Đề tài Ứng dụng Chitosan trong chế biến và bảo quản Rau trái

ợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực như: y học, thực phẩm, nông nghiệp, môi trường… Ø Trong Y tế: nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bỏng, viêm loét dạ dày, hạ cholesterol, trị béo phì, giảm đau, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp và chống đựợc cả bệnh ung thư + Tác nhân hạ cholesterol: chitosan có chức năng hạ cholesterol trong ruột động vật. Người ta đã tiến hành thí nghiệm với thỏ và thấy khi được cho ăn thức ăn giàu cholesterol 0.9% trong 39 ngày, lượng cholesterol huyết thanh tăng từ 79 lên 650 mg/ trên 1kg thể trọng. Trong trường hợp với khẩu phần ăn như trên nhưng có bổ sung 2% chitosan, lượng cholesterol huyết thanh giảm còn 300 mg/1kg thể trọng, trong khi đó lượng cholesterol có ích (HDL – cholesterol) giảm không đáng kể. Tuy nhiên khi tiêm chitosan-oligosaccharide vào thỏ thì không thấy hiện tượng giảm cholesterol, điều này cho thấy sự giảm cholesterol chỉ xảy ra trong ruột động vật. Và từ lâu, một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện Hàn lâm Y học Nga cũng đã phát hiện, Chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ + Điều trị béo phì: khi vào đường tiêu hóa, chitosan có khả năng bao các hạt cầu béo và kéo chúng thải ra ngoài theo (động vật không tiêu hóa chitosan) nhờ đó được ứng dụng làm thuốc giảm béo. Nước ta hiện nay có thuốc Chitozan để giảm béo Hình 7: Khả năng kết hợp của Chitosan với chất béo + Các vật liệu y sinh học và dược phẩm: Chitin và chitosan có thể kết hợp sinh học với mô, cơ quan, tế bào,…và có thể được sử dụng trong việc cấy vào mô. Chitin và các dẫn xuất của nó có thể tiêu đi trong mô động thực vật, nhưng vẫn có thể dẫn đến gia tăng sự cảm ứng các protein bảo vệ sinh học gồm lysozyme và chitinase. Tốc độ thủy phân enzyme với chitin cũng được điều khiển bởi cấu trúc của một nhóm N-acetyl và dẫn xuất của nó. Do những tính chất đặc trưng này, chitin và các dẫn xuất được sử dụng như những vật liệu y sinh học hay vật liệu để bao gói các loại thuốc tan chậm. Hoạt độ lipoprotein lipase trong máu tăng lên khi tiêm N, O-sulfate chitosan và hoạt động miễn dịch được tăng cường khi cấy chitin N-deacetyl một phần vào mô động vật. Film chitosan bao thuốc (thấm qua được) cũng công dụng nhu các dang con nhộng thương phẩm và chitosan được sử dụng như vật liệu dùng để cấy giải phóng chậm các loại thuốc chống ung thư. Chitosan cũng được đưa vào công thức các loại thuốc uống, làm gia tăng sự hấp thu của thuốc vào máu + Vật liệu vá vết thương: Các vết thương ở mô động, thực vật có thể được bao bằng một tấm màng hay một miếng xốp chitin và chitosan, hoặc dạng bông, dạng bột mịn. Các vết thương cũng có thể được trị liệu bằng các dung dịch hay kem chitin và chitosan. Kết quả là sự phát triển của các tế bào ở vùng mô bị thương được kích thích, chitinase và lysozyme được tăng cường, dẫn đến mau lành vết thương và hạn chế nhiễm trùng. Tại cuộc chiến Iraq vừa qua, Mỹ cũng đã sử dụng loại băng cứu thương kiểu mới, kỹ thuật cao, có thành phần cấu tạo bởi chất Chitosan. So với các loại băng thường, tốc độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần. + Chất chống nghẽn mạch và chống đông máu: dẫn xuất N-octanoyl và N-hexanoyl của chitosan có chức năng chống nghẽn mạch, chitosan có chức năng cầm máu. Dẫn xuất sulfate hóa của chitin và chitosan có hoạt tính chống tụ máu. N, O-sulfate chitosan có hoạt tính chống đông tụ thấp hơn heparin nhưng O-oligosulfate chitin thì cao hơn mặc dù nó không có nhóm N-sulfate trong phân tử. Nhóm N-sulfate có vai trò quan trọng trong hoạt tính của heptarin. + Theo nghiên cứu của bệnh viện K Hà Nội trên 60 bệnh nhân ung thư đã cho thấy chitosan là một chất hỗ trợ điều trị tốt thông qua việc ngăn cản sự gia tăng của tế bào ung thư.  + Chữa bệnh khớp: Điển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang được thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng phụ, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh (điều này có ý nghĩa rất quan trọng). Nước Mỹ đã tiêu thụ được hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nước, trong đó có Việt Nam. Nước ta cũng có Glusivac đặc trị thoái hóa khớp Ø Trong Công nghiệp: xử lý nước thải và làm trong nước sinh hoạt + Chitosan cationit tạo các phức hợp đa điện ly với những polymer polyanionic và tạo phức hợp chelate với các ion kim loại để tạo kết tủa. Các phản ứng này được ứng dụng để làm trong nước thải ô nhiễm. Vào năm 1975, muối chitosan acetate lần đầu tiên được một công ty Nhật giới thiệu như một tác nhân cationit tự nhiên để đông tụ và loại các chất thải trong nước cống. Hiện nay hệ thống này vẫn còn được sử dụng để xử lý nước thải sinh hoạt, tái sử dụng nước thải (ví dụ nước hồ bơi), thu hồi các protein và khoáng từ nước thải công nghiệp, bao bọc các hạt béo, phân lập các chất có hoạt tính sinh học trong nước tiểu và tách các chất độc nội bào từ dung dịch loãng. Chitosan cũng được sử dụng như một chất hấp phụ để tách các đồng vị phóng xạ nguy hiểm từ nước ô nhiễm và thu hồi uranium từ nước biển và nước ngọt Hình 8: Chitosan tạo phức chelate với kim loại trong xử lý nước thải Ø Trong nông nghiệp: + Làm phân bón rau sạch: Chitin và chitosan chủ yếu được bón ở dạng bột, dạng miếng hay dạng dung dịch vào đất nông nghiệp hay môi trường nuôi cấy lỏng. Ngoài ra dung dịch chitosan có thể được phun lên lá cây. + Xử lý hạt giống: hạt giống có thể được nhúng vào dung dịch chitosan loãng, bao phủ bề mặt bằng một màng chitin hay chitosan mỏng hay bột mịn. Khi được bao phủ như vậy, hoạt động của chitinase của hạt được tăng cường trong giai đoạn nảy mầm. Sự tăng cường chitinase trong hạt sẽ làm gia tăng khả năng tự vệ sinh học của hạt qua việc nhiễm VSV, kết quả là làm cho cây trồng phát triển tốt. Ø Trong mỹ phẩm: nguyên liệu sản xuất kem dưỡng da, kem chống tia tử ngoại… + Kem dưỡng da: CM-chitin và HP-chitosan cationic hòa tan trong nước và bền trong một khoảng pH rộng, chúng được sử dụng như một thành phần của mỹ phẩm chăm sóc da. Chitosan, CM-chitosan, HP-chitosan có chức năng tạo độ ẩm cho da, ngăn cản sự hủy hoại cơ học tóc. Đặc tính giữ độ ẩm tương ứng với dung dịch propylenglycol 20% và dung dịch hyaluronic loãng. Những dẫn xuất trên của chitosan có thể ngăn chặn sự nhiễm khuẩn trên da và hoạt hóa tế bào da dẫn đến sự ngăn chặn sự lão hóa của da. Một số dẫn xuất Chitosan phức polyelectrolyte –based có tác dụng làm mềm da, kích thích phát triển da non, do đó được sử dụng như một chất phụ gia trong kem dưỡng da. + Dầu gội: Dẫn xuất Chitosan do phản ứng với hợp chất epoxy mạch dài có tính chất hoạt động bề mặt. Các dầu gội hiện nay đều sử dụng do có đặc tính tương hợp tốt với da đầu, ưu điểm hơn so với Lauryl-ether-sulfate dùng trong sản xuất dầu gội trước đây. Người ta điều chế bằng cách cho Chitosan phản ứng với 1,2 expoxytetradecane trong acid acetic 0.1M-methanol tạo sản phẩm có khả năng hoạt động bề mặt, làm giảm sức căng bề mặt, tạo tính ổn định bọt tốt, hoàn toàn không gây hại cho da. + Các muối hữu cơ của chitosan phân tử thấp hòa tan trong ethanol loãng và được sử dụng như một thành phần của keo xịt tóc. Ø Trong thực phẩm: hiện nay chitosan được sử dụng rất phổ biến trong sản xuất thực phẩm. Có thể sử dụng để thu hút nước và béo (quá trình nhũ hóa), quá trình đồng hóa, kết hợp với thuốc nhuộm, quá trình đông đặc. Chitosan cũng được chứng minh là có khả năng tạo dạng màng mỏng để sử dụng như là những lớp màng mỏng hoặc những lớp bao không độc hại (có thể ăn được). Màng bao Chitosan có thể cải thiện khả năng bảo quản các loại thực phẩm dễ bị thối rữa bằng cách giảm lượng không khí bên trong bao gói cũng như giảm quá trình thoát hơi nước. Hình 9: Ứng dụng chitosan trong thực phẩm + Có thể nhúng trực tiếp thực phẩm vào dung dịch chitosan pha sẵn rồi để khô, tạo thành một lớp màng mỏng tự nhiên trên bề mặt sản phẩm: trứng, thịt cá, rau quả, giá đỗ, bánh gạo, nhúng cải bắp trước khi làm kim chi… + Hoặc cũng có thể tạo thành màng trước rồi mới cho sản phẩm vào: bánh mì, xúc xích… + Hoặc cho chitosan trực tiếp vào sản phẩm dạng lỏng: xử lý nước quả, làm trong giấm, bảo quản tàu hũ, đồng hóa sữa, kem và mayonaise, bảo quản mì… Ø Trong một số lĩnh vực khác + Làm môi trường sắc ký và cố định: các loại gel N-methylen-chitosan và N-acyl-chitosan có thể được dùng như một môi trường hấp phụ trong môi trường hấp phụ trong việc cố định enzyme hay tế bào, hay cố định thuốc. Các hạt chitin và chitosan với các kích thước khác nhau đã được bán trên thị trường với công dụng hấp phụ các ion kim loại, ion uranium, kallikrein nước tiểu, urokinase và erythropoetin. Chitinase và lysozyme tạo thành phức hợp ES với một loạt các dẫn xuất “N-acyl béo thấp” của chitosan. Các dẫn xuất N-butyryl và N-hexanol kháng lại sự thủy phân các enzyme này và hình thành các phức hợp ES, điều này cho thấy các dẫn xuất này rất thích hợp với việc sử dụng như một chất hấp phụ tron sắc ký ái lực để phân lập và tinh sạch enzyme trên. + Hóa chất dùng trong phân tích: chitosan, HE-chitosan và methyl-chitosan phản ứng theo kiểu stoichiomdtrically (hóa học lượng pháp) với các chất keo polymer anionic trong dung dịch loãng để tạo thành kết tủa trung tính. Phản ứng này được ứng dụng trong phương pháp chuẩn độ chất keo và đã được sử dụng trong hóa phân tích. Chitin dạng keo, chitin tái tạo (N-acy chitosan) và dạng gel của nó, CM-chitin và HE-chitin được sử dụng như cơ chất của enzyme + Một số công ty đã giới thiệu sản phẩm sợi tổng hợp có bao chitin hay chitosan, vải đan tổng hợp tráng một lớp chitosan. Những sản phẩm này có khả năng giữ độ ẩm, kháng khuẩn kháng nấm. Chitin xanthate, alkaline chitin, N-acetylchitosan gels và chitosan được dùng như nguyên liệu sản xuất sợi, bông, film, xốp. II. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITOSAN: Chitosan là sản phẩm Deacetyl hóa của Chitin. Chitin có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như từ tôm, cua, côn trùng có bộ cánh cứng, các loài giáp xác, nhuyễn thể (sò, ốc…), từ nấm…Đặc biệt trong vỏ tôm cua, hàm lượng Chitin cao, từ 10-15% nguyên liệu khô. Trong đó Chitin liên kết với Protein, các chất vô cơ mà chủ yếu là CaCO3 và các chất béo. Do đó cần phải loại các hợp chất này ra khỏi Chitin. Có 2 phương pháp để sản xuất Chitosan là sử dụng hóa chất và Enzym. Phương pháp dùng hóa chất rất đơn giản, ít chi phí đầu tư nhưng ảnh hưởng không tốt đến môi trường xung quanh. Ngược lại, phương pháp sử dụng enzym không làm ô nhiễm môi trường, song phức tạp và đòi hỏi chi phí đầu tư cao. Hiện nay trên thế giới, Chitosan phần lớn được sản xuất bằng hóa chất, phương pháp dùng enzym mới bước đầu đi vào ứng dụng ở một số nước.Theo thực tế nghiên cứu điều chế cho thấy ở nước ta chưa thể điều chế Chitin- Chitosan theo phương pháp sinh học, do các lý do sau: + Hiệu suất thu sản phẩm Chitosan rất thấp, mặc dù hoạt tính Enzym cao nhưng chỉ có một phần nhỏ Chitin tham gia phản ứng do độ tinh thể của vỏ cao, chỉ có những nhóm acetyl của Chitin nằm bên ngoài mới tiếp xúc được với Enzym. + Việc sản xuất Chitosan bằng Enzym sẽ thành công khi và chỉ khi Enzym được phá tinh thể trước khi cho phản ứng deacetyl hóa. Mà thực tế, vấn đề các phòng thí nghiệm trong nước chưa thực hiện được điều này do thiếu thiết bị máy móc. + Điều chế Chitosan theo phương pháp sinh học bằng cách sử dụng Enzym đòi hỏi phải có một nguồn cung cấp Enzym thường xuyên và ổn định hay một môi trường nuôi cấy Enzym thích hợp. Điều này trong nước vẫn chưa thực hiện được. Bên cạnh những bất lợi của phương pháp sinh học thì phương pháp hóa học lại tỏ ra có nhiều lợi điểm hơn: + Quy trình sản xuất đơn giản, thiết bị rẻ tiền. + Hoá chất sử dụng rẻ tiền. + Chất lượng sản phẩm cao hơn do có thể thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao hơn. + Hiệu suất thu hồi sản phẩm khá cao. Tuy nhiên phương pháp hoá học cũng có những bất lợi cần quan tâm: + Vấn đề xử lý nước thải: phải xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường. + Vấn đề thu hồi hoá chất. + Điều kiệnlàm việc với hóa chất ( NaOH 50%) ở nhiệt độ cao dễ gây ăn mòn thiết bị, làm giảm chất lượng Chitosan do làm giảm hoạt tính của nhóm chức –NH2. + Chưa có biện pháp tận thu Protein sau khi loại ra khỏi vỏ giáp xác. Bảng 3: Thành phần hóa học của vỏ các loại giáp xác Hình 10: Hiệu suất thu hồi Chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau Hình 11: Hàm lượng chitin trong 7 loài giáp xác Vỏ tôm,cua Loại Protein Tạp chất Dd NaOH 3.5% Dd HCl Loại muối khoáng (CaCO3) Tạp chất Dd NaOH 50% t=60-120oC Chitin Nước Rửa Deacetyl hóa Làm nguội Rửa Nghiền Bột Chitosan Hòa tan trong HCl Kết tủa chậm Kết tủa nhanh Vẩy Chitosan 50-60% Chitosan kết tủa mịn Chitosan dd keo Sấy Hình 12: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan Hình 13: Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất Chitosan C Cụ thể người ta tiến hành lần lượt các công đoạn sau: 1. Chuẩn bị: Làm sạch vỏ giáp xác: Phế liệu vỏ giáp xác được thu thập và đun sôi trong 1h để loại hết các mô. Vỏ tiếp tục được cho vào lò ở 163OC trong 1h, sau đó lấy ra, tách phần mô đã sấy khô còn sót lại trên vỏ, cọ rứa sạch lớp vỏ. Khử màu: Lớp vỏ cứng bên ngoài của loài giáp xác có chứa chất màu chủ yếu là Cardenoid. Thành phần chính là astarene, astaxanthin, canthaxanthin, lutin và b - carotene. Chúng không xuất hiện dưới dạng phức chất với các chất vô cơ cũng như protein, vì vậy khử protein và khử khoáng cũng không loại được Cardenoid. Tuy vậy có thể khử màu bằng chất trích màu như KmnO4, NaOCl, SO2, NaHSO3… Có thể bổ sung công đoạn ngâm vỏ trong dung dịch chất tẩy trắng loãng trước khi thực hiện quá trình đun sôi. Hình 14: Nghiền vỏ bằng cối và chày Làm nguội vỏ giáp xác: Vỏ sau khi đã làm sạch được đặt trong lò ở 80oC trong 48h để phá vỡ cấu trúc tinh thể của Chitin, nhằm chuyển hầu hết Chitin trong vỏ thành dạng vô định hình. Sau 48h, vỏ được lấy ra khỏi lò và đổ nhanh vào bể chứa Nitơ lỏng (-196oC) để làm nguội. Việc làm nguội nhanh sẽ hạn chế được sự tái hình thành tinh thể Chitin, làm chúng trở nên vô định hình hơn. Ngoài ra trong quá trình làm nguội, nhiệt độ của Nitơ lỏng còn làm cho vỏ trở nên rất giòn, dễ vỡ, giúp quá trình nghiền sau đó sẻ dễ dàng hơn. Sau khoảng thời gian nhất định, lấy vỏ ra khỏi dd Nitơ lỏng, nghiền bằng cối và chày. Có thể thay dung dịch Nitơ lỏng bằng hỗn hợp methanol- nước đá khô. 2. Loại Protein: Protein được loại bằng cách nấu với NaOH, nhiệt độ 60-100oC. Gần đây các nghiên cứu mới được thực hiện với một khoảng rộng với các tác nhân như NaOH, NaHCO3, KOH, K2CO3, Ca(OH)2, Na2SO4, NaHSO3, Ca(SO4)2, NaPO4, Na2S. Song NaOH vẫn được dùng thông dụng hơn. Tùy từng loại vỏ mà điều kiện xử lý có thể thay đổi về nồng độ NaOH, nhiệt độ hoặc thời gian. Với những loại vật liệu dễ khử protein, có thể dùng Na2CO3 0.1M ở khoảng 100oC trong 4h. Đối với vật liệu khó xử lý, có thể dùng NaOH 5M ở khoảng 100oC trong 4h. Tuy nhiên, hầu hết các quá trình khử thường dùng NaOH 1N với một khoảng nhiệt độ và thời gian xử lý (từ 65-100oC) trong vòng 0.5-7h. Tiến hành: Cho hỗn hợp vỏ đã làm nguội vào dd NaOH 3,5% (tỉ lệ 1:10 w/v) ở 65oC. Sau 2h lấy phần nổi lên trên, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 90oC. Người ta có thể định lượng xác định lượng protein tách ra từ vỏ tôm. 3. Loại muối khoáng: Để khử khoáng có thể dùng các tác nhân acid như HCl, HNO3, H2SO4, CH3COOH, HCOOH…, song người ta thường dùng HCl ở nhiệt độ phòng. Tùy tính chất nguyên liệu mà thay đổi nồng độ acid và thời gian xử lý cần thiết. Ngoài ra người ta cũng nghiên cứu quá trình khử EDTA ở pH kiềm. Nguyên liệu được xử lý bằng EDTA ở pH9 hoặc pH10, sau đó xử lý ở pH3 sẽ cho sản phẩm có khoảng 15% chất vô cơ chủ yếu là silicat. Hình 16: Loại muối khoáng bằng dd HCl Tiến hành: Vỏ tôm đã loại protein được cho vào dd HCl 1N (tỉ lệ 1:15 w/v) ở 25oC trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau 2h lấy phần vỏ nổi lên trên, rửa bằng nước cất, sấy ở 90oC. Vỏ tôm sau khi đã sấy khô chứa chủ yếu là Chitin. 4. Phản ứng deacetyl hóa: Phản ứng chính trong điều chế Chitosan là deacetyl hóa bằng dung dịch kiềm. Dungdịch phản ứng cần được gia nhiệt và khuấy trộn đều trong suốt thời gian phản ứng. Hình 17: Thực hiện phản ứng deacetyl hóa Chitin Tiến hành: Chitin thu được đem phản ứng với dung dịch NaOH 50% (tỉ lệ 1:25 w/v) để trong lò ở 80oC trong 96h.Chuẩn độ đến pH 7.0 với dd HCl 1N. Chitosan sẽ kết tủa, ta tiến hành lọc hoặc ly tâm, sau đó sấy thu được Chitosan. 5. Tinh sạch Chitosan: Kết tủa sau khi đã sấy khô được nghiền thành bột và hòa tan trong dd acid acetic 2% với tỉ lệ 1:100 (w/v). Cho dung dịch vào các ống thẩm tích, đặt các ống vào dung dịch acid acetic có nồng độ tương đương trong 24h. Mục đích của quá trình nhằm loại bỏ các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ( muối CH3COONa, muối Calci, các Protein có phân tử lượng thấp…). Sau đó lấy dung dịch trong ống ra và sấy chân không, ta thu được Chitosan gần như tinh khiết (Được kiểm nghiệm bằng phương pháp phân tích HPLC). Tiến hành thí nghiệm lần lượt với 1g và 10g vỏ tôm ban đầu, sự giảm khối lượng vỏ tôm khi qua từng công đoạn được thể hiện trong bảng sau: Bảng 4: Sự giàm khối lượng vỏ tôm qua từng công đoạn Khối lượng vỏ tôm ban đầu % so với ban đầu Sau khi lọai protein Sau khi lọai muối khóang Sau khi lọai nhóm acetyl Sau khi thẩm tích 1 g 67,53 40,46 33,38 19,85 10 g 69,58 33,55 29,78 15,08 Hình 18: Chitosan thu được từ một số loại vỏ giáp xác Các yếu tố ảnh hưởng đến mức độ deacetyl hóa: Nhiệt độ Nồng độ dd NaOH Thời gian phản ứng Hình 19: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến mức độ deacetyl hoá dd Chitin Tiến hành thí nghiệm khảo sát mức độ deacetyl hóa dd Chitin ở hai chế độ nhiệt độ 100oC và 120oC, hai nồng độ dd NaOH 40% và 50%. Kết quả thu được biểu diễn bằng đồ thị như sau Hình 20: Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan Từ đồ thị ta thấy: ở nhiệt độ 120oC – dd NaOH 50%, mức độ deacetyl hóa là cao nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ 100oC – dd NaOH 40%, mức độ deacetyl hóa là thấp nhất. Một thí nghiệm khác được tiến hành để khảo sát khối lượng phân tử trung bình của dung dịch Chitosan khi deacetyl hóa Chitin bằng dd NaOH 40% và 50%, nhiệt độ 100oC và 120oC, kết quả thu được: Từ đồ thị ta thấy ở nhiệt độ 120oC – dd NaOH 50%, khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan giảm nhanh nhất. Ngược lại, ở nhiệt độ 100oC – dd NaOH 40%, khối lượng phân tử trung bình của dd Chitosan giảm chậm nhất. Điều này được giải thích là do nhiệt độ cao, nồng độ NaOH lớn, mức độ deacetyl hóa càng lớn làm khối lượng phân tử trung bình của dung dịch giảm và ngược lại. Ngoài ra, sự giảm nhanh khối lượng phân tử trung bình được giải thích là do có sự cắt mạch phân tử Chitosan khi phản ứng với dd NaOH ở nồng độ cao và nhiệt độ cao. 6. Xác định mức độ deacetyl hóa của chitosan: Thử độ deacetyl hóa bằng phương pháp hòa tan mẫu sản phẩm trong dung dịch acid acetic 2%. Xác định độ deacetyl hóa bằng quang phổ hồng ngoại IR. Và đo phân tử lượng trung bình bằng phương pháp đo độ nhớt kế Ostwald Hoặc tiến hành xác định mức độ deacetyl hóa chitosan bằng phương pháp đo độ đạm tổng số: ü Nguyên tắc: Khi chitin chuyển hóa thành chitosan, gốc acetyl chuyển thành gốc amino làm ảnh hưởng tới độ đạm tổng số, dựa vào sự thay đổi độ đạm tổng số để tính mức độ deacetyl hóa (DD). Nếu sản phẩm có độ deacetyl hóa > 50% thì sản phẩm đó là chitosan. Còn ngược lại là chitin. ü Phương pháp thực hiện: + Cân 0.5 g mẫu chitosan cho vào ống Kjedahl, tiếp tục cho vào mỗi ống 10 ml dd H2SO4 đậm đặc và 5g CuSO4 (tỉ lệ 1:10) à cho vào máy vô cơ hóa à máy chưng cất đạm, lượng đạm thu được ở dạng NH4+ và đem chuẩn độ bằng H2SO4 0.1N với chất chỉ thị màu là tashiro à chuẩn đến khi xuất hiện màu xám bền à xác định thể tích H2SO4 đã chuẩn độ à xác định lượng đạm tổng số bằng công thức + Công thức tính lượng Nitơ toàn phần trong mẫu chitosan: Trong đó: c: Nitơ toàn phần (g/100g) V: thể tích H2SO4 0.1N dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) P: trọng lượng mẫu ĐK: độ khô của mẫu thử (%) + Công thức tính độ khô của mẫu chitosan: Trong đó: m1: khối lượng mẫu đem sấy ban đầu m2: khối lượng mẫu không đổi sau thời gian sấy (g) + Công thức tính độ deacetyl hóa: Trong đó: c: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan đem kiểm nghiệm a: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitin theo lý thuyết b: hàm lượng % nitơ toàn phần trong mẫu chitosan theo lý thuyết Với a, b tính được là: a=14/203=6.89 (%); b=14/161=8.69(%) 7. Phương pháp đánh giá chất lượng sản phẩm Chitosan: a. Thử độ tinh khiết: Ø Giới hạn polypeptide và acidamin: Cân chính xác 1g Chitosan nghiền mịn với 50ml nước cất. Đun sôi 10ph, lấy dịch lọc trong (A). Lấy 5ml dịch lọc A thêm 3 giọt NaOH 10% và 1 giọt CuSO4 1% lắc đều. Không có màu xanh tím của phản ứng Urê. Lặp lại thí nghiệm để có dịch lọc A, cho vào A vài giọt dung dịch Ninhydrin 0.1%, lắc đều. Dung dịch không có màu xanh tím. Ø Độ tro: Cân chính xác 1g Chitosan trong chén sứ (đã được nung đến khối lượng không đổi). Nung trong lò ở 650oC đến khi được tro trắng và khối lượng không đổi. Cân và xác định độ tro. b. Xác định pH: Cân 10g Chitosan nghiền mịn trong 100ml nước cất đun sôi, để nguội. Lọc lấy nước trong, đem đi xác định pH bằng máy đo pH. c. Xác định độ deacetyl hóa của Chitosan: Chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của Chitin nên việc xác dịnh mức độ deacetyl hóa là cần thiết. Người ta thường sử dụng phương pháp quang phổ hồng ngoại, mẫu đo được ép viên với KBr. Độ deacetyl hóa được xác định theo công thức: Độ N-acetyl hóa được ác định theo công thức: Với A1655: diện tích của đỉnh quang phổ ứng với bước sóng 1655 cm-1 A3450: diện tích của đỉnh quang phổ ứng với bước sóng 3450 cm-1 d. Xác định độ ẩm: Sử dụng máy đo độ ẩm SCALTEC SM001. e. Xác định hàm lượng kim loại nặng. f. Xác định độ nhớt: Đo để phản ánh cùng lúc tính tan và tính bị cắt mạch của Chitosan. Dùng Chitosan thô để đo độ nhớt. g. Xác định hiệu suất thu sản phẩm ứng với 100g Chitin: Lấy 10g Chitin ẩm từ 9-55% đem thực hiện phản ứng deacetyl hóa thu được b1 g Chitosan thô (ẩm A1%). Từ b1 g lấy b2 g Chitosan thô (ẩm A1%) đem hòa tan trong 500ml acid acetic 2%, khuấy tan hoàn toàn, lọc lấy phần dung dịch bên dưới màng lọc, đem kết tủa dung dịch thu được bằng NaOH 5%, thu kết tủa, đem lọc rửa đến khi hết kiềm, sấy thong gió thu được b3 g Chitosan tinh (độ ẩm A3%). Hiệu suất H của quá trình xác định theo công thức: Với: III. Ứng dụng Chitosan trong chế biến và bảo quản rau trái 1. Bảo quản rau trái bằng màng bao Chitosan: a. Đặc điểm của màng bao chitosan: P Là một lớp màng mờ bao bọc bên ngoài rau quả P Được tạo thành bằng cách nhúng rau quả vào dung dịch chitosan pha sẵn với nồng độ xác định P Màng bao chitosan có thể dùng để bảo quản các loại rau trái đông lạnh, các sản phẩm fresh-cut… b. Tác dụng bảo quản của màng bao chitosan P Kiểm soát thành phần không khí bên trong màng bao: + Thông thường người ta hay dùng màng PE để bao gói các loại thực phẩm khô. Nếu dùng PE để bao gói các thực phẩm tươi sống thì có nhiều bất lợi do không khống chế được độ ẩm và độ thoáng không khí (oxy) cho thực phẩm. + Trong khi bảo quản, các thực phẩm tươi sống vẫn "thở", nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển. + Chitosan có khả năng thấm chọn lọc O2 và CO2, trong đó O2 bị hạn chế hơn so với CO2 nhờ đó sẽ giải quyết được các vấn đề trên P Hạn chế quá trình hô hấp và quá trình chín: + Nhờ khả năng thấm chọn lọc O2 hơn so với CO2 nên tỉ lệ O2 bên trong màng bao thấp hơn tỉ lệ CO2 , nhờ đó quá trình hô hấp của rau trái bị hạn chế + Tỉ lệ CO2 làm cho sự sản sinh khí etylen bị hạn chế, nhờ đó làm chậm quá trình chín của rau trái P Hạn chế sự thoát hơi nước và đảm bảo cấu trúc sảm phẩm: + Do có cấu trúc mạng, màng chitosan có khả năng hạn chế hơi nước thấm qua, nhờ đó hạn chế sự thất thoát hơi nước à hạn chế giảm trọng lượng, đảm bảo cấu trúc của rau quả P Làm rau trái lâu bị thâm, đảm bảo màu sắc cho rau trái: + Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị + Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon. Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho màu sắc của rau quả tươi lâu hơn. P Hạn chế giảm lượng đường và acid: + Rau quả bị giảm lượng đường và acid trong quá trình bảo quản là do các phản ứng hô hấp, sử dụng đường và acid, giải phóng năng lượng. + Màng bao chitosan ức chế hô hấp nên cũng hạn chế giảm lượng đường và acid của rau trái trong quá trình bảo quản. P Màng bao chitosan có khả năng kháng nấm và vi khuẩn: + Cơ chế kháng nấm và vi khuẩn của chitosan: hiện nay đã có nhiều giả thiết về cơ chế kháng VSV của chitosan nhưng chưa có giả thiết nào giải thích đầy đủ. Cơ chế hợp lý nhất: chitosan là đại phân tử tích điện dương, trong khi màng tế bào VSV đa số tích điện âm, do đó xảy ra tương tác tĩn