Đề tài Xác định Aflatoxin trong nông sản thực phẩm

Davis(1980) cũng sử dụng pha phản để xác định huỳnh quang của đồng phân iot của Aflatoxin B1. Kết quả dẫn đén việc phát triển phương pháp đồng phân cột . 2.4. Phương pháp sắc kí cột. Phương pháp cột mini nhằm xác định nhanh aflatoxin có trong mẫu. Phương pháp này đơn giản, ít tốn kém, chỉ xác định định tính. Kĩ thuật nhồi cột mini là cột sắc kí bằng thủy tinh hay chất dẻo có kích thước khoảng 3-6mm chiều rộng và 20cm chiều dài. Dung dịch chiết tách được làm sạch bằng dung môi, dung môi và hòa tan trong một lượng nhỏ benzen hay chloroform. Cột được nhồi silicagel như một chất hấp thụ và quan sát dưới ánh sáng tử ngoại(uv) để xác định màu huỳnh quang xanh chỉ ra sự có mặt của aflatoxin. Nhiều tác giả như Davis và cộng sự(1981), Holaday(1976), Holaday và Lansden(1975) đã cải tiến phương pháp này nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu. Phương pháp cột mini của Romes(1975) đã được A.O.A.C (1980) công nhận. Aflatoxin được tách bằng aceton và nước (85: 45), các chất tạp được loại trên gel cacbonat đồng và chloric sắt. Sau đó, aflatoxin được tách ra băng một pha nước với chloroform. Chloroform tách được đưa vào cột có chứa một lớp bột nhôm trung tính, silicagel và florisil ở phía dưới, sunfat canxi khô ở cả trên và dưới. Cột được chạy trong choloroform và aceton(9:1) để giữ aflatoxin trên đỉnh của lớp flosisil. Chương III: Đối tượng và phướng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu: Thiết bị sắc kí bản mỏng và và sắc kí cột. Mẫu phân tích từ nông sản thực phẩm thủy sản. 3.2 Phương pháp nghiên cứu: Tham khảo tài liệu. Chương 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU I.Phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký: 1.1Nguyên tắc: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được gắn vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết dẫn mẩu đi qua các cột, Aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đã qua cột, rửa cột trong điều kiện nhẹ nhàng bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần không đặc hiệu bám lại. Sau đó Aflatoxinsex được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng Aflatoxin bằng sắc ký bản mỏng. 1.2 Tiến hành: 1.2.1 Chuẩn bị mẫu: ¨Xay 1kg mẫu đủ lọc sàng 1mm. Trộn đều, cân 25g mẫu, 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu Methanol 75% cho vào bình định mức. Lắc đều trong 30 phút. ¨Để lắng trong vòng 10- 15 phút . ¨Lọc dịch chiết qua giấy lọc . ¨Lấy 15 ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại lần nữa, lấy 15 ml dịch lọc (tương đương 1g mẫu). 1.2.2Phân tích mẫu: Qua cột sắc ký ái lực miễn dịch : Gắn xiranh 20-30ml lên giá đỡ. Mở nắp cột sắc ký ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống (để tránh tạo bọt khí trong cột ) và gắn vào xiranh . Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột . Khi lớp nước vừa tới đầu cột cho 15 ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xiranh (tránh có bọt khí trong cột). Cho dịch lỏng chảy qua cột với tốt độ khoảng 1 giọt/giây. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy. Khi dịch mẫu tới đầu cột ,cho 10ml nước cất vào xiranh để rửa cột. Lặp lại một lần nữa với 10ml nước cất. Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột ra khỏi xiranh, lau nước bám ở đầu cột và xiranh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước . Cho 1ml methanol (LC grade) rửa giải qua cột, hứng lấy dịc chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xiranh thổi 2-3ml không khí đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . 1.2.3. Định lượng bằng sắcký bản mỏng(TLC) Làm khô dịch giải hấp thu trong N2 ở 40-45oc.Hoà tan cặn lại trong 200ml Benzen-Acetonitrit (98:2). Trên tấm bản silicagelkẻ một đường cách đáy 1,5cm, trên đó chấm nhẹ bằng bút chì cách nhau 1cm trở lên. Chuẩn bị Aflatoxin B1 0,5ppm pha trong Benzen –Acetonitril(98:2) Dùng Microsyringe chấm lên bản silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau : + 3 chấm mẫu: 2, 5, 10ml + 1 nội chuẩn: 10ml mẫu và 10ml chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) + 3 chấm chuẩn: 10, 5, 2ml chuẩn (0,5ppm Aflatoxin B1) Lưu ý: Chấm trong tủ hút để dung môi bay hơi nhanh, chấm từ từ để các chấm thật nhỏ, kích thước chỉ khoảng 1mm/chấm . Pha dung dịch triển khai: Chloroform- Aceton (9:10. Cho khoảng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình, đậy kín .Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên của bản khoảng 0,5cm . Lấy bản ra, làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV. Các chấm Aflatoxin B1 sẽ phát sáng . So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm Alatoxin B1 thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu. So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và chấm mẫu, chọn một thể tích là Xml mẫu có độ phát sáng bằng S ml chuẩn. Tính toán nồng độ Alatoxin B1 có trong mẫu . 1.3 Kết quả và tính toán : Nồng độ Afatoxin B1 có trong mẫu : S.Y.V X.W Trong đó S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng Xm l mẫu () Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5mg/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200 ml) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S ml chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) Chú ý an toàn khi tiếp xúc với Aflatoxin : Đeo găng tay khi làm thí nghiệm . Các vết Aflatoxin phải dược lau sạch bằng nước javen 10% Dụng cụ thuỷ tinh hay nhựa đã tiếp xúc với Aflatoxin phải dược ngâm trong nước javen 10% tói thiểu là 30 phút trước khi rửa. II. PHÂN TÍCH AFLATOXIN B1 DÙNG CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÍ BẢN MỎNG. 2.1. Nguyên lý: Trên những hạt gel kháng thể đặc hiệu đối với aflatoxin được gắn đồng trị một cách bền vững nhưng không mất hoạt tính. Các gel này được đóng vào những cột nhỏ. Khi cho dịch chiết mẫu đi qua các cột aflatoxin sẽ bị kháng thể giữ lại. Sau khi toàn bộ mẫu đi qua cột, cột sẽ được rửa bằng nước cất để loại bỏ tất cả những thành phần bám một cách yếu ớt. Sau đó aflatoxin sẽ được giải hấp ra khỏi cột bằng methanol. Định lượng aflatoxin bằng sắc kí lỏng cao áp, sắc kí bản mỏng. 2.2. Chiết mẫu. *Xay 1kg mẫu đủ lọt sàng 1 mm. Cân 25g to vào bình Erlen meyer 500ml, cho 5g NaCl và 125ml dung dịch chiết mẫu(75% methanol). Lắc trong 30 phút. *Lọc dịch chiết qua giá lọc. *Lấy 15ml dịch lọc pha loãng 1/3 với nước lọc lại một lần nữa lấy 15 ml dịch lọc(tương đương 1g mẫu). 2.3.Quy trình phân tích : *Qua cột sắc kí ái lực miễn dịch. Gắn xylanh 20-30 ml lên giá đỡ. Mỡ nắp cột sắc kí ái lực miễn dịch cho đầy nước vào trong ống(để tránh bọt khí trong cột ) và gắn vào xylanh Cho 20ml PBS qua cột để rửa cột Khi lớp vừa nước tới đầu cột cho 15ml dịch chiết mẫu đã lọc vào xylanh Cho dịch lọc chảy qua cột với tốc độ khoảng 1 giọt/s. Dùng bơm tay để điều chỉnh tốc độ dòng chảy Khi dịch mẫu tới đầu cột, cho 10ml nước cất vào xylanh để rửa cột . Lặp lại một lần nữa với 10 ml nước cất. Khi toàn bộ nước rửa đã ra khỏi cột, bơm 2-3ml không khí qua cột để cột ráo nước. Tháo cột khỏi xylanh lau nước bám ở đầu cột và xylanh. Gõ nhẹ cột lên khăn giấy để hoàn toàn ráo nước. Cho 1ml methanol rữa giải qua cột hứng lấy dịch chảy ra. Để methanol chảy từ từ qua cột, cuối cùng dùng xylanh thổi 2-3 ml không khí để đẩy hết những giọt cuối cùng ra khỏi cột . *Phân tích nồng độ aflatoxin: +Bán định lượng bằng florifil tip: Cho dung dịch giải hấp qua cột florifil. Quan sát nó dưới đèn UV 365nm. So sánh độ phát huỳnh quang của mẫu với những tip aflatoxin chuẩn 10-20-50 ppb để ước lượng nồng độ aflatoxin trong mẫu. + Định lượng bằng sắc kí lỏng cao áp: Pha loãng ½ dịch giải hấp thu được với nước (cho thêm 1 ml nước HPLC vào, lắc đều) Tiêm vào máy HPLC Thời gian chạy 20s. Tốc độ dòng 1ml/s. Thể tích tiêm 20microlit. Cột Supelcosil LC –18,150x4.6 mmID,5 micromet Particle size. Detector fluorescent Excitation:360nm Emission :440nm Dựng đường chuẩn và tính toán nồng độ aflatoxin dựa trên đường chuẩn. + Định lượng bằng sắc kí bản mỏng : -Làm khô dịch giãi hấp thu được trong N2 ở 40-45oC. Hòa cặn lại trong 20ml Benzen-acetonitril(98/2) -Trên tấm bản silicagel kẻ một đường cách cạnh đáy 1.5cm, trên đó chấm nhẹ kèm bút chì cách nhau 1cm trở lên. -Chuẩn bị aflatoxin B1 0.5ppm pha trong benzen- acetonitril -Dùng micro siringe chấm trên bảng silicagel từ trái sang phải theo thứ tự sau: ·3 chấm mẫu: 2, 5, 10 ml ·1 nội chuẩn 10ml mẫu và ml ·3 chấm chuẩn: 10, 5, 2 ml chuẩn. -Pha dịch triển khai: chloroform-aceton(9:1). Cho khoãng 20ml dịch triển khai vào bình triển khai. Cho bản silicagel vào bình đậy kín. Chờ cho dung dịch triển khai lên đến cách mép trên bản khoảng 0.5cm. -Lấy bản ra làm khô tại nhiệt độ phòng. Soi trên đèn UV, aflatoxin B1 sẽ phát sáng . - So sánh các chấm chuẩn với các chấm mẫu. Để khẳng định mẫu có nhiễm aflatoxin thì Rf của các chấm chuẩn phải bằng Rf của các chấm mẫu . - So sánh độ sáng của các chấm chuẩn và mẫu, chọn một thể tích là x mẫu có độ phát sáng bằng S chuẩn. -Tính toán nồng độ aflatoxin có trong mẫu như sau: S.Y.V X.W Trong đó : S : thể tích của Aflatoxin chuẩn có độ sáng bằng Xm l mẫu Y : nồng độ Aflatoxin B1 chuẩn (0,5m g/ml hoặc 0,5ppm) V : thể tích hoà cặn (200m l) X : Thể tích của mẫu có độ sáng bằng S ml chuẩn W : số gam mẫu đi qua cột (1g) III.Kỹ thuật định tính và bán định lượng độc tố vi nấm mốc 3.1 Nguyên lý của phương pháp: Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang. 3.2. Đối tượng áp dụng của phương pháp: Dùng để xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063¸ 0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105 o C trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín. Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng): Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 m g/ml). Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 m g/ml đối với B1, G1, và 0,1 m g/ ml đối với B2, G2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A mg/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết quả theo công thức: C ( m g/ml) = 1000.m.A / e Trong đó: m – Khối lượng phân tử aflatoxin A – Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ. e - Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin Aflatoxin m Dung môi benzen – axetonitril (v/v) l max (nm) e B1 312 98: 2 350 19800 B2 314 98: 2 350 20900 G1 328 98: 2 350 17100 G2 330 98: 2 350 18200 Bảo quản: Bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 00C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần trước khi dùng hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. 3.3. Phương pháp tiến hành: (Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng ) 3.3.1. Chuẩn bị mẫu: Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm. Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ête dầu hoả (độ sôi 40 – 600C ) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu.3.3.2. Tiến hành thí nghiệm: 3.3.2.1. Chiết xuất: Cân 50g mẫu đã nghìên nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phểu Bucher có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không. 3.3.2.2. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: Kỹ thuật nhồi cột sắc ký: Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (3 - 15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên (5 - 2) với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút. Dung dịch rửa giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 50oC cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 500C, tốt nhất dưới luồn khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng. 3.3.2.3. Sắc ký lớp mỏng một chiều: Chuẩn bị: Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký. Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau: 1. Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B ( 3.17. 2). 2. Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B (3 .17.2). 3. Lấy 10, 20 m l dịch chiết. - Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau. Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn. Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - axêtôn (9-1) có trị số trung bình như sau: Aflatoxin B 1 : 0,72 Aflatoxin B 2 : 0,67 Aflatoxin G 1 : 0,59 Aflatoxin G 2 : 0,54 3.3.2.4. Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin: -Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm. -Rót dung dịch iốt 5 – 10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin. -Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thửvà dung dịch aflatoxin chuẩn như sau: Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Phần 2: Bên phải,chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (3.17.2) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axít trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển. Dung môi khai triển: Nước/metanol/ete etylic – 1/3/96 (v/v). Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm. 3.3.3. Đánh giá kết quả: - Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh . - Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có)sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang xanh chuyển sang màu vàng. 3.3.4. Định lượng 3.3.4.1. Bằng mắt: Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20 m l dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại. Tính kết quả Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức: C = S xY x V / W x X Trong đó: S – Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn m g / ml ( Dung dịch B ) V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, m l. W – Khối lượng của mẫu thử, ( tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột) g. X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn chấm trên bản mỏng, m l. Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết chấm trên bản mỏng, m l. 3.3.4.2. Bằng máy đo mật độ huỳnh quang. Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Tính kết quả. Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau: C = A m x S x V x Y / A s x W x X Trong đó: A m - mật độ huỳnh quang của vết mẫu. A s - mật độ huỳnh quang của vết chuẩn. X – Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng ( m l ). Y – Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng ( m l ). S – Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn,( ng). V– Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ( m l). W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột,( g). 3.3.5 - Độ nhạy của phương pháp : 5 m g / kg (5 ppm) - Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 ± 5%. - Sai số trung bình của phương pháp : ± 10%. IV.HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỦY SẢN-PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO  4.1Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 mg/kg. 4.2. Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1997. 4.3 Nguyên tắc Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 4.4. Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l). Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ : B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp. Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10 ml rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau: a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0 mg/l), G2 (0,0 mg/l). b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0 mg/l), G2 (0,2 mg/l). c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0 mg/l), G2 (0,4 mg/l). d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0 mg/l), G2 (0,8 mg/l). đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0 mg/l), G2 (1,6 mg/l). e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l), G2 (2,0 mg/l). Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6. 4.5 Phương pháp tiến hành 4.5.1 Chuẩn bị mẫu thử Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml. Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể . Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5 000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml . 4.5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử 4.5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể. Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử. Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng. 4.5.4 Làm sạch dịch chiết 4.5.4.1Chuẩn bị cột Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon . Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan , 20,0g silicagel đã hoạt hóa , 15 g sulfat natri khan . Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm. 4.5.4.2 Làm sạch dịch chiết Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC. Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm sạch đã chuẩn bị và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel. Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic . Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml. Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không ở nhiệt độ 40o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động trong bình định mức 5 ml . Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo phân tích trên HPLC. Tiến hành làm sạch mẫu trắng và mẫu để xác định độ thu hồi giống như với mẫu thử. 4.5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 4.5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 mm. b. Nhiệt độ cột : 35oC. c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (4.3.5. d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm. e. Thể tích tiêm : 20 ml. 4.5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). 4.5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 4.5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm: Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu t