75, 100 và 150 ml của dung dịch này và thêm nước cất vào để đạt được tổng thể tích là 1 ml. Sự oxy hóa hydroxyproline xảy ra khi cho 1 ml Chloramine B vào mỗi ống nghiệm, hỗn hợp được lắc và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Lượng dư Chloramine T được phân hủy bằng cách cho 1 ml dung dịch HClO4 3,15 M vào, hỗn hợp được lắc trộn. Sau 5 phút, cho 1 ml dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde 20 % vào mỗi ống nghiệm và tiến hành lắc một lần nữa. Các ống nghiệm được giữ trong bể điều nhiệt ở 60 0C trong 20 phút và sau đó được làm mát với nước lạnh trong vòng 5 phút. Bước kế tiếp, 5 ml Ethyl Cellosolve được thêm vào mỗi ống nghiệm để đạt tổng thể tích lá 10 ml. Ta thu được các dung dịch chứa 0,5, 0,75, 1 và 1,5 mg hydroxyproline. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 557 nm (màu đỏ sẫm). Nước cất được dùng làm mẫu trắng. Ta xây dựng được đường chuẩn biểu diễn độ hấp thu theo các hàm lượng của hydroxyproline. Dung dịch thử được chuẩn bị với cùng một cách thức. Pha loãng dung dịch thử để nồng độ hydroxyproline nằm trong vùng từ 0,5 ¸1,5 mg/ml, tương ứng với phần tuyến tính trên phổ quang kế. Nồng độ của hydroxyproline được xác định dựa trên đường chuẩn. Lượng collagen được tính như sau: Collagen = hydroxyproline 14,7 Xác định bằng phương pháp trích ly sử dụng lactic acid [13] Da cá sau khi xử lý sẽ được trích ly bằng dung dịch lactic acid 0,5 M. Da cá được xay nhỏ, ngâm vào lactic acid với tỉ lệ 1:6. Tiến hành trích ly trong khoảng thời gian là 48 h. Phần da cá sau khi trích sẽ được tiếp tục ngâm vào dung dịch acid mới để trích ly một cách triệt để lượng collagen có trong da cá. Tổng số lần trích ly là 3, thời gian cho mỗi lần là 48 h. Theo nghiên cứu đã công bố thì lactic cho khả năng trích ly cao, hiệu suất trích sau 48 h là khoảng 90 %. Sau 3 lần trích ly trên cùng một lượng mẫu da, lượng collagen trích được là 99,99 %, xem như là tổng lượng collagen có trong da. Xác định độ sáng và màu sắc của da cá Giới thiệu không gian màu CIELAB Để tuận lợi cho việc tính toán và so sánh các màu với nhau, năm 1976 CIE giới thiệu một hệ thống sắp xếp màu sắc CIELAB. Trong đó sử dụng 3 thông số: L*: độ sáng a*: tọa độ màu trên trục đỏ - lục b*: tọa độ màu trên trục vàng – lam Trong hệ thống CIELAB, sự khác nhau giữa các điểm được biểu thị trong không gian màu tương ứng với những khác biệt có thể nhìn thấy được giữa các màu. Không gian màu CIELAB được thiết lập ở dạng lập phương. Trục L* chạy từ đỉnh xuống đáy. Giá trị cực đại của L* là 100, tương ứng với màu trắng. Giá trị cực tiểu của L* là 0, tượng trưng cho màu đen. Các trục a* và b* không có giới hạn các giá trị số cụ thể. Giá trị dương của a* biểu thị cho màu đỏ, giá trị âm biểu thị màu xanh lục. Giá trị dương của b* thể hiện màu vàng, giá trị âm thể hiện màu xanh lam. Có những giá trị delta đi kèm với hệ thống CIELAB. Các giá trị ∆L*, ∆a*, ∆b* cho biết mẫu chuẩn và mẫu thử khác nhau như thế nào về các giá trị L*, a*,b*. Những giá trị delta này thường được sử dụng cho sự quản lý chất lượng và hiệu chỉnh công thức. Cần thiết lập những mức giới hạn cho các giá trị delta này. Các giá trị delta nằm ngoài giới hạn cho biết có quá nhiều khác biệt giữa mẫu chuẩn và mẫu thử. ∆L* = : sự khác nhau về độ sáng giữa 2 màu Nếu ∆L* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng sáng lên, mẫu thử sáng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆L* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng tối hơn, mẫu thử tối hơn mẫu chuẩn ∆a* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục đỏ - lục Nếu ∆a* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng đỏ lên, mẫu thử có sắc đỏ hơn mẫu chuẩn Nếu ∆a* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lục hơn, mẫu thử có sắc xanh lục hơn mẫu chuẩn ∆b* = : sự khác nhau về tọa độ trên trục vàng - lam Nếu ∆b* mang dấu +: sự lệch màu theo hướng vàng hơn, mẫu thử có sắc vàng hơn mẫu chuẩn Nếu ∆b* mang dấu -: sự lệch màu theo hướng lam hơn, mẫu thử có sắc xanh lam hơn mẫu chuẩn Giới thiệu không gian màu CIELCH Không gian màu L*C*h* sử dụng chung giản đồ với không gian màu L*a*b* nhưng thay vì sử dụng trục tọa độ vuông thì nó lại sử dụng trục tọa độ hình trụ. Trong không gian màu này, L* biểu thị độ sáng giống với L* trong không gian màu L*a*b*, C* là cường độ màu và h* là góc tông màu. Giá trị cường độ màu C* bằng 0 ngay tại tâm và gia tăng tùy thuộc khoảng cách từ tọa độ màu đến tâm. Giá trị góc tông màu được xác định khởi điểm tại trục a* và được tính bằng đơn vị độ : 00 là +a* (Đỏ) 900 là +b* (Vàng) 1800 là –a* (Lục) 2700 là –b* (Lam) Các giá trị C* và h* được xác định từ a* và b* theo công thức : Cường độ màu Góc tông màu  : sự khác nhau về độ bão hòa giữa hai màu  : sự khác nhau về tông giữa hai màu * Chú ý Mục đích chính của quá trình tẩy màu là làm cho da trắng, sáng lên. Do đó, trong quá trình này trục màu chính cần quan tâm là trục màu trắng – đen (L*). Trục a* và b* được xem là 2 trục màu phụ để khảo sát sự thay đổi của ánh màu phụ trong quá trình xử lý. Phương pháp phân tích sản phẩm Xác định sự biến tính của collagen theo nhiệt độ bằng phương pháp biến đổi độ nhớt (Denaturation temperature determined by viscosity method) [14-16] Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1 M được nạp vào đĩa của máy đo độ nhớt với lượng khoảng 5 ml. Nhiệt độ của đĩa được điều chỉnh thông qua bể điều nhiệt. Cài đặt nhiệt độ của bể điều nhiệt ứng với nhiệt độ ban đầu của thí nghiệm là 30 0C và để khoảng 30 phút cho nhiệt độ của dung dịch collagen cân bằng với nhiệt độ ở bể điều nhiệt. Thí nghiệm được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 30 0C đến 50 0C. Nhiệt độ được gia tăng từng bước, mỗi bước ứng với 2,5 0C và mỗi mức nhiệt độ được giữ trong 10 phút. Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng ở các mức nhiệt độ. Độ nhớt tương đối được tính như sau: Độ nhớt tương đối = Trong đó: ht : độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ hmax : độ nhớt lớn nhất hmin : độ nhớt nhỏ nhất Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị độ nhớt tương đối theo nhiệt độ. Phân tích nhiệt vi sai (Differential thermal analysis/ Thermogravimetry analysis (DTA/TG)) [17, 18] DTA là kỹ thuật ghi nhận sự khác biệt về nhiệt độ giữa mẫu thử và một chất đối chứng theo thời gian hoặc nhiệt độ bằng một chương trình nhiệt độ xác định trong một môi trường được đun nóng hoặc làm lạnh với mức độ được kiểm soát. (Thực hiện tại Khoa Công nghệ vật liệu, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy [19] Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại. Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫu thử. Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt. Với nhiều thiết bị phụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn. Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia vật liệu Polymer và Composite, trường Đại học Bách khoa TP.HCM) Hàm lượng tro tổng (Total ash content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng béo (Fat content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Hàm lượng đạm (Protein content) Thực hiện tại Trung tâm Kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 Sự hình thành sợi của collagen (Fibril formation experiment - Turbidity) [20] Collagen được cho vào dung dịch đệm (0,1M Na2HPO4, 0,05 Citric acid, pH = 7,2) với sự có mặt của NaCl (nồng độ cuối cùng là 0,15M) ở 4 0C. Nồng độ của mẫu collagen được điều chỉnh bằng 0,5 mg/ml trong dung dịch đệm. Mẫu được làm nóng đến 35 0C để kích thích quá trình hình thành sợi. Tiến hành ghi nhận độ hấp thu của mẫu theo thời gian, 2 phút/lần, trong vòng 30 phút. Độ hấp thu được đo ở bước sóng 313 nm. Hình thái bề mặt của collagen (Scanning Electron Microscopy - SEM) [20] Hình thái bề mặt của sản phẩm collagen thu được và mẫu gelatin chuẩn được chụp theo phương pháp SEM để quan sát được sự khác biệt về cấu trúc của chúng. (Thực hiện tại Phòng thí nghiệm chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ) Quy trình thí nghiệm Quy trình loại béo Da cá Basa Ngâm x 3 lần Dd NaOH 0.2% 0,5% LasNa H2O Rửa Dd H2SO4 0.2% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Dd Citric 0.7% Ngâm x 3 lần 0,5% LasNa H2O Rửa Da cá đã lọai béo Hình 4.1 Quy trình loại béo Để thu được collagen không có mùi, da cá nguyên liệu cần phải được loại loại bỏ các chất béo. Ta áp dụng phương pháp của Gudmundsson và Hafsteinsson (1997), phương pháp được trình bày như sau: Da cá Basa sau khi được rửa sơ bộ với nước sẽ được tiếp tục xử lý với lần lượt 3 loại dung dịch (NaOH 0,2%, H2SO4 0,2% và Citric Acid 0,7%) với tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml) nhằm mục đích thu được collagen không mùi. Với mỗi loại dung dịch, da cá được xử lý qua 3 lần, mỗi lần tương ứng với thời gian là 1h. Sau mỗi lần xử lý, da phải được rửa sạch dưới vòi nước đến khi đạt pH = 7 trước khi tiến hành ngâm lần tiếp theo. 0,5% chất hoạt động bề mặt (LasNa) được thêm vào tất cả các dung dịch sử dụng trong quy trình nhằm nâng cao khả năng loại mùi. Tuy nhiên, theo lý thuyết quy trình này có thể làm mất đi một lượng collagen. Ta tiến hành thêm một quy trình dựa trên nguyên tắc của quy trình trên nhưng không sử dụng acid để rửa. 2 mẫu da của 2 quy trình xử lý (có dùng acid và không dùng acid) sẽ được đối chứng với nhau. Quy trình loại màu Áp dụng quy trình tẩy màu của Kolodziejska et al. (1999) Da cá đã loại béo Ngâm dd NaCl 10 % t(0C) = 30 0C τ = 24 h Ngâm, tẩy màu trong NaOH 0,01M Da cá đã xử lý dd 1% H2O2 Hình 4.2 Quy trình tẩy màu Da sau khi loại lipid được ngâm trong dung dịch NaCl 10 % trong vòng 24 h, tỉ lệ da : dung dịch là 1:10 (g/ml), ở nhiệt độ phòng, chuẩn bị cho quá trình tẩy màu. Việc tẩy màu được tiến hành dưới tác dụng của dung dịch H2O2 trong NaOH 0,01M. Quy trình trích collagen Ly tâm 5000 vòng/phút 1 phút acetic 0,5M hay citric 0,5M NaCl Collagen không tan 1:6 (g/ml) 4 ( 0C) Da cá đã xử lý Xay nhỏ Trích ly Lọc Ly tâm Kết tinh Ly tâm Kết tinh lại 5.000 vòng/phút 30 phút 5.000 vòng/phút 1 h Collagen thành phẩm Hình 4.3 Quy trình trích ly Quá trình trích ly collagen được thực hiện ở nhiệt độ 4 0C trong 24, 48 và 72 h với dung dịch có nồng độ 0,5 M của các acid citric và acetic. Với mỗi loại acid, collagen được trích theo phương pháp toàn phần (A) và từng phần (B). Phương pháp toàn phần (A): da cá được trích trong dung dịch acid một lần duy nhất ứng với các mốc thời gian 24, 48 và 72 h. Phương pháp từng phần (B): da cá được tiến hành trích qua nhiều lần, mỗi lần 24 h, sau đó lượng collagen thu được ở các lần trích được gộp lại để tính hiệu suất. Da cá sau khi xử lý được ngâm trong các dung dịch acid với tỉ lệ da/dung dịch là 1:6 (g/ml). Dịch trích collagen thu được từ quá trình trích ly được tinh chế theo phương pháp của Piez et al. (1963). NaCl rắn được cho vào dịch trích collagen với nồng độ 5% (w/v) để kết tinh collagen. Collagen kết tinh (collagen hòa tan trong acid) được tách ra bằng phương pháp ly tâm với vận tốc 5.000 vòng/phút trong 90 phút, sử dụng máy ly tâm Hermle Z 200A. Để thu được collagen tinh khiết hơn, phần collagen kết tinh được hòa tan lại trong acetic acid 0,5 M và kết tinh lại theo các bước miêu tả ở trên. Quá trình kết tinh lại được lặp lại 2 lần. Các thông số khảo sát trong quá trình thí nghiệm Trong quá trình xử lý nguyên liệu Nồng độ dung dịch H2O2 (%) f = f(0,5; 0,75; 1; 1,25; 1,5) Thời gian tẩy màu (h) f = f(1; 2; 3; 4; 5; 6; 24) Tỉ lệ da/dung dịch (g/ml) f (F) = f(1:10; 1:12,5; 1:15; 1:17,5; 1:20) Trong quá trình trích collagen Loại acid Citric và Acetic acid Phương pháp trích Phương pháp A (từng phần) và phương pháp B (toàn phần) Thời gian trích (h) f = f(24; 48; 72) Đáp ứng Trong quá trình xử lý nguyên liệu Đáp ứng được chọn làm đáp ứng chính là giá trị độ lệch sáng giữa da cá nguyên liệu ban đầu và da cá sau quá trình xử lý ∆L* theo các thông số nồng độ dung dịch H2O2, thời gian tẩy màu và tỉ lệ da/dung dịch. Các giá trị ∆C* và ∆h* là các đáp ứng phụ để đánh giá sự thay đổi màu sắc của da cá trong quá trình xử lý. Trong quá trình trích collagen Đáp ứng chính là hiệu suất trích ly theo các yếu tố như loại acid, phương pháp trích và thời gian trích. CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Đánh giá nguyên liệu Nguồn nguyên liệu Xuất xứ: da cá Basa được mua từ Công ty TNHH Thuỷ Sản Bình An (Binh An Seafood Joint Stock Company), Lô 2.17, Khu Công Nghiệp Trà Nóc II, TP. Cần Thơ. Da cá được tách ra bằng phương pháp cơ học ở nhà máy. Sau khi mua về, ta rửa sạch bằng nước, loại bỏ sơ bộ các phần mỡ còn sót lại trên da và tồn trữ ở khoảng -200C cho đến khi sử dụng. Khảo sát các thành phần của da cá Basa (Phụ lục 1) Bảng 5.1 Thành phần da cá Basa nguyên liệu Thành phần Hàm lượng (%) Protein 31,1 Lipid 6,5 Độ ẩm 58,7 Độ tro 0,1 Các thành phần khác 3,6 Đánh giá quy trình loại béo nguyên liệu (Phụ lục 1) Bảng 5.2 So sánh thành phần giữa da nguyên liệu và da sau khi xử lý của hai quy trình Chỉ tiêu Da nguyên liệu Xử lý có acid Xử lý không acid Độ ẩm (%) 58,73 66,31 62,89 Cảm quan Dạng Rắn, tươi Rắn, tươi Rắn, tươi Màu Đen Trắng Trắng Mùi Hôi Không mùi Vẫn còn mùi Lý hóa Protein (%) 75,35 39,18 64,40 Lipid (%) 15,75 3,27 15,35 Độ tro (%) 0,24 0,29 0,27 Hiệu suất loại béo Quy trình có sử dụng aci