Đề tài Xây dựng quy trình sản xuất sinh khối sợi nấm Ganoderma lucidum

ên cứu Linh chi tỉnh Quảng Đông báo cáo dùng siro Linh chi và đường Linh chi, trị 1.110 ca có kết quả và có nhận xét là thuốc có tác dụng đối với thể hen và thể hư hàn ( theo tờ báo cáo tư liệu Y dược Quảng Đông 1979,1:1). Trị viêm gan mạn tính: Tác giả dùng polysaccarit Linh chi chiết xuất từ Linh chi hoang dại chế thành thuốc bột hòa nước uống, trị các loại bệnh viêm gan mạn hoạt động, viêm gan mạn kéo dài và xơ gan gồm 367 ca, có nhận xét phần lớn triệu chứng chủ quan được cải thiện, men SGOT, SGPT giảm tỷ lệ 67,7% ( Tạp chí Bệnh gan mật 1985,4:242). Trị chứng giảm bạch cầu: dùng polysaccarit chế thành viên (mỗi viên có 250mg thuốc sống) cho uống, theo dõi 165 ca, ghi nhận tỷ lệ có kết quả 72,57% ( Báo cáo của Lưu Chí Phương đăng trên tạp chí Trung hoa huyết dịch bệnh 1985,7:428). Trị bệnh xơ cứng bì, viêm da cơ, bệnh liput ban đỏ, ban trọc: dùng Linh chi chế thành dịch, tiêm bắp và viên uống. Trị xơ cứng bì 173 ca, tỷ lệ kết quả 79,1%, viêm da cơ 43 ca, có kết quả 95%, Liput ban đỏ 84 ca có kết quả 90%, ban trọc 232 ca, có kết quả 78,88% ( Thông tin nghiên cứu Y học 1984,12:22). Theo sách Trung dược ứng dụng lâm sàng: thuốc có tác dụng đối với bệnh loét bao tử, rối lọan tiêu hóa kéo dài, thường dùng phối hợp với Ngũ bội tử, Đảng sâm, Bạch truật, Trần bì, Kê nội kim, Sa nhân, Sinh khương. Trị xơ cứng mạch, cao huyết áp, tai biến mạch não: thường phối hợp với Kê huyết đằng, Thạch xương bồ, Đơn bì, Cẩu tích, Đỗ trọng, Thỏ ty tử, Hoàng tinh. Thuốc còn dùng chữa bệnh động mạch vành, đau thắt ngực. Dùng giải độc các loại khuẩn: phối hợp với cam thảo, gừng, táo. Ngoài ra sách Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam của Đỗ Tất Lợi có ghi: Thuốc chữa bệnh phụ nữ thời kỳ mãn kinh, giúp thông minh và trí nhớ, dùng lâu ngày Co mp ny C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 14 giúp cho nhẹ người, tăng tuổi thọ. Nhiều người mua nấm Linh chi về nấu canh, nấu súp làm món ăn cao cấp. 2.5 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ HOẠT CHẤT CÓ TRONG NẤM LINH CHI 2.5.1 Ganoderma polysaccharide (GLPs) [15, 16] Có trên 200 loại polysaccharide được ly trích và thu nhận từ nấm Linh chi nhưng polysaccharid gồm 2 loại chính: GL-A: Gal: Glu: Rham: Xyl (3,2: 2,7: 1,8; 1,0) M= 23.000 Da GL-B: Glu: Rham: Xyl (6,8: 2,0: 1,0) M= 25.000 Da GL-A có thành phần chính là Gal, nên gọi là Galactan, còn GL-B có thành phần chính là Glu, nên gọi là Glucan. b (1-3) -D-glucan, khi phức hợp với một protein, có tác dụng chống ung thư rõ rệt (Kishida & al., 1988). . Hầu hết các GLPs hình thành từ 3 chuỗi monosaccharide, có cấu trúc xoắn ốc 3 chiều, giống cấu trúc của ADN và ARN. Cấu trúc xoắn này tựa trên khung sườn cacbon, lượng khung sườn từ 100,000 – 1000,000, đa số chúng tồn tại phía trong vách tế bào (CWM). Một phần polysaccharide phân tử nhỏ không tan trong cồn cao độ, nhưng tan trong nước nóng. Ngoài polysaccharide từ quả thể, polysaccharide cũng được thu nhận từ quá trình nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng và rắn, chúng vẫn có hoạt tính sinh học trong việc chữa trị. Polysaccharid có nguồn gốc từ Linh chi dùng điều trị ung thư đã được công nhận sáng chế (patent) ở Nhật. Năm 1976, Cty Kureha Chemical Industry sản xuất chế phẩm trích từ Linh Chi có tác dụng kháng carcinogen. Năm 1982, Cty Teikoko Chemical Industry sản xuất sản phẩm từ Linh chi có gốc glucoprotein làm chất ức chế neoplasm. Bằng sáng chế Mỹ 4051314, do Ohtsuka & al. (1977), sản xuất từ Linh chi chất mucopolysaccharid dùng chống ung thư. 2.5.2 Ganoderic Acid Co mp a y C o fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 15 Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [18, 19] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C38H48) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [10, 11] Bảng 2.3: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Triterpenoid đặc biệt là acid ganoderic có tác dụng chống dị ứng, ức chế sự giải phóng histamin, tăng cường sử dụng oxy và cải thiện chức năng gan. Hiện nay, đã tìm thấy trên 80 dẫn xuất từ acid ganoderic. Trong đó ganodosteron được xem là chất kích thích hoạt động của gan và bảo vệ gan. 2.5.3 Ganoderma Adenosine [18, 19] Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 16 Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine: ü Giảm độ nhớt máu ü Ức chế kết dính tiểu cầu ü Ngăn chặn hình thành cục nghẽn ü Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin ü Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lượng máu cung cấp cho não ü Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.5.4 Alcaloid [10, 11] Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid. ü Tác dụng lên hệ thần kinh ü Tác dụng lên huyết áp ü Tác dụng trị ung thư 2.5.5 Hợp chất Saponin [21, 23] Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm: Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 17 ü Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean. ü Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. Hợp chất Saponin có nhiều công dụng trong y học như: ü Trị long đờm, chữa ho ü Là chất phụ gia trong một số vắc xin ü Tác dụng thông tiểu ü Tác dụng kháng viêm, chống khối u 2.5.6 Germanium hữu cơ [18, 19] Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium: ü Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư ü Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ ü Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ Co mp an y C on fid en ti l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 18 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM THÍ NGHIỆM Đề tài được thực hiện từ 27/09/2008 đến 1/1/2009 tại Phòng Thí nghiệm Vi sinh thực phẩm, Khoa Sinh học Ứng dụng - Trường Cao đẳng Kinh tế – Công nghệ TP. Hồ Chí Minh 3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm khoa sinh học ứng dụng, Trường Cao Đẳng Kinh Tế - Công Nghệ Tp.HCM. 3.3 VẬT LIÊU THÍ NGHIỆM 3.3.1 Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp thanh trùng Tủ sấy 3.3.2 Hóa chất Các hóa chất bao gồm: MgSO4, KH2PO4, Glucose, Agar. 3.3.3 Môi trường sử dụng 3.3.3.1 Môi trường dinh dưỡng Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 19 3.3.3.2 Môi trường nhân giống Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn với cám bắp. 3.4 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.4.1 Quan sát hình thái quả thể nấm Ganoderma lucidum 3.4.1.1 Hình thái quả thể 3.4.1.2 Phương pháp quan sát hệ sợi nấm [9] ü Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính ü Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn ü Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút ü Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95% ü Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu ü Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3 Phương pháp quan sát bào tử nấm Linh chi [13, 17] ü Lấy quả thể nấm Linh chi trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử ü Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính ü Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô ü Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2 Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các môi trường lỏng Cách tiến hành: Các môi trường đều được pha với nồng độ khác nhau. và được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy giống. Sau 9 ngày ta thu sinh khối và sấy ở nhiệt độ 500C và tiến hành cân trọng lượng khô. Tổng số chai cấy: 52 chai Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 20 3.4.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PG + 1 g/l MgSO4 2 PG + 2 g/l MgSO4 3 PG + 3 g/l MgSO4 4 PG + 4 g/l MgSO4 3.4.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PG + 0,5 g/l KH2PO4 2 PG + 1g /l KH2PO4 3 PG + 1,5 g/l KH2PO4 4 PG + 2 g/l KH2PO4 3.4.2.3 Ảnh hưởng của hàm lượng Glucose đến tốc độ tăng sinh khối trong môi trường lỏng Thí nghiệm được bố trí 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4 chai, mỗi chai chứa 20ml môi trường Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 P + 10 g/l Glucose 2 P + 15 g/l Glucose 3 P + 20 g/l Glucose Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 21 4 P + 25 g/l Glucose 5 P + 30 g/l Glucose 3.4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH lên môi trường nuôi cấy pH ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tăng trưởng của sợi nấm trong môi trường lỏng. Ở các giá trị pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của sợi nấm khác nhau. Do đó, trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của sợi nấm Linh chi để tìm được giá trị pH thích hợp cho sự phát triển của sợi nấm. Cách tiến hành: pha môi trường lỏng PG (potato glucose) với nồng độ pH khác nhau và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối sau 9 ngày. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Thí nghiệm được thực hiện với 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 2 chai. Vậy tổng số chai cấy là 14 chai 3.4.4 Nghiên cứu đường cong sinh trưởng của Ganoderma lucidum Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 100ml một lượng môi trường 20 ml. Hấp khử trùng ở 121oC/15 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 3, 6, 9, 12, 15, 21. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50oC và tiến hành cân trọng lượng khô. Trong quá trình thí nghiệm, gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 2 chai. Tổng số chai cấy là 10 chai. 3.5. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 3.5.1. Mục đích Tìm điều kiện tối ưu để thực hiện các quá trình hoặc chọn lựa thành phần tối ưu của nhiều phần tử trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật. Phương pháp quy hoạch thực Co mp an C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 22 nghiệm nhiều yếu tố cho phép thay đổi đồng thời nhiều yếu tố và xác định được tương tác giữa các yếu tố, nhờ đó giảm bớt số thí nghiệm. 3.5.2. Phương pháp xử lý số liệu Phương trình hồi quy được xây dựng từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến mật độ tế bào. Ảnh hưởng của các yếu tố được đánh giá dựa trên xác xuất tin cậy hay mức ý nghĩa p của chúng. Ảnh hưởng được coi là rất lớn khi p ≤ 0,0001, ảnh hưởng là đáng kể khi 0,0001 < p ≤ 0,05 và không đáng kể khi p > 0,05. Chỉ có những hệ số biểu diễn ảnh hưởng rất lớn và đáng kể mới được giữ lại trong phương trình hồi qui cuối cùng. Khi ảnh hưởng của các yếu tố hay ảnh hưởng tương hổ giữa các yếu tố là đáng kể thì hệ số biểu diễn ảnh hưởng của các yếu tố đó luôn được giữ lại trong phương trình. Phương trình hồi quy Yi = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b12 1 2x x + b13 1 3x x + b23 2 3x x + b123 1 2 3x x x Trong đó ü Yi: Sinh khối nấm thu được (g/20ml) ü ix (i= 1 – k): là các yếu tố ảnh hưởng, mỗi yếu tố có hai mức là hai giới hạn biên của nó. ü bo, bi, bj, bij: là các hệ số trong phương trình hồi quy Để đơn giản trong tính toán, chuyển từ hệ trục tự nhiên sang hệ trục không thứ nguyên (hệ mã hoá). Xét yếu tố được kí hiệu là Zi Zio = ( Zi max + Zimin)/2 Với: + Zimax: mức cao + Zimin: mức thấp + Zio: mức cơ sở ü Điểm có tọa độ (Z1o, Z2o, Z3o,…Zko) gọi là tâm của phương án Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 23 ü Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc tọa độ. ü Phương pháp xử lý số liệu từ các kết quả thực nghiệm. Các hệ số trong phương trình mô tả ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến khả năng tăng sinh khối. Phương trình hồi quy Y = b0 +b1 1x + b2 2x + b3 3x + b1b2 1 2x x + b1b3 1 3x x + b2b3 2 3x x + b1b2b3 1 2 3x x x Với + Y: sinh khối (g/20ml) + b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b123 : các hệ số trong phương trình hồi quy + 1x : nồng độ MgSO4 (g/l) + 2x : nồng độ KH2PO4 (g/l) + 3x : nồng độ Glucose (g/l) Bảng 3.1: Các yếu tố thí nghiệm Các yếu tố (g/l) Các mức 1x 2x 3x Mức cơ sở Khoảng biến thiên Mức trên Mức dưới Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm Số TN 1x 2x 3x y1 y2 y3 Ytb 1 + + + 2 - + + 3 + - + 4 - - + 5 + + - 6 - + - Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 24 7 + - - 8 - - - 3.6 XÁC ĐỊNH DƯỢC CHẤT CÓ TRONG NÂM LINH CHI 3.6.1 Phương pháp định tính alcaloid [11] 3.6.1.1 Chuẩn bị dịch thử Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau: - Phần 1: Bột nấm Linh chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu không có kết tủa, chưa thể kết luận là không có alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2. - Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (môi trường phải có tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung môi đến cạn, thu được cặn. Hòa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff. 3.6.1.2 Thuốc thử định tính alcaloid - Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử. - Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D=1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần. Co mp an y C on fid e tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 25 Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alcaloid, nếu có alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu. 3.6.2 Phương pháp xác định hợp chất saponin [11] Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính. 3.6.2.1 Thử nghiệm tính tạo bọt Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin. Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả: Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++ 3.6.1.2 Thử nghiệm Fontan – Kaudel Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm. Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13) Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm. ü Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid. ü Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 26 3.6.3 Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard) Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 10 – 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether. Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận có triterpenoid 3.6.4 Định tính acid hữu cơ Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là có acid hữu cơ. 3.7 ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHARIDE (GLPs) [15, 16] Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 27 Hình 3.1: Qui trình chiết suất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và ctv, 2001) Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi. Sinh khối nấm Linh Chi Nghiền Hổn hợp chiết rút lần 1 Bã chiết lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 3 Dịch chiết lần 1 Dịch chiết lần 2 -Ngâm nước 70oC trong 3 giờ -Ngâm trong nước 70oC trong 3 giờ -Ngâm trong cồn 80% ở 70oC trong 2 giờ Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 28 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 QUAN SÁT HÌNH THÁI GIẢI PHẨU CỦA NẤM LINH CHI (GANODRMA LUCIDUM) 4.1.1 Hình thái quả thể nấm Linh chi Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) được nuôi trồng tại Phòng thí nghiệm, Khoa sinh học ứng dụng trước đó, có hình dạng như sau : Hình 4.1: Hình thái nấm Linh chi Nhận xét: Quả thể của nấm Linh chi thu hái được có cuống ngắn, đính bên, cuống nấm to (đường kính 2- 3 cm), lớp vỏ cuống láng, đỏ nâu. Mũ nấm hình quạt, đôi khi có hình dị dạng, mặt mũ nấm láng, đỏ nâu, có vân gợn đồng tâm. Khi còn non, tai nấm có màu vàng chanh – vàng cam cho đến đỏ tươi, càng về già thì màu càng sẫm lại. Kích thước từ 3 – 12 cm, dày từ 1 – 3,5 cm. Phần đính cuống gồ lên hoặc lõm xuống. Mặt dưới thể quả thường màu trắng kem – hơi vàng, có nhiều lỗ nhỏ. Đây là lớp bào tầng sinh sản của nấm, chính những lỗ này là nơi phóng thích bào tử khi quả thể trưởng thành. Mật độ lỗ khoảng 3 – 5 ống/mm2, miệng lỗ gần tròn. Khi chúng tôi bổ đôi quả thể ra thì thấy đây là những ống thẳng, chiều dày từ 0,3 – 1,5 cm. Khi bào tử đảm chín thì nó được phóng thích dọc theo ống này và thoát ra ngoài qua miệng lỗ ống. Còn phần thịt nấm ở trên thì có màu vàng nâu đến nâu đỏ. Phân cách giữa phần trên và phần dưới (tầng sinh sản) là khá rõ ràng vì phần trên thì các lớp tia sợi hướng lên, còn phần dưới thì là ống thẳng hướng xuống. Co mp an y C on fid en tia l SVTH: Nguyễn Vũ Duy Khanh GVHD: Th.S Nguyễn Minh Khang 29 4.1.2 Hệ sợi nấm Ganoderma lucidum Hình 4.2: Hình thái sợi nấm Linh chi (vật kính dầu x100) 4.1.3 Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum Bào tử đảm có dạng hình trứng, chúng ta có thể thấy rõ trên cả 2 hình đều có đầu chóp tròn - nhọn, phồng căng. Bào tử nấm Linh chi có cấu trúc vỏ kép, có kiến tạo lỗ thủng (porus, lacunae) và có kích thước bào tử khoảng 8 – 11 x 6 – 8 µm Hình 4.3: Cấu trúc bào tử nấm Ganoderma lucidum 4.2 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA LUCIDUM) 4.2.1 Tốc độ sinh trưởng hệ sợi nấm Ganodrma lucidum trên các môi trường lỏng 4.2.1.1 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4 đến tốc độ tăng sinh khối sợi nấm Linh chi trong môi trường lỏng Mg2+ là khoáng chất cần thiết cho sự hoạt động một số loại enzym, giúp quá trình sinh tổng hợp các chất tham gia xây dựng tế bào được xảy ra nhanh hơn. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng MgSO4 ở các hàm lượng khác nhau. Từ đó, chúng tôi có thể xác định được hàm lư