Đề tài Ứng dụng của tế bào gốc da trong chữa bỏng

ớp trong trở nên đặc, kết hợp với các sợi nhỏ tạo thành một vành liên tục quanh tế bào. Thể liên kết dưới kính hiển vi, quan sát thấy chúng được tạo thành hai mảnh đặc biệt đối diện của hai mảng bào tương thuộc hai tế bào nằm cạnh nhau. Tại đó khoảng gian bào rộng ra và chứa một chất có mật độ điện tử thấp. Từ vị trí thể liên kết, các sợi sừng tỏa đều ra các vùng bào tương xung quanh. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 14 Khe liên kết còn gặp ở nhiều loại tế bào khác: cơ trơn, cơ tim, mô thần kinh,... Khoảng gian bào hẹp lại chỉ khoảng 2mm, có những đơn vị kết nối hình ống nối xuyên ngang hai màng tế bào cạnh nhau. Lòng ống cho phép các ion, phân tử có kích thước nhỏ (dưới 1000 Da) di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác. Đây chính là synap điện, cơ sở cấu trúc truyền thông tin giữa hai tế bào biểu bì. Khe liên kết Thể liên kết ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 15 Sự phân cực của tế bào được biểu hiện rất rõ ở các tế bào biểu mô: phần bào tương phía trên hoàn toàn khác với phần phía dưới nhân. Sự phân cực này có liên quan mật thiết tới các chức năng của tế bào biểu bì. Mặt tự do của các tế bào biểu bì thường tạo các khía (giống như bàn chải) để tăng diện tích tiếp xúc và giữa các khía là những xơ actin. 2.1.3. Lớp trung bì Trung bì là mô liên kết vững chắc bao gồm các chất nền, các tế bào liên kết, các sợi đàn hồi, nang lông, mạch máu sợi thần kinh và các thụ quan. Bề dày của lớp trung bì phát triển tùy từng vùng, nơi dày nhất có thể lên tới 2mm. Trung bì được chia làm hai lớp tuy nhiên ranh giới không rõ ràng. 2.1.4. Màng cơ bản Là ranh giới chỗ nối giữa trung bì và biểu bì, nếu các tế bào biểu bì bên trên và trung bì bên dưới. Nó có cấu trúc mô xơ liên kết, có chức năng ngăn cản sự thoát các phân tử có trọng lượng phân tử lớn hơn 40 KDa nhưng vẫn cho phép tế bào Langerhans, tế bào Merkel, các tế bào lympho và các hắc tố bào đi qua chúng. Màng cơ bản gồm bốn lớp là: lớp nền của tế bào gốc, lớp lá trong suốt, lớp lá dày và lớp lá dưới. Thành phần của màng cơ bản gồm các chất: kháng nguyên Bullous pemphigoid (là một glyprotein 200.000 Da), Laminin (glyprotein 1x10 Da), Collagen IV và VII. 2.1.5. Sự phân bố mạch và thần kinh Những tiêu động mạch dinh dưỡng cho da đến từ hai đám rối mạch, một khu trí giữa lớp nhú và lớp lưới, đám rối còn lại nằm giữa trung bì và hạ bì. Sự phân bố thần kinh ở da rất đa dạng nhằm tiếp nhận các kích thích của môi trường. Ước tính, mỗi cm da chứa tới 70 cm mạch máu, 55 cm dây thần kinh, 100 tuyến mồ hôi, 15 tuyến nhờn, 230 thụ quan cảm giác và một số tuyến dịch. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 16 Ngoài ra trong lớp da, các đầu mút thần kinh trên đến tiếp xúc với các tế bào biểu mô cũng như các tuyến phụ thuộc da, quanh các nang lông. 2.1.6. Cấu trúc phụ trên da Lông Lông phủ trên toàn bộ cơ thể, chúng có tác dụng như một giác quan phụ, bảo vệ điều hòa thân nhiệt, giúp dể thoát mồ hôi. Lông được phát triển từ các tế bào bị sừng hóa và chiều dài tự nhiên biến động từ vài mm tới hàng mét (tóc), tiết diện từ 0,005 - 0,6 mm tùy theo từng vùng. Cấu tạo chung, lông gồm rễ lông nằm dưới da và được bao bởi bao chân lông. Tại đây, lông phình ra gọi là hành lông, nơi có cơ trơn vận lông bám vào. Phần trên là thân lông và ngọn lông. Trên tiết diện cắt ngang, phần ngoài cùng mỏng bao bọc gọi là màng lông, tiếp ngay đến là vỏ lông, nơi chứa các phân tử sắc tố melanin, trong cùng là tủy lông bị sừng hóa dần từ hành lông tới ngọn lông. Móng Đây là cấu trúc đã hóa sừng của phần thượng bì nằm ở mặt mu của các ngón tay, ngón chân. Chức năng chủ yếu của móng là để bảo vệ ngón. Móng có phần thân lộ ra ngoài và phần rễ ăn sâu trong lớp da. Giữa da và rễ móng có một phần rãnh được gọi là lớp sừng trên móng và một vùng da bị sừng hóa được gọi là lớp sừng dưới móng. Hai bên gờ của móng là lớp sừng quanh móng tiếp xúc với ít da hơn. Quan sát phía trước của lớp sừng trên móng có hình bán nguyệt màu trắng đục, đó là nơi đang trong giai đoạn sừng hóa. Các chấm trắng lốm đốm là sự sừng hóa chưa hoàn toàn. Các tuyến của da Có ba tuyến: ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 17 - Tuyến nhờn: gọi là tuyến bã đổ vào nang tuyến (trừ các khu vực không có lông thì đổ trực tiếp ra da), sản phẩm của tuyến này giúp da luôn có độ ẩm, mềm mại và chống thấm nước nhưng lại thoát hơi nước. - Tuyến mồ hôi: có cấu trúc ống, phần dưới cuộn lại thành búi nằm rất sâu dưới da, phần trên nối ra bề mặt da. Trên toàn bộ diện tích da có khoảng 200 triệu tuyến, mật độ cao nhất ở các lòng bàn tay, bàn chân và hốc nách. Ở phần da môi không có tuyến mồ hôi. Tuyến mồ hôi còn là nơi cư trú chủ yếu của các vi sinh vật sống cộng sinh. Việc tiết mồ hôi liên quan đến điều hòa thân nhiệt. Bình thường mồ hôi tiết liên tục nhưng ít, trung bình một ngày khoảng nửa lít. Khi môi trường nóng bức, hoạt động mạnh, bệnh lý... lượng mồ hôi tiết tăng lên một lượng lớn theo nghiên cứu khoảng 5 - 6 lít một ngày. - Tuyến sữa gồm một đôi tuyến trước ngực, chúng có nguồn gốc biệt hóa từ tuyến mồ hôi. Tuyến này có liên quan mật thiết tới các hoạt động sinh dục của con người. Nó có thể được coi như một bộ phận sinh dục ngoài của cơ thể. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 18 Cơ thể con người được cấu tạo từ tế bào, trong cơ thể có khoảng 100.000 tỷ tế bào với trên 200 loại tế bào khác nhau. Cơ thể con người có khả năng kỳ diệu đó là sự tái tạo, tái sinh của nhiều loại tế bào, mô dạng. Đặc trưng cho khả năng trên là tế bào gốc. 2.2. Tế bào gốc 2.2.1.Khái niệm Tế bào gốc là những tế bào không chuyên biệt hoặc chưa phân hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng sinh lý. Tế bào gốc có khả năng tự làm mới, phân chia không giới hạn, tự khuếch đại và khả năng biệt hóa. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 19 Chúng cấu tạo nên 5 nhóm mô chính trong cơ thể con người, gồm: biểu mô, mô liên kết, máu, mô thần kinh, cơ. Dựa trên góc độ phân chia tế bào (cell division), có 3 nhóm tế bào biệt hoá (types of differentiated cells): - Nhóm một gồm: tế bào lăng kính mắt, tế bào thần kinh, tế bào cơ tim. - Nhóm hai gồm: nguyên bào sợi của da, tế bào cơ trơn, tế bào nội mạc thuộc hệ mạch máu, tế bào biểu mô của đa số các nội tạng như gan, tụy, thận, phổi, tuyến tiền liệt, tuyến vú. - Nhóm ba gồm: các tế bào biểu bì, các tế bào biểu mô ống tiêu hóa. 2.2.2. Phân loại tế bào gốc theo khả năng biệt hóa Tế bào gốc đa năng (totipotent) là: tế bào gốc có khả năng phát triển và phân hóa thành mọi loại tế bào khác, phụ thuộc vào điều kiện phát triển của tế bào và ảnh hưởng của điều kiện môi trường. Tế bào gốc toàn năng gồm: các hợp tử sau khi thụ tinh, một số tế bào phôi sớm ở động vật và nhiều loại tế bào thực vật. Tế bào gốc toàn năng có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 20 Tế bào gốc đa năng (pluripotent, multipotential): thế hệ kế tiếp được tạo thành từ tế bào gốc toàn năng. Tế bào gốc đa năng có thể biệt hóa và phát triển thành nhiều loại tế bào khác ngoài tế bào toàn năng (totipotent). Tế bào gốc đa năng là những tế bào gốc biệt hóa thành hầu hết các mô trong cơ thể, các tế bào gốc đa năng thu nhận từ phôi sớm, gọi là tế bào gốc pluripoten. Tế bào gốc đa năng thu nhận từ tế bào trưởng thành được gọi là tế bào gốc multipotent. Tế bào gốc đơn năng đơn hướng (unipotent): đây là những tế bào gốc có thể sinh ra một loại tế bào. Tế gốc biệt hóa hình thành hai hay nhiều loại tế bào cùng nhóm gọi là tế bào gốc đơn năng đa hướng (oligopotent) như: tế bào gốc biểu mô biệt hóa hình thành vài loại tế bào biểu mô khác nhau. 2.2.3. Phân loại tế bào gốc dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc Dựa vào vị trí thu nhận tế bào gốc từ các mô, cơ quan của cơ thể có thể chia thành nhiều loại tế bào gốc khác nhau như: Tế bào gốc phôi thu nhận từ các nút phôi ở giai đoạn đầu phát triển phôi. Tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ các mô hoặc cơ quan trong cơ thể trưởng thành. Tế bào gốc trưởng thành có thể tự đổi mới hoặc biệt hóa thành các loại tế bào khác. Tế bào gốc da có thể thu nhận từ tế bào gốc trưởng thành. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 21 2.3. Biệt hóa tế bào Biệt hóa tế bào gốc: là quá trình biến đổi từ tế bào gốc không có chức năng chuyên biệt thành tế bào chuyên hóa. Khả năng biệt hóa của các loại tế bào gốc phụ thuộc vào bản chất của tế bào gốc, tác động của các yếu tố thông tin đến tế bào và điều kiện phát triển của tế bào. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 22 Soma Mầm phôi Tế bào gốc người Thai nhi Trẻ sơ sinh Phôi thai Người lớn Ruột Tuyến tụy Mắt Thần kinh Gan Biểu bì Hemopoietic Trung mô ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 23 2.3. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu bì Da là hàng rào chắc chắn đầu tiên bảo vệ cơ thể khỏi mất nước, ngăn chặn các tổn thương và sự xâm nhiễm. Để đáp ứng những yêu cầu này, da đã có một quá trình biệt hóa khá phức tạp, làm cho da trở lên dai chắc, không thấm nước và luôn tự đổi mới. Tế bào sừng đóng một vai trò khá quan trọng trong quá trình này.Và biệt hóa là quá trình đóng vai trò chủ chốt trong quá trình tự đổi mới của da. Ở lớp đáy các tế bào sừng gốc đi vào một chu trình biệt hóa được gọi là chu trình biệt hóa cuối cùng để tạo thành các tế bào chết hóa sừng, hình thành một lớp màng sừng bảo vệ cơ thể. 2.3.1. Cơ chế biệt hóa của tế bào gốc biểu bì ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 24 Vị trí của các tế bào sừng trong quá trình biệt hóa ở biểu bì: Như đã biết ở trên, biểu bì gồm 5 lớp. Các tế bào gốc và các tế bào sừng có khả năng tăng sinh rất mạnh chỉ có trong lớp sâu nhất của biểu bì (là lớp đáy). Các tế bào gốc bám chặt vào màng nền. Cho đến khi các tế bào ở lớp đáy nhiều lên, một số tế bào bắt đầu di chuyển khỏi lớp này lên bề mặt da. Và chúng mất một khoảng thời gian là 25 - 50 ngày. Sự thay đổi đầu tiên là các tế bào ở lớp đáy ngừng sản xuất chất sừng 5 - 14 ngày sau khi tách khỏi màng nền. Sự chuyển đổi trong biểu hiện gen xuất hiện khi tế bào sừng từ lớp hạt đi lên lớp sợi và chúng bắt đầu tổng hợp protein filaggrin và loicrin. Các tế bào sừng khi ở trong lớp sợi cuối cùng suy yếu đi và hoạt hóa gen transglutaminase ở biểu bì, chúng xúc tác các liên kết chéo của protein màng cho tới khi các tế bào sừng ở lớp sợi chết đi, thì các vảy hay bộ xương tế bào chứa đầy chất sừng do chúng để lại và protein liên kết. Xác của các tế bào chết tạo thành một mảng bảo vệ ở lớp sừng, sau đó màng tạo thành các lớp vảy và dễ bị tróc ra. 2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng a. Ảnh hưởng của môi trường đến biệt hóa tế bào Các chất dinh dưỡng , chất độc, áp suất, nhiệt độ,... ảnh hưởng rõ rệt đến biệt hóa tế bào động vật. Ví dụ, nuôi cấy các tế bào gốc phôi (ES) chuột ở các môi trường có chất dinh dưỡng, nồng độ CO2, và nhiệt độ khác nhau, có thể tạo nên các loại tế bào khác nhau. Trong nuôi cấy mô thực vật,điều kiện chất dinh dưỡng và môi trường quyết định quá trinh tạo calus… Khả năng biệt hóa và tái sinh của da, phụ thuộc vào nồng độ một loại protein đặc hiệu. b.Tác động của tín hiệu tế bào đến quá trình biệt hóa ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 25 Biệt hóa tế bào có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển của mọi sinh vật, từ hợp tử đến cơ thể trưởng thành. Trong quá trình biệt hóa hình thành các mô và hệ cơ quan của cơ thể, mỗi lớp tế bào của phôi sớm có các quá trình biệt hóa khác nhau, chịu ảnh hưởng của nhiều loại tác nhân môi trường. Mọi tế bào có khả năng tiếp nhận và xử lý nhiều loại thông tin từ môi trường như hàm lượng các chất dinh dưỡng, hàm lượng oxy, nhiệt độ, áp suất… Trong quá trình biệt hóa của nhiều loại tế bào khác nhau, tín hiệu tế bào giữ vai trò vô cùng quan trọng. Từ một loại tế bào gốc đa năng hình thành nên nhiều loại tế bào gốc khác nhau nhờ tác động của các loại tín hiệu tế bào (signal) khác nhau. Tế bào trả lời tín hiệu bằng nhiều con đường khác nhau như ức chế hay hoạt hóa gen, thay đổi bề mặt tế bào, thay đổi hoạt hóa enzyme,... Mỗi loại tế bào đều có cơ chế tiếp nhận tín hiệu, truyền tín hiệu và trả lời tín hiệu khác nhau, làm cho từ một loại tế bào gốc có thể biệt hóa các loại tế bào khác nhau. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 26 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc tạo da phụ thuộc vào sự tác động và điều chỉnh của hàng loạt tín hiệu tế bào. Các tín hiệu tế bào khác nhau tác động vào tế bào gốc tạo da dẫn đến các quá trình biệt hóa khác nhau, hình thành các loại tế bào khác nhau. c. Vai trò của gen trong quá trình biệt hóa Biệt hóa tế bào là quá trình tất yếu trong quá trình phát sinh và phát triển của mỗi cơ thể sống. Biệt hóa tế bào giúp một hợp tử sau thụ tinh phân hóa thành nhiều lớp tế bào phôi, từ đó biệt hóa thành nhiều loại mô, cơ quan trong mỗi cơ thể. Trong quá trình biệt hóa của mỗi loại tế bào, vai trò của các gen biệt hóa có ý nghĩa quyết định. Cơ chế tác động của từng loại gen đến quá trình biệt hóa của nhiều loại tế bào khác nhau còn chưa được nghiên cứu đầy đủ. d. Cơ chế biệt hóa tế bào còn chịu một số ảnh hưởng của Hormone, các yếu tố tăng trưởng và vai trò của ion Ca2+ - Khi tế bào sừng được nuôi cấy tên môi trường không có huyết thanh được bổ sung Hormone như insulin và protein EGF. EGF là protein được sản xuất từ tá tràng và tuyến nước bọt, DGF có thể thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và kích thích sự tăng trưởng mới ở da cũng như ở bề mặt ruột và màng sừng. Trên màng của tế bào sừng người chứa receptor của insulin, trong suốt sự phát triển của tế bào receptor ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 27 làm tăng khả năng tăng sinh của tế bào. Hydrocorticone và các hormon khác cũng ảnh hưởng đến kích thước quần thể tế bào, nếu thiếu kích thước của quần thể bị ảnh hưởng. - Ion canxi (Ca2+) ảnh hưởng tới sự biệt hóa và tăng trưởng của thế bào sừng, muốn điều chỉnh quá trình tăng sinh và phân tầng của tế bào sừng ta có thể thay đổi nồng độ ion Ca2+ ngoại bào trong nuôi cấy mô invitro. Đây có thể coi là sự điều chỉnh sinh lý bình thường như trong cấu trúc biểu bì, có sự chênh lệch nồng độ ion Ca2+ rõ ràng giữa những tế bào của lớp đáy so với những tế bào ở lớp trên. Nồng độ ion Ca2+ thấp thúc đẩy sự tăng sinh, nồng độ cao làm giảm sự biệt hóa của tế bào sừng. Trong nuôi cấy invitro, lượng tế bào tăng nhanh khi nồng độ Ca2+ khoảng 0,03 – 0,1mM. Trong môi trường DMEM, lượng tế bào tăng khi nồng độ Ca2+ khoảng 0,03 – 0,1mM. ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 28 III. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ TRIỂN VỌNG Hiện nay, việc nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là y sinh học đã điều trị được rất nhiều bệnh nguy hiểm (ví dụ như chữa trị các bệnh liên quan đến tim mạch, thần kinh, ung thư, bỏng,…). 3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Hàng loạt kỹ thuật tiên tiến trong điều trị bỏng như ghép da (ghép da sớm, ghép da đồng loại, ghép da mảnh siêu nhỏ,…), siêu lọc máu liên tục, kỹ thuật nano, nuôi cấy nguyên bào sợi, nuôi cấy nguyên bào sừng, nuôi cấy tế bào gốc, sử dụng vạt da siêu mỏng có nối mạch vi phẫu,... 3.1.1. Việc nuôi cấy nguyên bào sợi, nguyên bào sừng biểu bì được thực hiện từ năm đầu thế kỷ XX, với việc sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau. Dưới đây là một số môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào sừng - Môi trường có huyết thanh: Huyết thanh động vật thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy như một nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển. Trong môi trường nuôi cấy, huyết thanh hoạt động như một chất đệm pH; cung cấp hormon và các nhân tố tăng trưởng; protein; chất dinh dưỡng; chất ức chế các protease;…cần cho sự tăng trưởng và duy trì chức năng cho tế bào sau này. Nồng độ huyết thanh thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy tế bào sừng là 5%, 10%, 20%. Tuy nhiên, huyết thanh không không phải là nguyên liệu tốt nhất để tạo nên một môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng và biểu hiện chức năng của tế bào. Do ta không thể xác định được nguồn gốc tự nhiên của huyết thanh; huyết thanh lại rất dễ bị biến đổi thành phần và dễ bị nhiễm các tác nhân vi nấm, virus,…; một vài nhân tố trong huyết thanh (như HDL, LDL,…) không bền khi bảo quản lâu dài ở nhiệt độ thấp. Mặt khác huyết thanh còn kích thích sự biệt hóa của những tế bào ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 29 tiến tới trạng thái không phân bào nguyên nhiễm làm cho những tế bào này không duy trì như một dòng tế bào bất tử [25]. - Feeder nguyên bào sợi: Phương pháp này đầu tiên được mô tả bởi Rheinwald và Green (1975), dựa trên sự nuôi cấy đồng thời tế bào sừng với nguyên bào bị chiếu xạ. Nguyên bào sợi chuột của dòng tế bào 3T3 lấy từ khối u của chuột nhắt bị chiếu xạ liều cao. Nguyên bào sợi chuột được nuôi trong môi trường D’MEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) có nồng độ glucose cao, bổ sung 10% FBS, Penicillin - Streptomycin (100 UI/ml – 100 µg/ml), dung dịch đệm Bicarbonate sodium 1N với một lượng phù hợp tế bào được chiếu xạ (mục đích để các tế bào này không tăng sinh nhưng vẫn tiết ra một số chất giúp cho sự tăng trưởng của tế bào sừng). Khi những tế bào này tạo được 50% mật độ trong đĩa nuôi cấy thì được sử dụng như một giá thể trực tiếp cho cho việc nuôi cấy tế bào sừng. Môi trường nuôi cấy tế bào sừng là hỗn hợp giữa môi trường D’MEM (có nồng độ glucose cao) và môi trường Ham’s F12 (có bổ sung 10% FBS) với tỷ lệ là 3:1. Với tiến bộ kỹ thuật mô hiện nay, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều loại màng nhân tạo, bán nhân tạo bằng collagen, polymer,…để sử dụng như một lớp nâng đỡ, tạo điều kiện tốt cho sự tăng trưởng cho tế bào sừng[18]. - Môi trường không huyết thanh: Môi trường nuôi cấy không sử dụng huyết thanh và các lớp nâng đỡ đã khắc phục được một số hạn chế của việc nuôi cấy tế bào sừng trong môi trường có huyết thanh hay lớp nâng đỡ. Mặt khác, do sự thay đổi về cả chất lượng lẫn số lượng các thành phần cơ bản (như các acid amin, vitamin, nguyên tố đa và vi lượng,…) nên cần phải bổ sung vào môi trường các thành phần khác (như EGF, insulin, transferrin, hydrocortisone, dịch trích tuyến yên bò BFE). ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 30 Tuy nhiên môi trường nuôi cấy này có những hạn chế như: số lượng lần cấy chuyển sau khi nuôi sơ cấp trong môi trường này ít hơn so với môi trường có bổ sung huyết thanh, việc bổ sung các chất cần cho sự tăng sinh của tế bào (như BPE,…) cũng gặp khó khăn (như nguồn cung cấp hiếm, dễ bị nhiễm khuẩn, giá thành cao và đặt biệt là không xác định được nguồn gốc ). Hiện nay trên thị trường có nhiều môi trường nuôi cấy chuyên biệt tế bào sừng không bổ sung huyết thanh như môi trường MCDB 151, MCDB 153, MCDB 154, Epilife,… Trong đó, môi trường Epilife là môi trường cơ bản để nuôi cấy tế bào sừng và những tế bào biểu bì khác. Trong môi trường Epilife, tế bào sừng tăng sinh mạnh, khoảng thời gian sống dài và có thể tạo được 45 – 60 thế hệ [19]. 3.1.2. Công nghệ sử dụng tế bào gốc Hiện nay, các sản phẩm thay thế da có chứa tế bào gốc không chỉ tạm thời ngăn chặn sự mất nước của cơ thể và nhiễm trùng do vi khuẩn, mà còn đạt được hiệu quả sửa chữa đạt yêu cầu. Giúp tối ưu quá trình chữa lành vết thương do bỏng cũng như các yêu cầu. Trị liệu tế bào gốc có thể nâng cao chất lượng chữa lành vết thương bỏng, làm giảm sự hình thành các vết sẹo và thiết lập lại chức năng bình thường của da và phần phụ của nó. Các nguồn chính của các tế bào gốc có thể được sử dụng để sửa chữa và tái sinh cho các tế bào da bị tổn thương là những tế bào gốc phôi (ESCs) và các tế bào gốc trưởng thành. Trong năm 2007, Yamanaka và các đồng nghiệp sản xuất thành công tế bào gốc toàn năng từ nguyên bào sợi da người lớn, các tế bào soma của người khác và có những đặc điểm tương tự như ESCs. Khuyến khích việc sử dụng tế bào gốc trưởng thành, các tế bào gốc trung mô đặc biệt (MSC) đang được hiện thực hóa trong điều trị bỏng. MSC có thể được phân lập từ tủy xương và các mô khác, chẳng ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 31 hạn như mô mỡ, máu dây rốn và tế bào da. Các tế bào gốc từ máu dây rốn có thể biệt hóa thành keratinocytes, tế bào gốc-mỡ (ADSCs) có thể thúc đẩy sự phát triển nguyên bào sợi da và tái biểu mô của vết thương da[1]. Hiện nay, có một số phương pháp để sử dụng tế bào gốc, bao gồm cả tiêm treo tế bào ( tấm di động hoặc da mô thiết kế. 3.1.3. Theo nghiên cứu mới nhất của các nhà khoa học thuộc Trung tâm điều trị bỏng, Đại học quốc gia Utah (Mỹ) vừa hoàn thành thí nghiệm liệu pháp điều trị phun tế bào gốc vào vị trí vết thương cục bộ của bệnh nhân. Liệu pháp điều trị trên được tạo ra bằng cách kết hợp giữa tiểu cầu không có khả năng làm đông máu ở bệnh nhân bỏng với tế bào gốc chứa canxi và thrombin. Thí nghiệm cho thấy ngoài việc điều trị vết bỏng cục bộ, liệu pháp trên còn có thể giúp cải thiện quá trình làm lành da được cấy ghép. Liệu pháp điều trị phun tế bào gốc vào vết bỏng cục bộ của bệnh nhân không những điều trị hiệu quả vết bỏng cục bộ, mà còn có ý nghĩa quan trọng ứng dụng trong các loại hình phẫu thuật cấy ghép khác[2]. 3.1.4. Phương pháp trị liệu tế bào gốc có là một phương pháp tối ưu trong điều trị bỏng hay không? Mặt khác, sự bất ổn định trong điều kiện và môi trường nuôi cấy dẫn đến sự suy thoái về cấu trúc và các mô. Cơ chế điều khiển quá trình lão hóa tế bào gốc vẫn là một bí ẩn lớn đối với các nhà khoa học. Hiện nay còn rất nhiều vấn đề cần phải giải quyết trước khi tế bào gốc được áp dụng rộng rãi trong thực tế. 3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong việc điều trị bỏng diện rộng phổ biến hiện nay đang được áp dụng ở nhiều bệnh viện trong cả nước là kỹ thuật sử dụng nguồn da ghép tự thân nhưng rất hạn chế, thì phương pháp trị liệu tế bào là một giải pháp khả thi. Ở một vài bệnh viện chuyên khoa bỏng đang áp dụng kỹ thuật tiên tiến như nuôi và cấy ghép ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC DA TRONG CHỮA BỎNG SVTH: Nguyễn Thị Xuân Hà - Nguyễn Thị Hiền - Lưu Thị Lan 32 nguyên bào sợi, tế bào sừng,… trong điều trị tổn thương do bỏng (Viện bỏng Quốc gia Việt Nam). 3.2.1. Công nghệ nuôi cấy tế bào da hiện nay Các tế bào da (tế bào sừng, nguyên bào sợi …) sau khi được tách từ mẫu da sẽ được đưa vào môi trường nuôi cấy trên các đĩa nuôi cấy, sau một thời gian (khác nhau tùy từng loại tế bào) từ một số tế bào ban đầu, các tế bào sẽ phát triển, nhân lên và liên kết với nhau để tạo nên các “màng” tế bào nuôi cấy. Do sự liên kết giữa các tế bào rất mong manh, dễ vỡ, dễ đứt rách, hơn nữa việc đưa các màng tế bào này để ghép lên nền vết bỏng rất khó khăn, nên tỉ lệ thành công khi ghép các màng nuôi cấy trên lâm sàng thường không cao. Các màng này rất dễ bị tiêu hủy do nhiễm khuẩn và chất lượng liền sẹo cũng hạn chế. Mặt khác việc phối hợp giữa nuôi cấy và lâm sàng cũng nhiều bất cập (ví dụ khi tế bào da có thể ghép được thì vết thương lại chưa đủ điều kiện để ghép, và ngược lại khi vết thương đủ điều kiện để ghép thì các tế bào chưa đủ tuổi hay mật độ cần thiết hoặc đã quá già để ghép). Để khắc phục những nhược điểm trên hiện nay đã có những thay đổi lớn trong công nghệ nuôi cấy tế bào da, đó là việc tìm ra các giá đỡ để cho tế bào phát triển, nhân lên trên đó trong quá trình nuôi cấy. Thay vì chỉ nuôi cấy các tế bào trong môi trường nuôi cấy, trên đĩa nuôi cấy đơn thuần thì người ta cấy các tế bào trên một loại màng nền như một giá đỡ cho tế bào. Các giá đỡ này phải đảm bảo là có thể sử dụng để đắp lên vết thương và cho phép các tế bào phát triển bình thường trên đó. Khi mật độ và tuổi của tế bào phù hợp ghép, người ta đưa cả tấm giá đỡ này cùng với các tế bào trên đó để ghép lên vết thương, vết bỏng. Nhờ phát minh này cùng với việc sử dụng các màng si