Đề tài Vi nhân giống lan hài (Paphiopedilum)

iển. 9. Hài Lùn (Paph. helenae): hài hê len Paphiopedilum helenae được Averyanov phát hiện lần đầu ở Cao Bằng vào tháng 10 năm 1995. Averyanov đã lấy tên của vợ là Helen để đặt cho cây lan này. Hài helenae thuộc loài lan đất mọc trong hốc đá ở Cao Bằng và Nam Trung Quốc. Cây có 3-4 lá, hình trái xoan thuôn, dài 4-12cm, rộng 1-2cm có 3 răng ở đỉnh. Lá màu lục đậm, vân màu trắng ngà, gốc lá có đốm tím. Phát hoa mang hoa đơn, cuống hoa có lông mịn. Hoa lớn khoảng 5-7cm, cánh đài màu vàng tươi viền trắng. Cánh tràng màu cam nâu nhạt, có vài sọc màu đỏ nhạt. Cánh môi màu vàng nâu nhạt, dạng túi phình ở đáy.Cây trong tự nhiên ra hoa vào khoảng tháng 9 đến tháng 11.Cây này được giới thiệu tại VN Paph. helenae var. sanderae 10. Hài Bắc (Paph. henryanum)- hài hen ry Hài Hằng nở hoa tự nhiên từ tháng tư tới tháng 5. Loài này thường sống trên các kẽ đá phủ rêu trên vùng núi đá vôi ở độ cao khoảng 450-750m ở miền Bắc VN. 11. Hài Lông (Paph. hirsutissimum) 12.Hài Râu (Paph. parishii) 13. Hài Tía (Paph. purpuratum) 14. Hài Vàng hay Kim hài (Paph. villosum). Loài lan đất hay sống phụ sinh, thân ngắn. Lá hình giải, dài 30cm - 45cm, rộng 3 - 4cm, đỉnh chia 2 thùy tròn, mặt trên màu lục bóng, mặt dưới có các đường vằn tiá sát góc. Cụm hoa thẳng, dài 20 - 30cm, có lông, đỉnh có 1 - 2 hoa. Hoa lớn 12 - 15cm, màu hồng, cánh đài lưng màu lục có vân dọc, mép trắng hơi lật ra sau. Cánh tràng hơi chúc xuống và cong ra phía trước, mép răn reo, giữa có vạch lớn màu nâu đỏ. Cánh môi dạng túi màu vàng lục hơi nâu mép màu vàng nâu và thùy bên cuộn vào trong. Phân bố:Cây mọc và trồng ở Đà Lạt (Lâm Đồng) và phân bố ở Lào, Thái Lan, Mianma, Ấn Độ. Nhóm 2: gồm các chi còn lại như Cypripedium, Phragmipedium, Mexipedium, Selenipedium sống ở vùng Bắc Á, Âu châu và Mỹ châu. 1. Cypripedium : Chi lan hài Cypripedium có khoảng 47 loài sống ở những vùng khí hậu lạnh như miền Bắc Mỹ, Âu Châu và Bắc Á.Các giống lan hài này có thể chịu lạnh rất giỏi, mọc ngầm dưới tuyết và nở hoa ngay lúc tuyết bắt đầu tan. Cây thuộc loài lan đất, mọc thành cụm, có thân ngầm và thường niên. Lá thường có lông tơ mịn phủ mặt hình oval hay mũi mác, màu xanh non. Đa số các loại trong chi này có trục phát hoa mọc từ ngọn vươn cao thẳng lên và có lá mọc so le dọc theo thân trục; ngoài trư giống Cypripedium acaule. Hoa đơn hay thành cụm lên đến 12 hoa (như loài Cypripedium californicum) nhưng đa số thường mang từ 1 đến 3 hoa. Hoa có cấu trúc tương tự như Paphiopedilum. Đặc trưng nhất trong chi Cypripedium là loài calceolus. Hài Cypripedium đã nằm trong sách đỏ và đang được bảo vệ vì sự đô thị hoá quá độ làm thay đổi môi trường sống cũng như thu hẹp khu sinh sống của chúng. Cypripedium californicum 2. Phragmipedium: Chi lan hài Phragmipedium có khoảng 20 loài sống ở Mexico, Trung và Nam Mỹ. Rolfe đã đặt tên và phân loại chúng vào năm 1896. Phragmipedium thuộc loại lan đất , phụ sinh trên đá. Cây cao đến 80cm có lá mọc dọc suốt hai bên thân. Lá dài cả 1m màu xanh non. Trục phát hoa mọc từ đỉnh cao đến 80cm, mang 1-3 hoa ở ngọn. Một số loài trong chi này có cánh hoa rất dài, đến 50cm, rũ thòng xuống và xoắn lại như rubăng trông rất lạ mắt. Nổi tiếng nhất trong chi lan này phải kể đến Phragmipedium besseae. Phrag. besseae được Elizabeth Locke Besse lần đầu tiên phát hiện ở Peru vào năm 1981. Ngay lập tức khu vực này bị những kẻ săn lan đào bới hủy hoại. May mắn thay những hạt giống của Phragmipedium besseae đã được tâp đoàn Elizabeth thu thập và bảo quản để nhân giống đại trà. Ngoài ra Phragmipedium caudatum, lindleyanum, longifolium cũng là những đại diện đặc sắc cho chi lan hài này. 3. Selenipedium Chi lan hài có khoảng 6 loài sinh sống ở Trung và Nam Mỹ. Selenipedium được Reichenbach đặt tên và phân loại vào năm 1854. Tên Selenipedium có từ chữ Hy Lạp là selen (moon - mặt trăng) và pedium (slipper – hài). Selenipedium rất khó trồng trong nhà; và trong thiên nhiên chúng cũng rất hiếm thấy nên chi lan này cũng đang được bảo vệ tránh sự diệt chủng. Thân cây cao khoảng 50cm. Trục phát hoa có thể mang đến 50 hoa nhỏ, hoa thường có màu hồng hay maroon, rất đẹp. 4. Mexipedium: Chi lan hài chỉ có một giống duy nhất Mexipedium xerophyticum. Mexipedium xerophyticum được tìm thấy lần đầu ở Oaxaca Mexico và chỉ có ở đó mà thôi. Hơn nữa lúc phát hiện, người ta chỉ thu hoạch được có 7 cây mà thôi.Lúc đầu xerophyticum được Soto Arenas, Salaza và Hagsater mô tả và sắp vào trong chi Phragmipedium vào năm 1990. Đến năm 1992, Albert & Chase ứng dụng kỹ thuật phân tích phân loại thực vật hiện đại dựa trên cấu trúc DNA đã sắp vào chi riêng biệt Mexipedium. Tên Mexipedium để chỉ nguồn gốc của cây ở Mexico và xerophyticum có nghĩa preferring dry conditions (thích hợp điều kiện khô). Từ số lượng nhỏ ban đầu, giới khoa học hoa lan đã nhân giống và mang trồng lại ở khu nguyên sinh của chúng đã giúp cho mọi người biết đến được nét đẹp kỳ lạ và đặc biệt của một loài lan hài cực hiếm. Cây của Mexipedium xerophyticum không mọc liền nhau thành cụm mà mọc cách nhau khoảng vài cm. Lá màu xanh bạc, nhỏ và hơi đứng thẳng lên. Hoa nhỏ màu trắng hồng rất lạ mắt. II. Vi Nhân Giống Lan Hài II.1 Giới thiệu vi nhân giống Vi nhân giống là phương pháp nhân giống vô tính in vitro, với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loại cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển không thể thực hiện được. Một số phương pháp nhân giống vô tính in vitro được áp dụng như: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, đốt thân, cành bên, tạo cơ quan bất định từ các mẫu mô nuôi cấy… Một qui trình nhân giống in vitro cơ bản gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ. Cây mẹ cần phải sạch bệnh và đang ở giai đoạn tăng trưởng mạnh nhất thì khi nhân giống mới cho hiệu quả cao. Giai đoạn 2: Khử trùng mẩu cấy, ở giai đoạn này một phần thích hợp của thực vật được khử trùng và chuyển vào môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Những mẫu cấy còn sống sau khi khử trùng sẽ được chuyển sang giai đoạn 3. Giai đoạn 3: Tăng sinh. Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự tự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất định. Các chồi tăng trưởng mạnh, đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang giai đoạn 4. Giai đoạn 4: Ra rễ in vitro. Ở giai đoạn này những chồi đạt chiều cao thích hợp sẽ được chuyển sang môi trường kích thích rễ. Trong môi trường này cần phải bổ sung auxin để cảm ứng rễ và nồng độ khoáng thường giảm so với môi trường tăng sinh. Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vivo, với những cây không ra rễ in vitro thì sẽ được chuyển ra vườn ươm để ra rễ và phát triển thành cây hoàn chỉnh. II.2 Một số phương pháp vi nhân giống lan hài đã được nghiên cứu Trước kia, do Lan Paphiopedilum là giống lan đa thân nên người ta thường phương pháp tách bụi để nhân giống, đây là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và cây con tách ra có tỷ lệ sống cao nhưng do không đáp ứng đủ nhu cầu cây giống nên ngày nay người ta ít sử dụng phương pháp này. Ngày nay, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cũng đã được ứng dụng ở Lan Hài và đã đem lại những thành công mới. Tại Phân Viện Sinh Học Đà Lạt, Lan Hài Đỏ (Hồng Hài) - một giống hoa lan quý hiếm vừa nhân giống thành công bằng phương pháp ứng dụng công nghệ tế bào thực vật. Sau nhiều lần thử nghiệm nhân giống song chưa có kết quả, từ hai năm qua, những nhà khoa học ở Phân viện sinh học Đà Lạt lại áp dụng phương pháp mới trong nhân giống hoa lan hài đỏ. Đó là phương pháp gây vết thương, nuôi cấy lỏng theo công nghệ tế bào thực vật. khi dùng phương pháp này, khả năng tạo chồi rất nhanh, mặt khác cũng tìm được điều kiện sinh thái cho Lan Hài nở hoa.Vốn dĩ lan hài đỏ chỉ phân bố trên khắc nghiệt nhưng khi về nghiên cứu ở Phân Viện Sinh Học Đà Lạt thì lại nở hoa nhiều lần trong năm. Qua đây, người ta cũng chứng minh rằng Lan Hài Đỏ cũng có thể sản xuất vô tính. Đặc biệt, ở Việt Nam bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm & bằng hóa chất và kỹ thuật sinh học, đặc biệt là kỹ thuật gây vết thương trên cây con trong ống nghiệm , các nhà khoa học thuộc Viện Ứng dụng công nghệ vừa nhân giống thành công hai loài lan hài quý: Hài Hằng (đặc hữu Việt Nam) và Hài Tam Đảo (đặc hữu Đông Dương). Hai loài lan hài này nhân giống rất khó vì hạt lan hài rất nhỏ, dài chừng 1 tới 2 milimét, rộng 1 milimét, chứa rất ít hoặc hầu như không có chất dinh dưỡng dự trữ tạo điều kiện thuận lợi cho hạt nảy mầm. Do đó, nếu gieo hạt trong môi trường đất bình thường, thì hạt dễ bị mất mát và khó sinh trưởng. Vì vậy, qua nhiều lần thử nghiệm với nhiều môi trường khác nhau, các nhà khoa học đã tìm được môi trường thuận lợi nhất cho mỗi loài đạt tỷ lệ nảy mầm cao nhất và quy trình nhân giống hai loài lan quý bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm đã được xây dựng. Đồng thời, các nhà khoa học cũng đã tìm ra phương pháp tách mầm như một biện pháp bổ sung để nhân giống Hài Hằng (Paphiopedilum hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedilum Gratrixianum). Cùng với đó, các nhà khoa học bước đầu nghiên cứu thành công việc nuôi trồng những cây con trên trong vườn ươm để đưa chúng trở về với tự nhiên. Cây con được đưa từ ống nghiệm ra vườn ươm Hạt Hài Hằng và Hài Tam Đảo nảy mầm trong ống nghiệm Thụ phấn cho Hài Tam Đảo Thụ phấn cho Hài Hằng Hạt Hài Hằng và Hài Tam Đảo nảy mầm trong ống nghiệm Quả Hài Hằng và Hài Tam Đảo được thu hái để tách lấy hạt Cây con được đưa từ ống nghiệm ra vườn ươm Cây con sinh trưởng trong ống nghiệm Hài Hằng nở hoa tự nhiên từ tháng tư tới tháng 5. Loài này thường sống trên các kẽ đá phủ rêu trên vùng núi đá vôi ở độ cao khoảng 450-750m ở miền Bắc VN. Hài Tam Đảo nở hoa tự nhiên vào tháng 10 tới tháng 12. Chúng sống trên các sườn dốc núi đá ở độ cao 900-1.100m so với mặt nước biển. Thành công nói trên mở ra triển vọng nhân giống, tiến tới ươm cây con của lan Hài Hằng và Hài Tam Đảo tại các khu bảo tồn rồi đưa chúng trở lại tự nhiên. II.3 Nhân giống Lan Hài bằng phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm II.3.1. Sự hình thành các phương pháp gieo hạt Lan Vì hạt Lan Hài quá nhỏ, không chứa dữ liệu và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một phương cách bình thường được. Vì vậy làm cho hạt nẩy mầm và phát triển thành cây Lan trưởng thành là vấn đề khó khăn trong giai đoạn đầu của thời kỳ phát triển nghành Lan. Người trồngLan đã tìm nhiều cách để gieo hạt nhưng không thành công. Đến năm 1884, Neumann, người làm vườn Pháp, đã làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách rải đại chúng trên các cục đất ở quanh các gốc lan lớn. Sự thành công ấy được đồn xa lan rộng nhưng không ai biết được lý do mà các cấy nảy mầm. Dminy là người đầu tiên đã tạo được các hạt lan lai và làm nảy mầm các hạt lan ấy trước năm 1853. Nhiều lúc ông chi tạo được vài cây, mọi trường hợp khác đều bị thất bại. Vào năm 1899, Noel Bernard nhà thực vật học người Pháp, đã khám phá ra bí mật của sự nảy mầm ở hạt Lan khi khảo sát hạt Neottia nidus-avis nảy mầm tự nhiên trong từng vùng Fontainebleau ở nước Pháp. Ông thấy các cây Lan ấy đều nhiễm nấm. Sự thật thì sự liên kết giữa nấm và cây Lan con đã được khảo sát từ năm 1850, sự liên kết giữa nấm và rễ Lan đã được các nhà khoa học nghiên cứu suốt hơn nửa thế kỷ tiếp theo đó. Điều này cắt nghĩa lý do thành công của Neumann: hạt nảy mầm nhờ nấm có sẵn quanh gốc Lan lớn. Người ta đã khám ra ba loại nấm giúp nảy mầm ở hạt Lan: Rhizoctonia repens, Rhizoctonia mucorides, Rhizoctonia lanugiosa. Mỗi loài chỉ giúp nảy mầm một giống lan nhất định. Kể đến, khoảng 1922, Knudson ở Mỹ, lại thành công trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Knudson nhận thấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì khả năng nảy mầm của hạt Lan là rất ít hay không có. Nhưng nếu có nấm thì sự nảy mầm của hạt lan xảy ra rất sớm. Ông nhận thấy chỉ có một sự khác biệt giữa cây lan và hạt lan là sử dụng CO2 trong không khí: từ CO2 và nước, cây lan tạo ra hyratecacbon (gồm đường và tinh bột) theo phản ứng: nCO2 + 2nH2Oà(CH2O)n + nCO2 + nH2O Từ hyratecacbon (CH2O)n ấy và muối khoáng do rễ mang lại, cây lan đã tạo ra được các hợp chất phức tạp cần thiết cho sự phát triển của nó. Knudson nghĩ rằng hạt lan không mọc được bởi lý do đơn giản là do thiếu khả năng tạo cacbon hydrate từ CO2. Khi thí nghiệm để kiểm tra ý nghĩ ấy thì ông thành công ngay. Ông thấy rằng chỉ cần thêm 2% đường vào môi trường gieo hạt chỉ cần thạch và muối khoáng, không cần có nấm hạt Lan vẫn nảy mầm tốt. Như vậy vai trò chính yếu của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp chất dinh dưỡng. Từ đó, phương pháp gieo hạt trong ống nghiệm đã hình thành. II.3.2. Thành phần môi trường: § Các chất vô cơ cần thiết cho sự phát triển của cây như: C, H,O,N, P, K ,S, Ca, Mg. Các nguyên tố cần thiết ít hơn: Fe, Cl, Mn, Zn, B, Mo. § Đường thường dùng là saccaroze, khoảng 2 – 4%, kế đến là glucoze, maltoz, fructoz, galatoz, mantoz, lactoz. § Các sinh tố (Vitamin) gồm có: Sinh tố B như B1 = Thiamin HCl ( 0.1 – 10 mg/l) B2 = Riboflavin (0.1 – 1 mg/l) B3 = Acid pantothenic (0.1 mg/l) B5 = PP, acic nicotinic (0.5 mg/l) B6 = Pyridoxin HCl (0.5 mg/l) Sinh tố H như Biotin (0.001 – 0.1 mg/l) Sinh tố C như Acid ascorbic (0.001 – 0.01 mg/l) Myo – inositol (100-1000 mg/l) § Chất điều hòa tăng trưởng gồm 2 nhóm auxin và cytokinin NAA: acid naphtyl (0.1 – 10mg/l) 2,4D: acid 2,4 diclorrophenoxyacetic (0.05 – 0.5mg/l) AIA: acid indolin acetic (0.1 – 10mg/l) Kinetin: 6 furfuryl aminopurin (0.01 – 10mg/l) BA (BAP): benzyl aminopurin (0.01 – 10mg/l) § Các chất chưa được xác định thành phần: nước dừa, nước cà chua… II.3.3. Kỹ thuật gieo hạt Khử trùng phòng gieo hạt hay tủ cấy Tẩy trùng trái Lan Trong mọi trường hợp, sau khi hái trái lan phải được rửa sạch và tẩy trùng mặt ngoài bằng cách: Rửa dưới vòi nước chảy Dùng gòn rửa trái trong nước xà phòng loãng hay nước có pha thêm vài giọt Tween hay Teepol. Rửa lại dưới vòi nước. Ngâm vào cồn 750 trong vòng 3 phút nếu trái còn xanh cứng,. trái chín già thì không cần ngâm vào cồn vì cồn sẽ làm trái khô nức ra ngay. Ngâm trái trong dung dịch tẩy như hypochlorit calci 10% hay hypochlorit natri 5% trong 20 phút hoặc clorua thủy ngân 0.1% trong 5 – 10 phút. Rửa bằng nước cất vô trùng (3 lần) Chuyển vào phòng cấy ngay Khử trùng hạt lan: Trong trường hợp khử trùng trái non hoặc trái già nhưng chưa bung hạt ra thì không cần khử trùng hạt lan.ngược lại trong trường hợp trái lan đã bị nứt ra dù nhiều hay ít đều phải tẩy trùng hạt Lan. Kết hợp với việc này, người ta cũng loại bỏ hạt lep đi bằng cách: Cho hạt lan vào ống nghiệm sạch Cho nước cất vào khoảng ¾ chiều cao của ống nghiệm Bịt miệng ống nghiệm bằng nắp vô trùng, rồi lắc cho các hạt rời ra. Đem ly tâm: các hạt tốt sẽ ở đáy ống nghiệm, các hạt lép sẽ nổi lên trên mặt ống nghiệm. Đổ nước trong ống nghiệm ra để tách hai thứ ấy. Vì vậy ta chỉ cần tẩy trùng mặt ngoài của hạt lan bằng dung hypochloorit calium Ca(ClO)2.4H2O, hay bằng peroxide hydrogen (H2O2). Việc khử trùng hạt lan rất đơn giản, chỉ cần rót dung dịch tẩy pha chế khi nãy vào ống nghiệm khoảng ¾ của ống. các hạt Lan sẽ đổi màu. Lắc nhẹ trong 3 phút để các hạt lan được rời ra và được tẩy sạch. Nếu hạt nặng thì sẽ chìm dưới đáy ống nghiệm, chỉ cần đổ nhẹ phần nước bên trên. Nếu hạt nhẹ thì chúng nổi trên mặt, bây giờ phải dùng ngón tay cái để bịt miệng ống nghiệm , lộn ngược lại cho chất tẩy theo ra theo hướng ngón tay cái. Hạt lan nhẹ nổi ở trên sẽ được giữ lại ở thành ống nghiệm. Gieo hạt vào chai cấy: Trong trường hợp trái non hay già chưa nứt ra thì sau khi khử trùng mặt ngoài tủ cấy như đã trình bày, trước khi cắt trái trong tủ cấy vô trùng nên khử trùng mặt ngoài trái một lần nữa bằng cách dùng kẹp nhúng trái vào cồn và đốt nhanh qua ngọn lửa. khi lửa tắt, bắt đầu mổ xẻ trái lan bằng dao mổ đã hơ qua ngọn lửa để khữ trùng, cắt một đầu của trái lan, trái sẻ bung ra dễ dàng. Cho hạt lan vào các ống nghiệm hay chai cấy đã có môi trường cấy vô trùng thích hợp mà không cần tẩy trùng hạt lan. Trong trường hợp trái đã nứt ra thì sau khi khử trùng mặt ngoài của hạt, chuyển vào tủ cấy để gieo. Hơ miệng hút (dropper) hoặc que cấy đã vô trùng đưa hạt lan đã khử trùng trong ống nghiệm cho vào chai cấy có sẵn môi trường thích hợp. Cũng có thể đổ thẳng ống nghiệm chứa hạt lan đã khử trùng vào chai cấy. Xúc lấy một số hạt lan vừa đủ để cấy sang chai cấy. Que cấy có mặt lan đưa trên mặt thạch của chay cấy để nằm ngang sao cho hạt lan rơi đều trên mặt thạch. Hạt sẽ bám vào mặt thạch và rãi đều ra. Trong trường hợp dùng ống hút hay ống đổ thẳng ống nghiệm có chứa hạt lan vào chai cấy thì sau đó phải nghiêng các chai cấy qua lại cho các hạt lan được trãi đều trên bề mặt của thạch. Đậy nắp chai cấy lại. Nếu dùng gòn để đậy thì phải đốt nhanh qua ngọn lửa và đậy nhanh lại thì lửa ở gòn sẽ tắt ngay. Nếu dùng nút cao su nhét gòn để đậy thì phải bôi thuốc vào nút chai trước khi đậy. Thuốc bôi nút chai, nút gòn để đề phòng vi khuẩn vào làm nhiễm chai cấy. Các thứ thuốc đó là: Acid salicylic 10g hòa với một lít cồn 40%. Clorua thủy ngân hòa với 5 lít nước cất. Lao bề ngoài chai cấy bằng que có đầu gòn nhúng hypochlorit. Bịt đầu nút còn lại bằng giấy bạc hay giấy tẩm paraffin hay giấy nylon để tránh mất nước của môi trường cấy. Ghi trên chai cấy các chi tiết: ngày lai, ngày cấy, tên… Để các chai cấy vào phòng nuôi thích hợp. Sự phát triển của hạt lan trên môi trường gieo cấy: Sự phát triển của hạt lan thông thường theo sơ đồ 1: Hạt lan tiền phôi tiền củ cây con (seed) (proembryo) (protocorm) (seeding) Do tác động của môi trường xung quanh, nhất là thành phần của môi trường gieo hạt, hạt lan có thể phát triển theo sơ đồ 2: Hạt lan tiền phôi tiền củ Cây con Mô sẹo Đỉnh ngọn Sinh mô bì Khối tế bào Rễ Mô sẹo Tế bào dạng nhu mô DƯỚI MỨC NÀY SẼ BỊ BIẾN DỊ VÀ HỦY DIỆT Đơn bào dạng rễ Hóa sợi cứng Như vậy hạt lan có thể ra tiền củ ( protocorm )hay mô sẹo (callus). Lấy mô sẹo hay tiền củ này đem nhân lên dưới hình thức nhân mô thì sẽ làm gia tăng số lượng cây con, từ chỉ một hạt. Nhưng cách này không nên thực hiện vì đặc tính của hạt ấy sẽ cho cây hoa như thế nào ta chưa biết rõ. Chăm sóc chai cấy: Sau khi gieo hạt xong, đem để các chai cấy nơi mát mẻ, thoáng gió, không có ánh sáng. Khoảng một tháng sau tiếp xúc dần dần với ánh sáng. Ánh sáng thường được ưa chuộng là ánh sáng ban ngày nhưng không nên để nắng rọi trực tiếp vào. Trong trường hợp cần thì phải thắp sáng bằng đèn neon, đặt cách chai cấy khoảng 40cm. Cần có 8 giờ tối mỗi đêm. Nhiệt độ nơi để chai cấy không nên quá biến đổi, thường 22 – 270C. Thường từ 2 – 3 tuần sau khi gieo, hạt bắt đầu nảy mầm. chúng phù lên có màu vàng hay trắng rồi dần dần chuyển thành xanh khi cho tiếp xúc với ánh sáng vì đã tạo được diệp lục tố (khoảng 6 tuần sau). 1 – 2 tháng nữa, trên hạt xuất hiện lá mầm, lúc bấy giờ cây sẽ quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho sự tăng trưởng và phát triển của nó. Các rễ sẽ xuất hiện dưới dạng lông tơ trắng. Tiếp tục phát triển lá và rễ dài ra để hoàn thiện thành một cây con. Tốc độ tăng trưởng nhanh hay chậm là tùy thuộc vào loài lan và môi trường nuôi cấy có hợp không. Cấy chuyền Khi đã nảy mầm, hạt biến đổi thành một đám tế bào mà tạm gọi là tiền củ (protocorm ) rồi tạo ra lá đầu tiên, bấy giờ chúng cần được cấy chuyền sang nhiều chai khác để có đủ thể tích mà phát triển. Cần phải cấy chuyền vì môi trường mà chúng sống có thể bị thay đổi do quá trình phát triển, có thể thành lập các chất ức chế sự tăng trưởng và phân chia tế bào. Môi trường sống cũng bị khác đi vì mất nước và cạn dần các chất dinh dưỡng. Việc cấy chuyền cũng được thực hiện trong điều kiện vô trùng và lập lại tiến trình như lúc khởi đầu gieo hạt. II. 4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình vi nhân giống: II.4.1.Ảnh hưởng của mẫu cấy Kiểu di truyền Chúng là cây một lá mầm nên khi nảy mầm ngoài tự nhiên rất khó. Nhưng nó có khả năng tái sinh tốt trong điều kiện vi nhân giống. Tuối và giai đoạn phát triển của lan Trong tất cả các trường hợp vi nhân giống thì các mô phôi có khả năng tái sinh nhanh hơn các mô khác, vì nó có chứa chất dinh dưỡng dự trữ Vị trí thu mẫu trên cây Mẫu cấy phải được rửa kỹ bằng chất tẩy trùng. Những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phần khác nhau của cây như rễ, chồi , cuống lá đều có hiệu quả trong vi nhân giống như nhau. Chỉ khác một điều những mẫu cấy từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong vi nhân giống tốt hơn, những mẫu chồi gốc thì tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Khi gieo hạt Cần gieo xong một trái lan trong cùng một lúc, gieo làm sao đừng để các hạt lan chụm lại quá dày vì cây con mọc chen chúc nhau sẽ làm cây yếu. Trường hợp các hạt lan đã lắc trong ống nghiệm rồi mà vẫn không rời nhau ra thì ta có thể cho vào một giọt Aerosol thì chúng sẽ rời nhau ngay. Phương pháp cấy Cấy có cực là cấy thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường, cấy không có cực là cắm phần ngọn xuống môi trường. thường thì cấy không cực cho kết quả cao hơn. II.4.2.Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Môi trường để nuôi cấy vi nhân giống lan hài phải tuyệt đối vô trùng, và chứa đầy đủ chất dinh dưỡng trong quá trình phát triển của hạt vì hạt của lan rất nhỏ nên không chứa nhiều chất dự trữ. Khoáng đa lượng Thường là bao gồm các yếu tố như: N, P, K, S, C, Ca, O, Mg Khoáng vi lượng Thông thường là : Mn, Zn, Fe, Cu, B, Co, I, Mo… Carbon và nguồn năng lượng Nguồn carbon được bổ sung chủ yếu dưới 2 dạng đường là glucose và sucrose. Nó có thể ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng trong vi nhân giống Vitamin Thiamine (B1), acid nicotinic (B5=PP) , pyridoxine (B6) và myo-inositol Các chất điều hoà tăng trưởng thực vật Auxin là một chất tương đối đơn giản là indol-3-acetic acid (IAA). Ngoài ra còn các chất có cấu trúc giống IAA và cùng vai trò với IAA trong cơ quan đều được gọi là auxin như : IBA, NAA, 2,4-D…. Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô. Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khơi rễ, nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng cảu các sơ khởi này. Trong sự tạo rễ, auxin phải phối hợp với các vitamine, amino acid… Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin, nó tác động lên cả 2 bước của sự phân chia tế bào là phân nhân và phân bào. Tỷ lệ auxin / cytokinin ( A/C) là một yếu tố rất quan trọng: A/C cao giúp sự tạo rễ, A/C thấp giúp tạo chồi. Nước và thạch: thời gian nuôi cấy trong chai sẽ làm cho môi trường và cây thiếu nước. nếu quá khô hạn thì cây sẽ ngừng tăng trưởng khô dần rồi chết. Do đó, môi trường nuôi cấy không nên quá đặc để cho nước và các chất có thể di chuyển đến mẫu nuôi cấy. Nước pha chế môi trường phải là nước cất vô trùng. Thạch (agar) thường dùng với nồng độ 0.7-1.5% (khoảng 7-1,5g/l môi trường). II.4.3.Các yếu tố bên ngoài: Nhiệt độ: tốt nhất là 25,5± 4,50C Ánh sáng : Vai trò của ánh sáng rất quan trọng vì ánh sáng tác động vào tất cả các chức năng của cây như quang hợp, hô hấp, thoát hơi nước... sự biến đổi dưỡng chất dưới ánh sáng trắng và đỏ. Sự thoáng khí : hạt khi nảy mầm hô hấp mạnh nên cần nhiều oxi. Do đó, sự tương quan tùy thuộc vào sự tăng hay giảm oxy trong môi trường. Độ pH tốt nhất là 5-6 , dùng HCl, H3PO4, NAOH, NH4OH để điều chỉnh độ pH của môi trường. II.5 Giá trị của Lan Hài : II.5.1 Giá trị kinh tế : Hiện nay nhu cầu hoa tươi nói chung và hoa lan nói riêng trên thế giới và trong nước đang ngày càng gia tăng. Tỷ lệ hàng năm của ngành sản xuất hoa tươi trên thế giới là 10%, đạt khoảng 40 tỷ USD. Trong năm 2000, kim ngạch xuất khẩu hoa lan cắt cành và giống cây lan trên thế giới đat triệu USD, trong đó lan cắt cành đạt 128 triệu USD. Vì vậy việc trồng lan đã trở thành một ngành kinh tế của nhiều nước trên thế giới và đang phát triển mạnh mẽ ở khu vực Đông Nam Á. Năm 2005, thành phố Hồ Chí Minh khẳng định phong lan ( lan cắt cành như Dendrobium, Mokara, Oncicidium…) sẽ trở thành cây giống chủ lực của thành phố trong vòng 5 năm tới. Hiện nay thành phố Hồ Chí Minh đã có 50 ha trồng hoa lan , trừ các quận huyện còn khó về vấn đề nước ngọt để tưới, các địa phương còn lại đều thuận lợi để phát triển hoa lan. Lan cắt cành thuộc nhóm Dendrobium, Mokara hiện nay được trồng nhiều nhất do lợi nhuận từ hai loài náy khá cao. Người trồng có thể thu nhập trên 1 tỷ đồng/ha. Chương trình phát triển hoa 2004 – 2010 đã được Sở Nông Nghiệp – Phát triển nông thôn thành phố Hồ Chí Minh phấn đấu đạt kim ngạch xuất khẩu hoa kiểng là 10 triệu USD vào năm 2005 và 15 triệu USD vào năm 2010. Lan Hài Việt Nam: Lan hài là chủng họ lan có giá trị thương mại cao nhất, được yêu chuộng, sưu tầm, và săn lùng nhiều nhất trên thế giới. Việt Nam là một trung tâm sản xuất lan hài lớn của thế giới với trên 20 loài thuộc chi Paphiopedilum. Nói đến lan hài Việt Nam, trước tiên phải kể đến lan hài đỏ; kế đến là các loại lan hài vàng, lan hài tía; lan hài trắng; lan hài vân; lan hài vân duyên; lan hài đốm lan hài lông; lan hài râu... Pa