Đề tài Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA THỦY SẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH VI KHUẨN TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thế Vương Lớp : Thủy sản 39A Địa điểm thực tập : Phòng thí nghiệm Khoa thủy sản Trường Đại học nông lâm Huế Giáo viên hướng dẫn : Nguyễn Anh Tuấn Năm 2009 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân, em được sự giúp đỡ của rất nhiều thầy cô giáo. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Nông lâm Huế, Ban chủ nhiệm Khoa Thủy sản, bộ môn Ngư Y, Phòng thí nghiệm Khoa thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành chương trình thực tập. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Thầy giáo Nguyễn Anh Tuấn, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy trong suốt quá trình thực tập cuối khóa và hoàn thành bài khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả thấy cô giáo Khoa Thủy sản. Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh được những sai xót. Rất mong được sự quan tâm, góp ý của thầy cô để khóa luận hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày 25 tháng 5 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thế Vương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC HÌNH PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 2.1. Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam và Thừa Thiên Huế 3 2.1.1. Tại Việt Nam 3 2.1.2. Tại Thừa Thiên Huế 5 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam 6 2.2.1. Trên thế giới 6 2.2.2. Tại Việt Nam 8 2.3. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 10 2.3.1. Trên thế giới 10 2.3.2. Tại Việt Nam 12 2.4. Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 14 PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16 3.2. Đối tượng nghiên cứu 16 3.2.1. Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei 16 3.2.2. Các loại thảo dược 17 3.3. Nội dung nghiên cứu 19 3.4. Dụng cụ - Hoá chất - Môi trường 19 3.4.1. Dụng cụ thí nghiệm 19 3.4.2. Môi trường , hoá chất 19 3.5. Phương pháp nghiên cứu 21 3.5.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21 3.5.2. Phương pháp thu mẫu 21 3.5.3. Phương pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn 22 3.5.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn 26 3.5.5. Phương pháp chiết xuất thảo dược 27 3.5.6. Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược 27 3.6. Phương pháp xử lý số liệu 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Trọng lượng, chiều dài tôm thẻ chân trắng bị bệnh 28 4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh. 28 4.2.1 Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý 28 4.2.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn 29 4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược 31 4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 32 4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 34 4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 37 4.3.4. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 38 4.4. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 40 4.5. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữ các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 41 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1. Kết luận 44 5.2. Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ Bảng 4.1. Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh 28 Bảng 4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng 39 Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus 37 Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey 37 Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus 38 Bảng 4.6. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey 39 Bảng 4.7. So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 40 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 26 Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với Vibrio alginolyticus 32 Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi ở đối với Vibrio harveyi 32 Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) đối với Vibrio alginolyticus 35 Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng ( tỷ lệ 1:1) đối với Vibrio harvey 35 Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus 41 Đồ thị 4.6. So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược đối với Vibrio harvey 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Tôm thẻ chân trắng 16 Hình 3.2. Tỏi 17 Hình 3.3. Lá húng 17 Hình 3.4. Cây rau má 18 Hình 3.5. Cây diếp cá 18 Hình 3.6. Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh 21 Hình 3.7. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược 27 Hình 4.1. Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh 28 Hình 4.2. Vibrio alginolyticus 30 Hình 4.3. Vibrio harveyi 30 Hình 4. 4. Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên môi trường TCBS 31 Hình 4. 5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio harveyi trên môi trường TCBS 31 Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus 33 Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi 33 Hình 4.8. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi thử nghiệm trên V.alginolyticus 36 Hình 4.9. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của các thảo dược 43 PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành Nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng phát triển, trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia, không chỉ mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước mà còn góp phần đáng kể vào sự thành công trong công tác xóa đói giảm nghèo, bảo đảm an ninh lương thực, làm thay đổi đời sống dân cư các vùng miền núi và ven biển. [4] Tuy nhiên, trong những năm gần đây, dịch bệnh và ô nhiễm môi trường đang trở thành những thách thức lớn đối với ngành Nuôi trồng thủy sản. Thiệt hại do dịch bệnh gây ra trên tôm sú tăng từ 0,5 tỉ USD năm 1995 - 1997 lên đến 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2001 – 2002. Trong số những tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỷ lệ khá lớn. Điều này đã cản trở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản cũng như nuôi thương phẩm. [7], [19] Một khi nuôi trồng thủy sản đã phát triển ở mức công nghiệp, thì kỹ thuật quản lý môi trường và dịch bệnh đã trở thành các bí quyết quan trọng để đảm bảo sự thành công của một vụ nuôi. Thông thường, để hạn chế dịch bệnh do vi khuẩn người nuôi thường sử dụng kháng sinh, các loại hóa chất đặc trị. Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng quy cách, không đúng liều lượng đã gây lên tác hại lớn như là tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc, làm suy thoái môi trường, ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người [10], [14], [15]. Hơn nữa hiện nay theo các quy định về an toàn thực phẩm, nghiêm cấm sự tồn dư các loại hóa chất, kháng sinh có trong động vật thủy sản. Chính vì thế chúng ta cần có biện pháp tốt để vượt qua những rào cản này. [7] Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong chữa trị bệnh trên động vật thủy sản được xem như một giải pháp có biên độ an toàn cao trong bảo quản, điều trị bệnh nấm và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản [9] Từ đó, đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” nhằm mục đích: Phân lập và định danh một vài chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Thử nghiệm một số thảo dược có khả năng phòng trừ bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng. PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam và Thừa Thiên Huế 2.1.1. Tại Việt Nam Năm 1990, Việt Nam có hơn 187.000 ha mặt nước nuôi tôm với sản lượng đạt được khoảng 31.000 tấn. Năm 1995, diện tích nuôi tăng lên 260.000 ha, sản lượng đạt được 52.000 tấn. Nhưng mặt trái của sự phát triển nhanh chóng, không quy hoạch đã dẫn đến dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi. Năm 1994, dịch bệnh bùng phát tại Đồng bằng sông Cửu Long: Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Long An, Nha Trang … gây thiệt hại hàng chục tỷ đồng cho bà con nuôi tôm. [7] Năm 1996, tại các tỉnh miền Nam (từ Phú Yên đến Cà Mau) dịch bệnh đã xảy ra trên 84.917 ha, trong đó nuôi quảng canh: 52.017 ha, quảng canh cải tiến: 29.011 ha, bán thâm canh: 3.829 ha. Tổng thiệt hại lên đến hàng chục tỷ đồng. Các tỉnh bị dịch bệnh nặng như Cà Mau hơn 70.000 ha, Kiên Giang hơn 4.000 ha, Bến Tre hơn 3.000 ha. [7] Năm 1997, theo ước tính của Nguyễn Việt Thắng (báo cáo nghiên cứu khoa học) tỉnh Bến Tre bị thiệt hại nặng nề nhất với 20% tôm thả bị chết, Trà Vinh với hơn 15% tôm thả bị chết. Cũng trong thời gian này dịch bệnh bùng phát nghiêm trọng ở các tỉnh Miền Trung, đặc biệt vào tháng 2-3. Tổng số diện tích bị bệnh chiếm khoảng 80% tổng diện tích nuôi trồng gây thiệt hại lớn cho các tỉnh miền Trung. [20] Báo cáo kết quả Nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành đã đưa ra vài con số: Cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích bị bệnh khoảng 30.083 ha. Riêng các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn vibrio, bệnh do ký sinh trùng, gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Tại các tỉnh Bắc Trung Bộ, theo báo cáo của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I cho thấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị nhiễm virut đốm trắng, tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Nghệ An có 47,8% diện tích nuôi tôm nhiễm virus đốm trắng; 30,4% bệnh MBV; 54,5% bệnh đầu vàng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha nhiễm bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi chết hoàn toàn. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có từ xấp xỉ trăm ha cho tới vài trăm ha nuôi tôm bị bệnh.[18] Tại các tỉnh miền Trung, Nam Trung Bộ, theo Phòng bệnh học thủy sản -Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III, Khánh Hòa có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh thấp nhất 14,3%, cao nhất ở Ninh Thuận 52,4%. Tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lại xảy ra hầu hết ở các vùng nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, Ninh Phước có những nơi lên tới 90-95% tôm bị nhiễm bệnh.[18] Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, tại các tỉnh Nam Bộ tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm ở ao nuôi quảng canh cải tiến chiếm tới 56%, 50% tôm nhiễm bệnh MBV. Bệnh virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực.[18] Năm 2007, dịch bệnh đã bùng phát trên hơn 30 ha ao nuôi tôm trên cát ở huyện Phù Mỹ (Bình Định). Tôm chết chủ yếu ở giai đoạn 30 - 40 ngày nuôi gây tổn thất hàng chục tỉ đồng. Năm 2005, vùng nuôi tôm trên cát trọng điểm tỉnh Bình Định tập trung tại hai xã Mỹ An, Mỹ Thắng (Phù Mỹ) cũng xảy ra dịch bệnh.[19] Những tháng đầu năm 2008, một số tỉnh nuôi tôm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long như: Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau bị thiệt hại nặng do tôm chết hàng loạt. Nghiêm trọng nhất tại Cà Mau có khoảng 34.000 ha tôm bị nhiễm bệnh, thiệt hại từ 10% đến 70%. Việc tăng trưởng quá nhanh chóng về diện tích nuôi tôm đã nảy sinh nhiều bất cập về ô nhiễm, kiểm soát dịch bệnh, chất lượng sản phẩm dẫn đến thiệt hại không nhỏ về kinh tế cũng như môi trường. [20] 2.1.2. Tại Thừa Thiên Huế Năm 2007, diện tích nuôi tôm của Thừa Thiên Huế khoảng 3.712,1 ha. Ở vụ nuôi này thời tiết diễn biến phức tạp, nắng nóng kéo dài xen giữa có 3 đợt gió mùa kèm theo mưa dẫn đến nhiệt độ, các yếu tố môi trường biến động quá cao rất bất lợi cho sự phát triển tôm nuôi. Qua kiểm tra cho thấy tôm bị nhiễm virus đốm trắng ở các vùng Quảng An, Quảng Phước huyện Quảng Điền. Sau đó dịch bệnh lây lan trên diện rộng ở các xã thuộc huyện Phú Lộc, Phú Vang. Theo thống kê diện tích tôm bệnh: Khoảng 1.052,98 ha chiếm tỷ lệ 36,91% tổng diện tích nuôi, tăng 31,28% so với năm 2006. Huyện Phú Lộc có diện tích nuôi tôm lớn nhất với 900 ha, cũng là huyện thiệt hại nặng nhất với 600 ha bị bệnh, chiếm tỷ lệ 66,67% tổng diện tích nuôi. Trong đó bệnh đốm trắng trên 138,83 ha chiếm tỷ lệ 11,07% tổng diện tích nuôi, các bệnh vi khuẩn khác trên 166,7 ha chiếm tỷ lệ 14,37%. Huyện Phong Điền thiệt hại thứ hai, với 22,9 ha nhiễm bệnh, chiếm 39,76%. Trong đó bệnh đốm trắng xảy ra với tỷ lệ rất cao, trên 21 ha, chiếm 38,02%. Hai huyện Phú Vang và Quảng Điền cũng bị thiệt hại nặng, với tỉ lệ xấp xỉ 26%. Bệnh đốm trắng ở Phú Vang chiếm 11,9 %, bệnh vi khuẩn khác chiếm 14,37%. Tỷ lệ này ở Quảng Điền là 25,46% và 0,12%. Huyện Hương Trà có diện tích nuôi tôm thấp nhất với 276 ha, đồng thời tỷ lệ xảy ra bệnh thấp nhất với 4,5 ha chiếm tỷ lệ 1,63%. Đặc biệt ở Hương Trà bệnh đốm trắng hầu như không xảy ra.[20] Trong báo cáo tình hình sản xuất nông nghiệp của sở Nông nghiệp, tính đến ngày 27/11/2008 toàn tỉnh có 112,1 ha nuôi tôm thẻ chân trắng đạt sản lượng 1.208,9 triệu tấn với diện tích bị bệnh 4 ha chiếm 1,28% diện tích nuôi. Diện tích nuôi tôm sú lớn hơn với 3609,2 ha đạt sản lượng 2560,35 triệu tấn, trong đó diện tích bị bệnh khoảng 166,05 ha chiếm 4,62%. Qua thống kê cho thấy tỷ lệ bị bệnh của tôm sú cao hơn tôm thẻ chân trắng. Điều này chứng tỏ tôm thẻ có sức đề kháng, thích nghi với môi trường tốt hơn tôm sú. Năm 2008, tình hình thời tiết diễn biến ít bất lợi, người nuôi đã có kế hoạch phòng bệnh nên tỷ lệ bị bệnh giảm đáng kể so với năm 2007. 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Bệnh truyền nhiễm được xem như yếu tố quan trọng nhất góp phần làm giảm sút sản lượng tôm nuôi. Việc khống chế các mầm bệnh bằng cách dùng hóa chất theo phương pháp truyền thống cho thấy ngày càng mang lại hiệu quả thấp đối với các mầm bệnh mới xuất hiện. Điều này tạo điều kiện cho công nghệ sinh học gia tăng vai trò hữu hiệu của mình trong chẩn đoán các mầm bệnh, giải thích rõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán, phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh (Subasinghe, 1998). Hiện nay bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn phát sáng, nhóm virus MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Virus), WSSV (White Spot Syndrom Virus) được xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm nhất đã làm ảnh hưởng đến sản lượng tôm nuôi hàng năm. [20] Đối với bệnh do vi khuẩn gây nên, các nghiên cứu cho thấy trong hệ thống nuôi kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăng khả năng nhiễm các bệnh do vi khuẩn. Mặt khác, nhằm hạn chế việc đưa các chất hữu cơ trong ao nuôi tôm làm ô nhiễm môi trường vùng duyên hải, việc phát triển hệ thống nuôi hoặc hoàn toàn không thay nước hoặc nuôi theo phương pháp tuần hoàn cũng rất cần thiết (Nygaard, 1992). Tuy nhiên trong hệ thống kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăng vấn đề có liên quan đến bệnh  do vi khuẩn. [20] Nhóm vi khuẩn vibrio, một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu đối với động vật thủy sản. Bệnh do vi khuẩn vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash. Đến năm 1977, Fisher đã phát hiện ra vi khuẩn vibrio gây bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ, châu Á. Kết quả này cũng được công bố bởi Roald và Bowser, 1981. Năm 1996, Lightner phát hiện các loài tôm he (Penaeus spp), tôm thẻ (Metapenaeus spp) cũng bị nhiễm vibrio. Năm 1990, Hassawai cho rằng phẩy khuẩn đã gây bệnh đỏ thân ở Thái Lan. Hầu như tất cả các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ mặn đều có thể nhiễm và chịu tác hại của bệnh vibrio.[20] Các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Vấn đề này dường như khá phổ biến ở các nước châu Á nơi mà việc nuôi tôm được xem như hoạt động chính yếu trong sinh kế của người dân. Bệnh do nhóm vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippines (Fernandez và Mayo, 1994), Ấn Độ (Raju, 1994) và Indonesia (Sulasmi, 1994; Taslihan và Wijayati, 1994). [20] Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông, vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996). Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào, thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Sae-Oui, 1987; Songsrem, 1990; Ruangpan, 1997). Chất thải từ hệ thống tiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi ngờ có chứa vi khuẩn phát sáng (Shariff và Subasinghe, 1992). [20] Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng, hậu ấu trùng, các tác gia đã phân lập được những loại khác nhau của giống vibrio. Ở Philippin, C.L.Pilogo, M.C.L Baticados, E.R.Crus và L.de Lapena đã phân lập được hai loài: Vibrio harveyi và Vibrio splendidus. Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại tìm thấy Vibrio parahaemolyticus.[22] Trước đây, nhóm vibrio được xem như nhóm vi khuẩn cơ hội (Lightner, 1988). Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn vibrio gây ra cho thấy loài này đóng vai trò gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải vi khuẩn cơ hội (Lightner, 1992). Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm, kể cả tôm trưởng thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100% (Lightner, 1983).[22] Năm 1985, lần đầu tiên phát hiện bệnh hoại tử gan ở tôm he tại vùng Taxas, sau đó dịch bệnh được tìm thấy ở Peru, Ecuador, Venezuala, Pacma, Costarica. Năm 1996, D.Lighter đã nghiên cứu tìm thấy tác nhân gây bệnh hoại tử gan ở tôm he nuôi được xác định là một giống vi khuẩn thuộc lớp Proteobacteri. Đây là một dạng vi khuẩn gram (-), đa dạng, sống ký sinh trong nội bào.[4] Các kỹ thuật chẩn đoán trước đây chủ yếu dựa vào phương pháp phân lập vi khuẩn kết hợp với các triệu chứng bệnh tích cũng như mô bệnh học. Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại ADN để chẩn đoán nhanh bệnh do vi khuẩn trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn (Dalsgaard, 1996).[19] 2.2.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh thuỷ sản được nghiên cứu chậm hơn so với các nước trên thế giới. Việc nghiên cứu bệnh thuỷ sản ở nước ta bắt đầu từ những năm của thập niên 60 và ngày càng được chú trọng. Lúc này, nghề nuôi tôm đã bắt đầu phát triển tại Việt Nam. Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷ sản bắt đầu nghiên cứu đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng do nhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình lớn đã được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, đem lại hiệu quả cao. Từ những năm 1989-1990, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng: bệnh vibrio, đặt biệt bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống, trong ao nuôi thương phẩm ở Việt Nam, có thể gặp bất kỳ một cơ sở sản xuất nào (Đỗ Thị Hòa, 1995-1997).[4], [8] Năm 1991, Nguyễn Trọng Nho cùng cộng sự khi nghiên cứu một số bệnh trên tôm sú ở Khánh Hoà đã thông báo một số dấu hiệu bệnh lý trên tôm sú nuôi. Đỗ Thị Hoà năm 1994, với đề tài nghiên cứu một số bệnh do tác nhân vi khuẩn, nấm nguyên sinh, động vật và giun tròn. Trong đó một số bệnh gây tác hại lớn được tác giả cho biết đó là: bệnh phát sáng, bệnh đỏ dọc thân trên tôm sú, bệnh mềm vỏ, bệnh do động vật đơn bào. Năm 1994, khi dịch bệnh tôm gây chết hàng loạt ở đồng bằng sông Cửu Long. Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên đã nghiên cứu đề tài “Tìm hiểu nguyên nhân tôm chết ở đồng bằng sông Cửu Long”. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Thắng cho thấy vi khuẩn hiện diện khá cao trên tổng số mẫu thu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra cho thấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân) chiếm tỷ lệ 80-100%, điều này cho thấy các mô hình nuôi quảng canh, đặc biệt mô hình nuôi tôm sú trên ruộng lúa. Bên cạnh tác nhân virus, vi khuẩn cũng là một tác nhân khá nguy hại khác cho tôm nuôi nếu đàn tôm bị nhiễm khuẩn với cường độ cao, số lượng lớn. [20] Năm 1996, Đỗ Thị Hoà cùng cộng sự đi sâu vào nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên tôm sú ở khu vực Nam Trung Bộ phát hiện vi khuẩn cảm nhiễm trên tôm, kết quả này mở ra nhiều triển vọng cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Năm 1997, Đỗ Thị Hòa nghiên cứu và phát hiện ra vi khuẩn vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới. Năm 2002, Đỗ Thị Hòa thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ: Homarus americarus, H.gammarus và tôm hùm châu Á: Panulirus hormarus, P.ornatus,...đều bị cảm nhiễm vibrio.[4], [8] Ở Việt Nam, đã tìm thấy loại vi khuẩn dạng sợi bám, gây bệnh cho tôm nuôi khu vực miền Trung, đặc biệt trong các bể ấp ấu trùng, trong các ao nuôi thâm canh.[4] Kết quả điều tra bước đầu về dịch tễ học của bệnh hoại tử gan tại vùng nuôi tôm thịt tỉnh Khánh Hòa cho thấy bệnh xảy ra từ tháng 2 cho đến hết chu kỳ nuôi. Bệnh phát triển vào mùa khô, mùa có nhiệt độ cao (28 - 350C), độ mặn cao (30 - 40%).[4] Theo phân lập của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, đã phân lập được cầu khuẩn gram dương, trực khuẩn dung huyết mạnh, gram âm từ mẫu tôm bị bệnh đục thân ở Hải Phòng.[22] Gần đây công trình nghiên cứu lớn là đề tài cấp nhà nước mang mã số : KN -04-12 do Hà Ký đã nghiên cứu được 13 loại bệnh vi khuẩn tôm. Ông đã công bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâu nghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh.[5] 2.3. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 2.3.1. Trên thế giới Việc tăng năng suất, sản lượng Nuôi trồng thủy sản bằng cách ồ ạt phát triển nghề nuôi tôm khiến dịch bệnh ngày càng trở thành một vấn đề gây nhức nhối cho người nuôi. Để xử lý vấn đề này, các loại hoá chất, kháng sinh được xem như biện pháp đầu tiên được con người sử dụng để điều trị cho các loại thuỷ sản. Tuy nhiên, việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh không đúng quy cách, liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới sinh thái môi trường. Bên cạnh đó, việc tồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khoẻ của con người. Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị cho bệnh thuỷ sản đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Hơn nữa việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng tới môi trường sinh thái cũng như môi trường nuôi, đồng thời không ảnh hưởng tới sức khỏe của con người [15]. Các chiết xuất từ thảo dược như hinokiticol, citral, allylisocyanate được sử dụng rộng rãi trong bảo quản, điều trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra . [15] Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt vi khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa. Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc. Năm 1948, Marchado cùng cộng sự đã chiết suất từ tỏi được garcilin, chất này không có mùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella, Salmonella hoặc các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn. Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá hồ đào đối với Bacillus anthracis. R.Koch (1887) nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Cũng trong thời gian này Chamberland chứng minh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,...tiếp tục nghiên cứu. Năm 1959, Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa - Cannabinnacea, được chất cannabiriolic, dung dịch 10 - 15µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt vi khuẩn kháng lại penicillin. [15], [20] Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh như Phytocid có tác dụng với vi khuẩn, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú, có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi. [21 ]