Đề tài Xác định thành phần trái mướp đắng (Momordica Charantina Linn) thuộc họ bầu bí bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

a kĩ thuật sắc kí, vào năm 1903 khi ông ñang nghiên cứu về chlorophyll. Chữ sắc trong sắc kí có nghĩa là màu, nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, vừa là màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ. Tên này vẫn tiếp tục ñược dùng dù các phương pháp hiện ñại không còn liên quan ñến màu sắc. Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge ñược trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc kí phân bố. Kĩ thuật sắc kí phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc kí Tsvet có thể ñược áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ ñó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau. ðồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kí cũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. - Phương pháp sắc kí là một trong các kĩ thuật hóa học phân tích dùng ñể tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không ñồng ñều của chúng giữa pha tĩnh và pha ñộng khi cho pha ñộng ñi xuyên qua pha tĩnh. Nó bao gồm việc cho mẫu chứa chất cần phân tích trong “pha ñộng” thường là do dòng chảy của dung môi, di chuyển qua “pha tĩnh”, pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống với tốc ñộ khác nhau chúng sẽ ñược tách ra khỏi nhau theo thời gian khác nhau. Sắc kí cũng là quá trình trao ñổi chất như các phương pháp hóa lí khác: chưng cất, chiết, kết tinh…nhưng khác với phương pháp khác ñó ở chỗ sự phân chia sắc kí ñược thực hiện do quá trình hấp phụ - giải hấp phụ ñược lặp ñi lặp lại trong suốt quá trình tách. - Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào hiện tượng hấp phụ của các chất hữu cơ trên chất hấp phụ (trong phương pháp này chất hấp phụ gọi là pha tĩnh và tính tan của chúng trong dung môi hữu cơ gọi là pha ñộng khi ñi qua chất hấp phụ). PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 12 Sự hấp phụ phụ thuộc vào cấu tạo phân tử của chất hấp phụ, theo nguyên tắc chất phân cực hấp phụ chất phân cực và ngược lại chất không phân cực hấp phụ chất không phân cực. ðộ tan của chất hữu cơ trong dung môi phụ thuộc vào cấu trúc của chất và dung môi. Tùy thuộc vào cách thức thực hiện, từ ñó xuất hiện nhiều loại sắc kí khác nhau như: - Sắc kí khí - Sắc kí lớp mỏng - Sắc kí cột - Sắc kí trao ñổi ion - Sắc kí giấy - Sắc kí lỏng cao áp Khi tiến hành sắc kí thường xảy ra sự cạnh tranh giữa tính chất bị hấp phụ của chất nghiên cứu trên chất hấp phụ và tính giải hấp phụ của nó khi có dung môi ñi qua. + Nếu chất bị hấp phụ hoàn toàn thì chất không bị di chuyển khi dung môi dội qua + Nếu chất hòa tan hoàn toàn trong dung môi ñi qua (giải hấp phụ) thì chất ñược giải phóng và ñi cùng dung môi. + Nếu quá trình giải hấp chỉ mạnh hơn sự hấp phụ một ít thì quá trình hấp phụ và giải hấp xảy ra một cách liên tục khi dung môi ñi qua. Kết quả là chất nghiên cứu sẽ ñi ñược một khoảng nhất ñịnh ñược gọi là ñộ chuyển dịch sắc kí. ðộ chuyển dịch sắc kí này gọi là thời gian lưu tính bằng thời gian, ñó là thời gian tính từ lúc bơm mẫu cho ñến lúc xuất hiện chất trong sắc kí ñồ của sắc kí khí, sắc kí khí lỏng cao áp. Còn trong sắc kí giấy và sắc kí lớp mỏng, thời gian lưu này ñược ñặc trưng bởi giá trị Rf. Mỗi chất, mỗi hệ chạy khác nhau có các giá trị Rf khác nhau. Dựa vào ñộ phân cực mà chia chất hấp phụ làm hai loại chính: loại chất hấp phụ phân cực (như Fe2O3 > Al2O3 > Silicagel > cacbohidrat) và chất hấp phụ không PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 13 phân cực (như than hoạt tính, nhựa vonphatit EW). Các chất hấp phụ phân cực thường hay hút nước trong không khí ẩm, làm cho bề mặt của nó không có khả năng hấp phụ ñược nữa. Vì vậy trước khi làm thí nghiệm người ta phải hoạt hóa lại ñể ñuổi nước khỏi bề mặt chất hấp phụ ở nhiệt ñộ 110 - 1200C từ 1, 5 giờ ñến 2 giờ. Tùy theo lượng nước có trong oxit nhôm trung tính (hãng Merk) cỡ hạt 0,063 - 0,200nm mà chia chúng thành 5 ñộ hoạt hóa khác nhau: Hoạt ñộ I: 0 – 0, 50 % nước II: 2, 4 – 3 % nước III: 4, 3 – 4, 5 % nước IV: 6, 5 – 9, 5 % nước V: 13 – 15 % nước ðối với các chất bị hấp phụ, khả năng phân cực của chúng ñược xếp theo thứ tự tăng dần ñộ phân cực: hidrocacbon < ankyl halogenua < các ete < amin bậc 3 và hợp chất nitro < andehit, xeton < amin bậc 1< amit của axit < ancol < axit cacboxylic. ðể có thể ñẩy ñược các chất nghiên cứu ra khỏi chất hấp phụ thì ái lực của chất hấp phụ với dung môi phải mạnh hơn ái lực của chất nghiên cứu. Do ñó dung môi sẽ thế chỗ chất nghiên cứu. Tác dụng này của dung môi gọi là tác dụng rửa giải của nó. Trên các chất hấp phụ phân cực tác dụng rửa giải của dung môi ñược sắp xếp theo thứ tự tăng dần như sau: ete dầu hỏa < xiclohexan < CCl4 < benzen < CHCl3 < ñietylete < etyl axetat < axeton < methanol < H2O < axit axetic. ðối với các chất hấp phụ không phân cực thì thứ tự trên ngược lại. 1.3.1.1. Phương pháp phân tích bằng sắc kí cột: - Phương pháp sắc kí cột dùng ñể tách các chất trong hỗn hợp và tinh chế chất Trong sắc kí cột, chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha cố ñịnh ñược nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất ñược sử dụng làm cột mà sự tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế phân bố (cột phân bố), trao ñổi ion (cột trao ñổi ion)…Ở ñây trình bày sắc kí cột hấp phụ. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 14 - Nguyên tắc: Sắc kí hấp phụ ñược tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng ñứng gọi là “cột” với chất hấp phụ ñóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột là pha ñộng chảy qua chất hấp phụ. ðối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó ñối với dung môi rửa cột ñể lấy ra ñược lần lượt trước hoặc sau. Chất hấp phụ trong sắc kí cột thường dùng là: oxit nhôm, silicagel, than hoạt tính, polyamid… Silicagel là pha tĩnh ñược sử dụng rộng rãi nhất ñể tách các hợp chất thiên nhiên. Dung môi trong sắc kí cột có thể từng loại riêng biệt hoặc là hỗn hợp 2, 3 loại dung môi với tỷ lệ thích hợp. Với các chất hấp phụ cổ ñiển, dung môi sử dụng có ñộ phân cực tăng. Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh, ñầu dưới có khóa, ñầu trên có nút mài ñể nối với một phễu chứa dung môi. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, ñầu dưới nhỏ nối với một ống cao su, dùng một khóa kim loại ñể ñiều chỉnh tốc ñộ chảy của dung môi. Khi tiến hành chạy cột người ta thường dùng các cột có kích thước khác nhau tùy thuộc vào lượng chất ñem phân tích. Việc lựa chọn kích thước rất quan trọng. Thông thường cột có ñường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột có kích thước bán sẵn tương ứng với chiều dài và kích thước cột. ðường kính (cm) Chiều dài (cm) 1 15 2 25 3 40 4 60 PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 15 - Kĩ thuật triển khai: Kĩ thuật tách trên cột phụ thuộc rất nhiều vào cách nhồi cột và cách cho chất lên cột.
Chuẩn bị cột: rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.
Yêu cầu của cột sắc kí là chất rắn dùng làm cột phải phân tán ñồng ñều ở mỗi ñiểm trong cột thành một khối ñồng nhất. Cho chất hấp phụ vào cột còn gọi là nhồi cột Trọng lượng chất phân tích Tỷ lệ = Trọng lượng chất hấp phụ Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay ñổi thông thường từ 1/20, 1/30, 1/50…
Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô + Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương phình như: silicagel, sephadex…thì phải ngâm trong dung môi hữu cơ một thời gian trước khi cho vào cột ñể tránh bị nứt cột. Lắc, trộn ñều bột hấp phụ với dung môi hành một hỗn dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống ñáy cột. Trong quá trình nhồi cột, dung môi vẫn chảy ñều ra cột hứng, không ñược ñể khô dung môi trong cột. Tiếp tục cho dung môi chảy một thời gian ñể ổn ñịnh cột mặt thoáng trên ñầu cột phải nằm ngang. + Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng trương nở. Chất hấp phụ ñược nhồi từ từ vào cột ở dạng khô nhờ một phễu cuống dài. Dùng que bằng gỗ hoặc cao su gõ nhẹ và ñều chung quanh cột theo chiều từ dưới lên ñể bột xuống ñều. Khi chất hấp phụ ñược cho hết vào cột mới cho dung môi vào và chảy liên tục. Không ñược ñể khô dung môi trong cột.
Rửa cột: còn ñược gọi là giải ly chất ra khỏi cột. Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc ñộ chảy của cột mà người ta có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 16 + Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực. Cột áp suất thường có nhược ñiểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp phụ có kích thước hạt lớn. + Rửa cột bằng áp suất nén: Người ta thường cho dòng khí nén vào ñầu cột. Cột cùng với áp suất nén phải có nút ñảm bảo kín ở miệng, và có khóa hoặc dây buộc chặt vào miệng cột. Một hợp chất có thể bị giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào ñộ phân cực của dung môi giải ly. 1.3.1.2. Phương pháp phân tích bằng sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC): - Giới thiệu: Sắc lí lớp mỏng hay còn gọi là sắc kí bản mỏng hay sắc kí phẳng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng. Trong ñó pha ñộng là chất lỏng ñược ñi ngang qua một lớp chất hấp phụ trơ như: silicagel hoặc oxit nhôm, chất hấp phụ này ñược tráng thành một lớp mỏng, ñều, phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm hoặc tấm plactic. Do chất hấp phụ ñược tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là Sắc Kí Lớp Mỏng (SKLM), bản mỏng là các tấm kính phẳng có kích thước 5 x 12cm hoặc 20 x 20cm. Năm 1938 Izmailov và Chaiber lần ñầu tiên dùng bột oxit nhôm trải trên lớp kính ñể phân tích dịch chiết alkaloid từ thực vật. Sau ñó nhờ có công của Stahl tiêu chuẩn hóa các chất hấp phụ, thiết bị, qui trình phân tích, cách phát hiện… mà phương pháp này ñược phát triển. Ngày nay SKLM ñã là một phương pháp phân tích cơ bản không thể thiếu ñối với các nhà hóa học cũng như các nhà phân tích. - Nguyên tắc sử dụng: Trong sắc kí lớp mỏng có 4 cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao ñổi ion, rây phân tử, nhưng cơ chế hấp phụ chiếm phần lớn. Các chất cần tách trong SKLM có thể khuếch tán theo cả chiều dọc và chiều ngang ñối với phương chuyển ñộng của dung môi. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 17 SKLM là một phương pháp sắc kí dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành một lớp mỏng trên tấm kính, nhựa hay kim loại. Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha ñộng là dung môi di chuyển qua pha tĩnh. Cụ thể ta thực hiện như sau: Cho chất phân tích vào một dung môi dễ bay hơi, dùng vi quản ñể chấm một ít dung dịch mẫu, chấm chất này thành một vết nhỏ gọn, lên tấm lớp mỏng. Sấy nhẹ ñể ñuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy mẫu chất chỉ còn là dạng bột khô ở trên tấm lớp mỏng. ðặt tấm lớp mỏng này theo chiều thẳng ñứng trong một bình có chứa sẵn dung môi phù hợp. Dung môi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên trên cao trong tấm bảng, mẫu chất sẽ bị phân chia thành những chất riêng biệt. Các vết sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp vật lí (nhìn trực tiếp bằng mắt, soi dưới ñèn tử ngoại…), bằng phương pháp hóa học (phun lên tấm bảng các loại dung dịch thuốc thử). Một chất tinh khiết sẽ chỉ cho một vết tròn, có giá trị Rf không ñổi trong một hệ dung môi xác ñịnh. Trị số Rf ñược tính như sau: Rf = a b Với a: Khoảng cách từ ñiểm chấm tại vạch xuất phát ñến tâm của vết b: Khoảng cách từ vạch xuất phát ñến mức dung môi vạch giới hạn b a vạch xuất phát - Chất hấp phụ dùng trong sắc kí lớp mỏng: Trong sắc kí lớp mỏng thường dùng là: silicagel, Al2O3, cellulose…Ngoài ra người ta còn trộn thêm các chất chỉ thị phát huỳnh quang, chất kết dính. - Ứng dụng: PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 18 Kỹ thuật sắc kí hiện nay vẫn là công cụ ñắc lực trong ngành hóa hữu cơ, ñặc biệt trong hóa hợp chất thiên nhiên: + Cho biết ñặc ñiểm của hợp chất vừa trích ly, cô lập ñược (một chất tinh khiết sẽ có giá trị Rf không ñổi trong hệ dung môi xác ñịnh) + Có thể tiên ñoán sơ bộ là trong hỗn hợp chiết ban ñầu có bao nhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết. + ðể thăm dò tìm hệ dung môi thích hợp cho quá trình sắc kí cột. Trước khi dùng sắc kí cột ñể tách một lượng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thường hay sử dụng SKLM ñể thăm dò tìm hệ dung môi thích hợp cho quá trình sắc kí cột. + SKLM là công cụ ñắc lực ñể theo dõi quá trình sắc kí cột, ñể nhận ñịnh các phân ñoạn thu ñược từ sắc kí cột. Việc quan sát các vết trên bản mỏng rất quan trọng ñể có thể nhận ñịnh rằng phân ñoạn ñó là hỗn hợp hay tinh khiết hoặc ñể gộp các phân ñoạn có cùng Rf với nhau. + ðể theo dõi tiến trình của một phản ứng. 1.3.1.3. Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí (GC) Sắc kí khí có thể dùng ñể nghiên cứu các tính chất của hệ, cũng như nghiên cứu ñộng học của các quá trình hóa học. Máy ñể tách sắc kí khí và thu phổ gọi là sắc kí khí (GC). Trong quá trình phân tích, khí ñược thổi liên tục từ bình chứa qua một hệ thống gồm bộ nạp mẫu, cột, detector và lưu lượng kế. Bộ nạp mẫu dùng ñể ñưa mẫu khí hoặc lỏng vào cột sắc kí. Do ñó, mỗi loại cột chỉ tách những chất nhất ñịnh và trong những ñiều kiện nhất ñịnh. Các yếu tố cần lưu ý khi sử dụng sắc kí gồm: + Khí mang: Các khí mang phải ñược bảo ñảm tính chất khuyếch tán cần thiết, phù hợp với ñộ nhạy cần thiết, trơ với tướng tĩnh lỏng, chất phân tích, vật liệu làm cột và detector. Khí mang có khả năng hấp phụ càng nhỏ càng tốt, có ñộ sạch cao, dễ sử dụng và giá thành chấp nhận ñược. Các khí mang thông thường là nitơ, argon, heli…Tốc ñộ dòng khí mang ảnh hưởng nhiều ñến kết quả phân tích vì hiệu suất cột phù thuộc vào nó. ðộ nén khí trong cột (áp suất khí mang) có ảnh hưởng PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 19 nhất ñịnh ñến các ñại lượng ño ñược trong sắc kí. Tốc ñộ khí mang và áp suất thường ñược xác ñịnh bằng thực nghiệm và trên một máy sắc kí khí cụ thể. + Cột sắc kí: Cột sắc kí là một sản phẩm hoàn chỉnh, trong ñó có vật liệu làm cột, kích thước chất mang…Mỗi cột có những chất mang khác nhau ñể phân tích những loại chất khác nhau. + Nhiệt ñộ: Tùy thuộc vào nhiệt ñộ hóa hơi của mẫu mà sử dụng chế ñộ nhiệt ñộ thích hợp. Nhiệt ñộ thích hợp ñã chọn phải giữ không ñổi trong suốt thời gian thí nghiệm. Có thể dùng ñẳng nhiệt hay chương trình nhiệt ñộ ñể phân tích. Quá trình sắc kí xảy ra ở nhiệt ñộ không ñổi trong thời gian bơm mẫu và không ñổi trên toàn bộ chiều dài của cột tách, gọi là ñẳng nhiệt. Còn trường hợp thay ñổi nhiệt ñộ theo thời gian theo chương trình nhất ñịnh, gọi là chương trình nhiệt ñộ. 1.3.1.4. Phương pháp phân tích bằng sắc kí khí – khối phổ (GC/MS): Phương pháp sắc kí khí – khối phổ GC/MS (Gas Chromatography – Mass Spectrometry) dựa trên cơ sở nối ghép sắc kí khí với một máy khối phổ, ñể xác ñịnh một cấu tử nào ñó trong hỗn hợp chất cần phân tích. ðây là phương pháp nhanh và rất hiệu quả trong việc xác ñịnh thành phần của các chất tổng hợp ñược. ðể hiểu thêm về phương pháp này, cần ñiểm qua về máy khối phổ. Phương pháp khối phổ là phương pháp nghiên cứu bằng cách ño chính xác khối lượng phân tử chất ñó. Chất nghiên cứu trước tiên ñược chuyển thành trạng thái hơi, sau ñó chuyển thành các ion. Các ion tạo thành ñưa vào máy khối phổ. Quá trình biến ñồi các phân tử trung hòa thành các ion ñược gọi là ion háo. Các ion có khối lượng m và ñện tích e. Tỷ số m/e ñược gọi là số khối z. Khi tách ion có số khối khác nhau và xác ñịnh xác suất có mặt của chúng, người ta vẽ ñồ thị mối liên quan giữa xác suất có mặt (hay gọi là cường ñộ I) và số khối z. ðồ thị ñó gọi là phổ khối lượng. ðể ñánh giá chất lượng của khối phổ kế, người ta dùng khái niệm “ñộ phân giải” (R): R=m/∆ m Trong ñó : m là khối lượng ion. m∆ là hiệu số khối lượng hai ion có thể tách khỏi nhau. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 20 Giá trị R càng lớn thì máy càng tốt. 1.3.2. Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (IR): Khi chiếu tia hồng ngoại vào các phân tử ở trạng thái mức ñiện tử cơ sở, những tia này truyền cho phân tử năng lượng cần thiết ñể có thể thay ñổi những trạng thái dao ñộng và quay. Trong trường hợp phân tử ñơn giản gồm hai nguyên tử A và B thì dạng ñồng nhất dao ñộng là sự dãn ra, co lại theo chu kỳ liên tục A - B có thể tính theo phương trình sau: 1/ 21 2 f v C mpi   =    v – tần số của các dao ñộng hóa học. c – vận tốc ánh sáng. f – hằng số lực liên kết. m – trọng lượng xác ñịnh theo phương trình. m = mA . mB/ (mA + mB) mA . mB: là khối lượng của những nguyên tử tách biệt A và B. Dao ñộng liên kết ở các liên kết tách biệt trong những phân tử rất phức tạp có thể tính một cách tương tự như trên mặc dù có thể có những dạng dao ñộng, còn các tần số của vạch hấp phụ phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Nếu ta thay những trị số tương ứng của c, f, m ñối với liên kết C-H vào phương trình trên thì ta có ñược tần số 2975-2950 cm-1 (3,47 - 3,50 µ ) của tần số dao ñộng liên kết C-H trong nhóm metyl. Người ta thường dùng cách tính như trên, khi những nguyên tử kết hợp có khối lượng khác nhau lớn kết hợp với nhau. Khi phân tử chịu tác dụng của bức xạ có năng lượng rất bé (tương ứng với v = 1 - 300 cm-1) thì năng lượng hấp thụ chỉ có thể thay ñổi trạng thái quay. Khi phân tử chịu tác dụng của bức xạ có năng lượng lớn ( ứng với v = 300 - 4000 cm-1) thì năng lượng làm thay ñổi trạng thái dao ñộng và quay của phân tử sẽ phát sinh ra dao ñộng và quay hồng ngoại. Các ñơn vị trong quang phổ hồng ngoại thường dùng số sóng v biểu diển thì ở dạng cm-1 thường gọi là tần số, mặc dù thực tế ñơn vị tần số có kích thước là s-1. ðộ dài sóng thường ño bằng micro ( µ ). Mối liên hệ giữa các ñại lượng này biểu thị như sau: PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 21 /v c λ= Người ta ño cường ñộ vạch hấp phụ dựa theo ñịnh luật Lambert Beer: clII ε10.0= Trong ñó: I, I0 là cường ñộ ánh sáng ε là hệ số tắc quang C là nồng ñộ chất ño (g/l) l là chiều dày lớp mẫu Khi ño hấp phụ người ta xuất phát từ cường ñộ bức xạ I0 ñi vào chất hấp phụ. cường ñộ bức xạ giảm xuống tới I khi ñi qua môi trường hấp phụ. 1.3.3. Phương pháp phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phương pháp cộng hưởng từ dựa vào sự tương tác của nguyên tử, phân tử với từ trường gồm hai loại: + Cộng hưởng từ ñiện tử, lấy sự dịch chuyển giữa các mức từ của ñiện tử làm cơ sở cho các tính toán. + Cộng hưởng từ hạt nhân, lấy sự dịch chuyển giữa các mức từ hạt nhân làm cơ sở cho các tính toán. Trong khuôn khổ của khóa luận này, chỉ ñề cập ñến những nét tổng quan cơ bản nhất của phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân. Phương pháp quang phổ cộng hưởng tử hạt nhân (NMR) là phương pháp quan trọng trong hóa học, ñặc biệt ñối với hóa học hữu cơ. Khi ñặt trong ñiện trường những nhân từ tính thì xảy ra sự hấp thụ chọn lọc sóng ñiện từ, phát sinh ra hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân. Nhân nguyên tử cấu tạo từ các proton và nơtron, ñược ñặc trưng bằng số lượng tử spin I = ± 1/2, số lượng tử spin I của nhân là tổng số các số spin của nucleon. Khi nucleon có số ñiện tử lẻ thì spin toàn bộ của nhân I = -1/2, có nghĩa là không ñền bù cho nhau. Các nhân trên như 13C, 19C, 1H, 31P…chính là vật thể ñiện quay và cân ñối cầu. Sự chuyển ñộng quay của ñiện tích dẫn ñến sự phát sinh ra momen từ ( µ nhân khác 0), những nhân có số chẳn nucleon như 12C, 16O, 32S…tương tự như vật thể này bằng không có sự phân bố ñiện tích cân ñối cầu. Spin hạt nhân của các vật thể này bằng không I = 0, µ = 0. ðó là những nhân không có từ tính, không hấp thụ PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 22 bức xạ tần số vô tuyến. Khi ñặt hợp chất chứa những phân tử trên trong từ trường không ñổi thì các mức năng lượng ñược phân chia. Sự khác nhau ở mức năng lượng gần nhau, phụ thuộc vào tính chất của nhân và cường ñộ từ trường H. ðiều kiện ñể xảy ra hiện tượng cộng hưởng. Khi cung cấp một năng lượng từ ngoài vào thì trạng thái cân bằng ñộng bị phá vỡ, các hạt nhân nằm ở mức năng lượng thấp sẽ hấp thụ năng lượng ñể chuyển lên mức năng lượng cao, nhưng chỉ trong một thời gian ngắn, một số hạt nhân có mức năng lượng cao lại bức xạ năng lượng xuống mức năng lượng thấp tạo ra một cân bằng ñộng mới. Khoảng thời gian trên gọi là thời gian phục hồi spin - spin. Năng lượng ñược cấp cho quá trình trên ñúng bằng E∆ và ñược gọi là năng lượng cộng hưởng từ hạt nhân. Tần số cộng hưởng từ hạt nhân của một số hạt nhân khi thực hiện phân tích bằng phương pháp này là 1H và 13C ñược biết ñến như sau: + 1H có từ trường H0 (G): 1000 và 23487; hằng số ν (107 rad.T-1p-1) có giá trị 26,750, còn tần số cộng hưởng 0 ( )MHzν có giá trị 42,5759 và 100,00. + 13C có từ trường H0(G): 23487; hằng số ν (107 rad.T-1p-1) có giá trị 6,726 còn tần số cộng hưởng 0ν (MHz) có giá trị 25,145. Tất cả các hợp chất hữu cơ ñều chứa nguyên tử cacbon mà trong tự nhiên nguyên tử cacbon 13C chiếm tỷ lệ 1,1% nên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C NMR) có ý nghĩa quan trọng so với phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR. Hợp chất hữu cơ không chứa hydro thì không có tín hiệu phổ 1H NMR, nhưng có tín hiệu phổ 13C NMR. Thông thường, người ta sử dụng phổ kế cộng hưởng từ biến ñổi Fourrier (FT). Khi dùng máy này có thể ghi phổ 13C NMR theo một số cách khác nhau. Nhưng quan trọng nhất là phổ 13C tương tác với 1H và phổ 13C xóa tương tác 1H. Do phân tử của các hợp chất hữu cơ rất phức tạp, nên ñể giảm bớt khó khăn, người ta ñã tìm ra một số phương pháp kĩ thuật ñễ hỗ trợ, ñồng thời với việc chế tạo một số thiết bị có tần số cộng hưởng lớn. Trong các phương pháp kỹ thuật hỗ trợ ñó, có thể kể ñến phương pháp cộng hưởng từ kép, cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều…Các kỹ thuật này trình bày khá chi tiết trong các sách giáo khoa khác. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 23 CHƯƠNG 2: KĨ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1. Dụng cụ và hóa chất: 2.1.1 Dụng cụ:  Cân phân tích  Tủ sấy  Máy xay sinh tố  Cột sắc kí  Sắc kí lớp mỏng  Máy bơm chân không  Một số dụng cụ khác: cốc 500ml, 50ml, ống nghiệm, ñèn cồn, bình hút ẩm, ống vi quản… 2.1.2. Hóa chất: - Hoá chất sử dụng:  Etanol  Etyl axetat  Ete dầu hỏa  Silicagel bột  Sắc kí lớp mỏng silicagel  Axit sunfuric  Cloroform  Một số hóa chất khác - Một số thuốc thử: thuốc thử Felling, Salkowski, Noller, Libermann – burchard, Baljet, Gelatin, FeCl3, chì axetat, HCl, Mg, rượu isoamylic… 2.2. Phương pháp thực nghiệm: 2.2.1. Thu mẫu và xử lí mẫu: Trái mướp ñắng ñược thu mua tại chợ Tân Tịch thuộc Phường 6 thành phố Cao Lãnh ðồng Tháp. PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 24 Trái mướp ñắng tươi sau khi thu mua ñược xử lí sơ bộ: rửa sạch, bỏ hạt, xắt lát mỏng, ñem phơi tự nhiên, sau ñó sấy ở nhiệt ñộ 500C ñến khối lượng không ñổi. Sau ñó xay nhuyễn ta thu ñược bột nguyên liệu khô. 2.2.2. Xác ñịnh ñộ ẩm nguyên liệu: Cân 250g một lượng xác ñịnh mẫu mướp ñắng tươi ñã loại bỏ phần ruột bên trong, xắt lát mỏng, phơi khô tự nhiên. ðem sấy ở nhiệt ñộ 500C ñến khối lượng không ñổi, cân lại lượng mẫu sau khi sấy ta tính ñược ñộ ẩm của nguyên liệu ðộ ẩm của nguyên liệu ñược tính theo công thức sau ñây: Khối lượng mẫu mướp ñắng tươi (g) Khối lượng mẫu mướp ñắng khô (g) 250 14 Hàm lượng ẩm trong nguyên liệu: 94,4% Hình 1.3. Trái mướp ñắng ñược thu mua và xử lí Khối lượng mẫu tươi – khối lượng mẫu khô = Khối lượng mẫu tươi ðộ ẩm (%) = PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1. ðịnh tính thành phần trái mướp ñắng tươi: 3.1.1. ðiều chế cao EtOAc từ trái mướp ñắng tươi: Sơ ñồ 1: ðiều chế cao EtOAc Bỏ ruột bên trong Xay nhuyễn 1. Ngâm với EtOAc 2. Lọc áp suất thấp 3. Làm khan bằng Na2SO4 ðuổi dung môi - Tiến hành: Cân 200g trái mướp ñắng tươi ñã tách bỏ phần ruột bên trong, xắt nhỏ, dùng máy xay sinh tố xay nhuyễn, cho vào cốc thủy tinh và cho 400ml EtOAc vào ngâm khoảng 24 giờ. Tiến hành lọc áp suất thấp. Sau ñó cho vào phễu chiết thì dung dịch trong phễu chia làm 2 lớp rõ rệt, ta chiết lấy phần dung môi hữu cơ và làm khan lớp dung môi này bằng Na2SO4 khan. Tiến hành lọc, ñuổi dung môi thu ñược cao EtOAc của trái mướp ñắng tươi. Trái mướp ñắng tươi Phần trái xanh còn lại Cao EtOAc Dịch chiết EtOAc Nguyên liệu xay nhuyễn PDF Created with deskPDF PDF Writer - Trial :: 26 - Ứng dụng sắc kí: Nếu ta sử dụng hệ dung môi sắc kí khác nhau thì các hợp chất có trong cao EtOAc sẽ thể hiện trên bảng SKLM khác nhau. Hệ dung môi PE: EtOAc (1:3) hiện màu với H2SO4 50%. Ta thấy sẽ có một ñường kéo dài từ ñiểm xuất phát ñến vết cuối có những vết tròn