Định lượng berberin trong sản phẩm chiết được từ vàng đắng

ánh xe, giữa có vòng lõi tuỷ xốp. Lá mặt trên xanh, mặt dưới màu trắng nhạt, có 5 gân ( 3 gân nổi rõ). Hoa màu trắng phớt tím, mọc thành xim ở kẽ lá. Rễ hình trụ, đầu thuôn hình nón, mặt ngoài màu trắng nhạt, mặt trong màu vàng. Theo Võ Văn Chi mô tả [2]: Vàng đắng là một loại dây leo to, thân rộng 5-7cm có thể tới 15-20cm ở những gốc già; gỗ màu vàng, vỏ thân nứt nẻ màu xám trắng; các nhánh, mặt dưới lá, cụm hoa và quả có lông màu trắng bạc. Lá mọc so le, phiến to đến 25cm, gân gốc 5; màu trắng mốc ở mặt dưới; cuống phình và cong ở góc, hơi dính vào trong phiến lá. Hoa nhỏ mọc thành chụm tán trên thân già, hoa đực có 5 nhị, hoa cái có nhị lép, 3 lá noãn có lông. Quả hạch tròn, đường kính cỡ 2,5cm. Riêng Phạm Hoàng Hộ [4] lại mô tả cây vàng đắng với những loài khác nhau: Coscinium fenestratum Colebr. ( Dây vàng đắng) Dây leo to, thân rộng 5-7cm, gỗ vàng; nhánh, mặt dưới lá, phát hoa và trái có lông the quắn, trắng, phiến lá to đến 25cm, có 5 gân xuất phát từ đáy, trắng mốc mặt dưới, cuống phù và cong ở đáy. Chụm mang tán trên thân già; hoa đực có 6 tiểu nhuỵ, hoa cái có tiểu nhuỵ lép, 3 tâm bì có lông cho ra trái tròn, to 2,5cm. C. blumeanum Miers. ( Vàng đắng Blume) Dây leo, thân to. Lá có phiến xoan hay xoan tròn dài, to 12-35cm, rộng 6-20cm, không lông. Lúc nhỏ như mặt bọt, mặt dưới mốc trắng, có lông dày, gân ở đáy 7, gân phụ 2-5 cặp, Cuống dài 6-20cm, gắn cách bìa 1,5-2cm. Hoa đầu to 10-13cm; hoa đực có 3-6 lá đài, 6 tiểu nhuỵ. Hoa cái có 6 lá dài, 3 tâm bì. Quả nhẵn cứng xoan, có lông, to 2,5cm. C. colaniae Gagn. 3.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học: *.Theo những nghiên cứu của nước ngoài: Trong rễ cây vàng đắng C.fenestratum Colebr. có một số alcaloid thứ yếu như Berlambine, noroxyhydrastinine và dihydroberlambine [14]. Ngoài ra trong rễ cây C. fenestratum Colebr. có một alcaloid mới, đó là: 12, 13-dihydro-8-oxo-berberin (I), cũng có tác dụng tốt như berberin. Bên cạnh đó còn có oxyberberin, tetrahydroberberin ( canadin), sitosterol, và stigmasterol [15]. Các tác giả khác cũng cho rằng: Berberin được tổng hợp ở trong thân và rễ của cây vàng đắng C.fenestratum Colebr. [16]. *. Theo những nghiên cứu ở trong nước: Trong thân và rễ vàng đắng có chứa Berberin với tỉ lệ từ 1,5-3%. Ngoài ra còn có ít palmatin, jatrorrhizin [1]. Theo Đỗ Tất Lợi[10]: Trong vàng đắng có nhiều alcaloid dẫn xuất của isoquinolein, chủ yếu là Berberin, tỷ lệ Berberin chiếm từ 1,5-2%, có khi đến 3%. Võ Văn Chi[2] lại cho rằng: thành phần hoá học chủ yếu của vàng đắng là Berberin, saponin; thân chứa Berberin có tỷ lệ tới 3,5%. Ngoài ra còn có Ceryl alcohol, hentriacontane, sitosterol, acid palmitic và acid oleic, glycosid sitosterol, saponin và vài chất nhựa. ở nước ta trong thân và rễ cây vàng đắng có alcaloid berberin với tỉ lệ 1,5-3%. Nguyễn liêm [9] đã xác định thành phần hoá học của cây vàng đắng là Berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn phần, phần còn lại là palmatin, jatrorrhizin... Ngoài ra, trong luận án tiến sĩ [9], Nguyễn Liêm đã khảo sát kỹ cây vàng đắng về hàm lượng alcaloid protoberberin trong các bộ phận khác nhau của cây. Kết quả là ở thân cây già có 2-3%, cành nhỏ 1-1,5%, lá và quả 0,1-0,7%, vỏ thân trên 5%, và phần thân gỗ 0,85%. Điều kiện bảo quản có ảnh hưởng lớn đến chất lượng nguyên liệu. Độ ẩm cao làm giảm nhanh hàm lượng alcaloid và có thể mất hết hoặc giảm từ 3% xuống còn 0,13%. 3.3. Những nghiên cứu về ứng dụng cây vàng đắng trong y học: *. Theo Đỗ Tất Lợi (1999) [10]: -Nhân dân thường dùng thân và rễ cây làm thuốc hạ nhiệt, chữa sốt rét, chữa lỵ, ỉa chảy, đau mắt. Dùng dạng thuốc bột hay thuốc viên, ngày uống 4-6(g) -Dùng làm nguyên liệu để chiết xuất Berberin. Berberin hydroclorid dùng để chữa lỵ, ỉa chảy, đau mắt. Ngày uống 0,02-0,20 g dưới dạng thuốc viên. Người ta còn dùng để chữa bệnh về gan, mật, vàng da, ăn uống khó tiêu; hoặc pha dung dịch 0,5-1% dùng để nhỏ mắt, chữa mắt đau, hay để rửa mắt. *. Theo Võ Văn Chi [2]: Vàng đắng là nguồn nguyên liệu chiết xuất Berberin. Thường dùng chữa ỉa chảy, lỵ trực khuẩn, viêm ruột, vàng da, sốt, sốt rét, kém tiêu hoá. Ngày dùng 6-10g dạng thuốc sắc, thuốc bột hay viên. Hoặc dùng Berberin chlorid dạng viên nén 0,05 g, ngày 6-10 viên chia làm 2 lần. Dùng dung dịch 0,5-1% Berberin chlorid để chữa đau mắt. ở ấn độ người ta dùng rễ trị lỵ và dùng ngoài rửa mụn nhọt, vết thương. Nước sắc vỏ dùng chữa sốt gián cách, nước sắc thân dùng để trị rắn cắn. Ngoài ra Berberin rất đắng nên có tác dụng kháng virus và đã được dùng trong một số trường hợp nhiễm trùng như: Bệnh kiết lỵ do amip, bệnh Leishmania ngoài da và bệnh dịch tả. Dùng dưới dạng Berberin sulfat, hydrochlorid và dạng chlorid [18]. Các tác giả Nhật đã chứng minh: Berberin có nhiều trong các họ thực vật và có tác dụng ức chế một số ung thư. Theo Phan Quốc Kinh: Berberin là một alcaloid có tác dụng thông mật, co bóp tử cung, có tác dụng điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas, bệnh lỵ, tả, sốt rét và đau mắt. Gần đây đã phát hiện đươc tính chất chống ung thư của Berberin [7]. Karbovic và Bespalova đã cho biết[20]: Vàng đắng dùng làm thuốc cầm máu trong phụ khoa sau khi đẻ, viêm túi mật. Berberin sulfat làm giảm huyết áp, dùng trị viêm túi mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật. Dùng dạng viên nén 0,005g. Còn Maskovski thì lại cho rằng: Berberin sulfat dùng chữa viêm gan, viêm túi mật, sỏi mật, ngày 5-10mg, đợt điều trị từ 2-4 tuần. Ngoài ra còn có thể dùng dưới dạng cồn[22]. Berberin được chiết ra từ C.fenestratum có hiệu quả ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột ở gia súc như gà, lợn, chó...có thể trộn vào thức ăn hoặc nước uống [17]. Ngoài những ứng dụng trên, Berberin còn dùng để làm chất tạo màu trong thực phẩm và trong các loại đồ uống có cồn [18]. Vì những công dụng quan trọng như vậy và những công trình nghiên cứu cần phải bổ sung cho nên chúng tôi tiến hành đề tài trên. Phần III Thực nghiệm và kết quả. 1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. 1.1. Nguyên liệu: - Thân cây vàng đắng (Coscinium usitatum) được thu hoạch tại trung và hạ Lào (do anh Chu Văn thu hoạch). Đem về thái mỏng, sấy khô ở 600C, sau đó tán thành bột thô 1mm. - Thời gian lấy mẫu: tháng 4/2000 (trước mùa mưa) 1.2. Phương pháp nghiên cứu. Định lượng Berberin trong vàng đắng (theo DĐVNII- tập 3). 1.2.2. Khảo sát độ tan của các muối Berberin: - Dùng các dung dịch acid: acid sulfuric 2%, 4%, acid hydrochlorid 1% và acid acetic 1%. - Chiết bằng phương pháp chiết nguội. 1.2.3. Phương pháp chiết xuất Berberin trong cây vàng đắng: - Khảo sát nồng độ muối NaCl: tìm nồng độ NaCl để cho năng suất chiết xuất tối ưu. - Tìm nồng độ H2SO4 cho hiệu suất chiết xuất cao. - Tìm số lần chiết để đạt hiệu quả cao. - Tìm tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu để chiết đạt hiệu quả cao. - Các hoá chất, nguyên liệu đạt tiêu chuẩn DĐVN II, tập 3. 1.2.4. Xác định hàm lượng Berberin trong sản phẩm chiết được từ vàng đắng (bằng phương pháp HPLC): Tiến hành tại trung tâm giáo dục và phát triển sắc ký Việt Nam (EDC) trường Đại học Bách khoa Hà Nội. - Máy sắc ký HPLC: máy Hewlet Packard 1100 kèm 1 máy vi tính CR-4AX. - Cột zorbax RX-SIL - Pha động: Ethyl acetat: acid formic: methanol (15: 3: 2) - Bước sóng phát hiện: 280 nm - Lượng mẫu bơm: 20ml, bơm tay. - Tốc độ dòng: 1ml/ 1phút. - áp suất: 66 bar (kg/cm3). 1.2.5. Phương pháp tinh chế Berberin: - Theo phương pháp tinh chế Berberin chiết từ vỏ cây Hoàng bá của bộ môn Công nghiệp dược - Trường Đại học Dược Hà Nội. 1.2.6. Dự kiến xây dựng và mô tả quy trình chiết. 1.2.7. Khảo sát các quy trình chiết xuất Berberin cũ. So sánh với quy trình dự kiến. 1.2.8. Phương pháp xử lý số liệu [5]: Số liệu trong thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê ứng dụng trong y dược. Xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn (S) và khoảng tin cậy (m). - Giá trị trung bình: x = - Độ lệch chuẩn: S2 = - Khoảng tin cậy trung bình: Trong đó : S: độ lệch chuẩn n: số lần thí nghiệm f = n-1: số bậc tự do ta : Hằng số student với a = 0,05. So sánh 2 giá trị trung bình theo giả thiết trung bình cộng (test T) chấp nhận ở mức ý nghĩa của a (được quy ước là p) ở 0,05. Theo thống kê dược học: - Nếu a > 0.05: hai giá trị khác nhau không có ý nghĩa thống kê Nếu a < 0,05: hai giá trị khác nhau có ý nghĩa thống kê. 2- Kết quả thực nghiệm: 2.1. Định lượng Berberin trong vàng đắng: Theo dược điển Việt Nam II - tập 3 - trang 303. Nguyên tắc định lượng: theo phương pháp cân Tiến hành: Cân chính xác khoảng 10g bột dược liệu cho vào dụng cụ chiết soxhlet, chiết bằng methanol (TT) tới khi dịch chiết không còn màu vàng nhạt. Cất thu hồi methanol trên cách thuỷ cho đến khi còn lại khoảng 1/10 thể tích ban đầu. Thêm 30ml nước cất và 2 gam Magnesi oxyd (TT). Tiếp tục đun trên cách thuỷ ở nhiệt độ 60-700C khoảng 15 phút, thỉnh thoảng lắc bình. Lọc hút chân không. Rửa cắn bằng 50ml nước cất, chia làm nhiều lần cho đến khi dịch rửa không còn màu vàng. Gộp các nước rửa và dịch lọc vào một bình có dung tích 200ml. Thêm 5ml dung dịch Kali iodid 50% và khuấy đều để kết tuả Berberin iodat. Ly tâm, gạn bỏ dịch ở phía trên, tủa còn lại trong ống ly tâm, thêm 30ml dung dịch Kali iodid 2% và khuấy thật kỹ. Dùng 50ml nước cất chia ra làm nhiều lần, chuyển tủa vào bình nón có nút mài dung tích 250ml. Đun trên cách thuỷ, đồng thời lắc cho berberin iodat phân tán đều trong bình. Khi nhiệt độ trong bình lên khoảng 700C, thì vừa lắc vừa thêm aceton (TT) cho tan hết berberin iodat. Thêm tức khắc 3ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), lắc cho tới khi bắt đầu kết tủa aceton - berberin. Đậy bình, để yên chỗ mát qua đêm, lọc qua phễu xốp thuỷ tinh G3 (đường kính lỗ xốp 16-40mm) đã cân bì trước. Đo thể tích dịch lọc (V.ml). Rửa tủa bằng 10ml nước, rồi rửa 2 lần nữa, mỗi lần 5ml, sấy tủa ở 1050C trong 3h. Để nguội trong bình hút ẩm, cân tủa aceton - berberin. 1g tủa tương ứng với 898,2mg Berberin (C20H18NO5) 1ml dịch lọc tương ứng với 0,100mg Berberin. Hàm lượng phần trăm berberin trong dược liệu khô kiệt được tính theo công thức: a: Khối lượng tủa thu được (g) v: Thể tích dịch lọc thu được (ml) P: Khối lượng dược liệu khô kiệt (đã trừ độ ẩm) lấy để định lượng (g). Kết quả ở bảng 1: Bảng 1: Kết quả định lượng Berberin trong dược liệu n Đọ ẩm (%) mtủa (g) Vdịch lọc (ml) Hàm lượng Berberin (%) 1 2 3 8,04 8,12 8,09 0,3154 0,2679 0,2854 119 156 138 3,21 2,79 2,94 ồ 8,94 TB 2,98(%) 2.2. Khảo sát độ tan của các muối Berberin: Từ lâu nhiều tác giả đã đặt vấn đề nghiên cứu dùng dung môi thay thế cồn Ethylic để chiết Berberin trong vằng đắng như Nguyễn Liêm, Triệu Duy Điệt, Hồ Đắc Trinh ... Muốn vậy, chúng ta phải tìm độ tan của các muối Berbrin khác nhau hay nói cách khác là dùng các dung dịch acid khác nhau để chiết xuất Berberin từ dược liệu. Năm 1983 Hồ Đắc Trinh đã đưa ra hệ số hoà tan của các muối Berberin [12]: - B. iodat : 1: 2130 - B.clohydrat : 1: 500 - B. citrat : 1: 125 - B. photphat : 1: 15 - B. acetat : 1: 20 - B. sulfat : 1: 30 - B. sulfat acid : 1: 100 Như trên ta thấy hệ số hoà tan của các muối Berberin trong nước lớn nhất là Berberin photphat, Berberin acetat rồi đến Berberin sulfat trung tính. Acid photphoric và Acid acetic là loại acid khó kiếm đắt tiền nên không được sử dụng làm dung môi chiết xuất, còn acid sulfuric công nghiệp là loại hoá chất dễ mua, rẻ tiền nên việc sử dụng làm dung môi chiết xuất là thích hợp. Dựa trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành khảo sát độ tan của Berberin với các dung dịch acid sau: acid sulfuric 2%, 4%, acid clohydrid 1%, acid acetic 1%. Cân 5 gam dược liệu, chiết với 4 loại dung dịch trên theo phương pháp ngâm. Mỗi lần chiết với 40ml dung dịch acid (Tỉ lệ dung môi/dược liệu: 8/1), ngâm từ 2-3 tiếng, thỉnh thoảng lắc, chiết 3 lần. Gộp các dịch chiết lại. Cân 0,1g than hoạt cho vào bình đựng dịch chiết, lắc khoảng 10 phút. Lọc loại bỏ than hoạt. Lượng dịch lọc thu được là 100ml. Cân 10g NaCl cho vào mỗi bình, lắc cho tan hết, để lắng qua đêm.Lọc lấy tủa, đem sấy ở 600C đến khối lượng không đổi. Đem cân. Quy trình chiết theo sơ đồ 1. Bã 3 (bỏ) Dịch chiết 3 Sấy ở nhiệt độ 600C Cân Berberin clorid thô Dịch lọc 0,1g than hoạt Lọc Bã Dịch lọc Dịch chiết + dung dịch acid ngâm 2-3h, thỉnh thoảng lắc Bã 2 Dịch chiết 2 + dung dịch acid ngâm 2-3h, thỉnh thoảng lắc Bã 1 Dịch chiết 1 Bột dược liệu + dung dịch acid ngâm 2-3h, thỉnh thoảng lắc + NaCl, để tủa qua đêm Kết quả thu được ở bảng 2: Bảng 2: Khối lượng Berberin thu được khi chiết với 4 dung dịch acid khác nhau. Dung môi Số lần H2SO4 2% (g) H2SO4 4% (g) HCl 1% (g) CH3COOH 1% (g) 1 2 3 4 5 0,2629 0,2927 0,2768 0,2813 0,2750 0,1783 0,1826 0,1950 0,1736 0,2036 0,1344 0,1530 0,1486 0,1366 0,1467 0,3917 0,3719 0,3820 0,3898 0,3905 ồ 1,3887 0,9331 0,7187 1,9259 TB 0,2777 ± 0,0134 0,1866 ± 0,0153 0,1437 ± 0,0101 0,3852 ± 0,0126 Kết quả được tính theo phương pháp thống kê với mức ý nghĩa a = 0,05. Các kết quả được biễu diễn qua đồ thị 1. Đồ thị 1: Khảo sát độ tan của các muối Berberin. Qua bảng 2 và đồ thị 1 ta thấy nếu chiết với dung dịch acid acetic 1% sẽ cho kết quả cao nhất, sau đó là đến dung dịch acid sulfuric 2%. Nhưng do acid acetic là một acid dễ bay hơi, độc và đắt tiền, còn acid sulfuric rẻ, dễ mua, hầu như không bay hơi, do đó chúng tôi chọn acid sulfuric để chiết Berberin từ vàng đắng với nồng độ là 2%. 2.3. Chiết xuất Berberin từ cây vàng đắng: *Khảo sát nồng độ H2SO4: Với nồng độ acid H2SO4 nằm ở vùng 2% cho hiệu quả chiết xuất cao, nhưng chính xác ở vùng nào thì chưa rõ, do vậy chúng tôi tiếp tục thí nhgiệm, tìm được đỉnh của thí nghiệm. Vì thế chúng tôi tiến hành thí nghiệm như trên nhưng chiết với dung dịch acid sulfuric ở các nồng độ khác nhau và nồng độ muối NaCl là 32,4%. Nhưng qua quá trình thực nghiệm cho thấy: sau khi sấy khô vẫn còn lẫn rất nhiều muối NaCl bắt đầu từ nồng độ 20%. Do đó chúng tôi tiến hành rửa tủa với 5ml nước, đem sấy lại và cân. Do Berberin clorid tan ít trong nước nên trong quá trình rửa sẽ mất đi một lượng nhỏ Berberin clorid nhưng không đáng kể. Kết quả được ghi ở bảng 3. Bảng 3: Khối lượng Berberin thu được khi thay đổi nồng độ H2SO4 H2SO4(%) n 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 1 2 3 4 5 0,6032 0,6139 0,6003 0,6108 0,6083 0,6304 0,6318 0,6280 0,6311 0,6258 0,6645 0,6589 0,6603 0,6680 0,6586 0,7241 0,7281 0,7192 0,7301 0,7308 0,6844 0,6903 0,6859 0,6930 0,6873 ồ 3,0365 3,1471 3,3103 3,6323 3,4409 TB 0,6373 ± 0,0068 0,6294 ± 0,0030 0,6621 ± 0,0050 0,7265 ± 0,0059 0,6882 ± 0,0042 (Tiếp bảng 3): H2SO4(%) n 2,0 2,1 2,2 2,3 2,4 1 2 3 4 5 0,8800 0,8763 0,8789 0,8808 0,8732 0,8613 0,8645 0,8598 0,8601 0,8585 0,8676 0,8613 0,8571 0,8601 0,8549 0,7336 0,7348 0,7402 0,7299 0,7367 0,6968 0,6950 0,7003 0,7109 0,6980 ồ 4,3892 4,3042 4,3010 3,6752 3,5010 TB 0,8778 ± 0,0038 0,8608 ± 0,0028 0,8602 ± 0,0059 0,7350 ± 0,0046 0,7002 ± 0,0077 Từ kết quả trên đưa ra đồ thị sau: Vẽ đồ thị. Đồ thị II: Mối liên quan giữa khối lượng Berberin và nồng độ H2SO4. Nhìn vào đồ thị ta thấy nồng độ dung dịch sulfuric 2% và nồng độ muối 32,4% thì thu được kết quả cao nhất, sau đó là nồng độ acid H2SO4 2,1 - 2,2%, còn ở nồng độ H2SO4 1,5% thì thu được kết quả thấp nhất. Khảo sát nồng độ NaCl: Để tiện trong quá trình làm thực nghiệm, chúng tôi chọn nồng độ dung dịch H2SO4 là 2%. Chúng tôi tiến hành thay đổi hàm lượng NaCl, chiết với 40ml dung dịch H2SO4 2%, chiết 3 lần. Kết quả được ghi ở bảng 4. Bảng 4: Khối lượng Berberin thu được khi thay đổi nồng độ Natri clorua NaCl(g) n 10 15 20 25 26 1 2 3 4 5 0,2852 0,2782 0,2612 0,2518 0,2820 0,3596 0,3630 0,3542 0,3841 0,3456 0,4621 0,4632 0,4716 0,4526 0,4710 0,6343 0,6318 0,6081 0,6218 0,6280 0,6439 0,6430 0,6512 0,6632 0,6581 ồ 1,3584 1,0865 2,3205 3,1240 3,2594 TB 0,2717 ± 0,0179 0,3613 ±0,0178 0,4641 ± 0,0096 0,6248 ± 0,0130 0,6519 ± 0,0109 (tiếp Bảng 4): NaCl(g) n 27 28 29 30 31 1 2 3 4 5 0,6509 0,6532 0,6548 0,6601 0,6492 0,6723 0,6681 0,6703 0,6678 0,6715 0,7003 0,7089 0,7102 0,7058 0,7041 0,7517 0,7508 0,7489 0,7520 0,7498 0,7652 0,7701 0,7685 0,7718 0,7690 ồ 3,2682 3,3500 3,5293 3,7532 3,8446 TB 0,6536 ± 0,0052 0,6700 ± 0,0023 0,7059 ± 0,0048 0,7506 ± 0,0015 0,7689 ± 0,0029 (Tiếp bảng 4): NaCl(g) n 31,5 A1 31,6 A2 31,7 A3 31,8 A4 31,9 A5 1 2 3 4 5 0,7068 0,7013 0,7102 0,7078 0,7115 0,6699 0,6632 0,6708 0,6657 0,6715 0,6803 0,6815 0,6789 0,6776 0,6808 0,7173 0,7158 0,7192 0,7208 0,7165 0,7637 0,7648 0,7592 0,7719 0,7586 ồ 3,5376 3,3411 3,3991 3,5896 3,7882 TB 0,7075 ± 0,0049 0,6682 ± 0,0044 0,6798 ± 0,0017 0,7179 ± 0,0025 0,7576 ± 0,0107 (Tiếp bảng 4): NaCl n 32,0 A6 32,1 A7 32,2 A8 32,3 A9 32,4 A10 1 2 3 4 5 0,8815 0,8786 0,8802 0,8820 0,8791 0,8203 0,8169 0,8210 0,8187 0,8190 0,8943 0,8903 0,8918 0,8896 0,8908 0,9312 0,9308 0,9362 0,9296 0,9301 0,9339 0,9326 0,9348 0,9358 0,9316 ồ 4,4014 4,0959 4,4568 4,6579 4,6687 TB 0,8803 ± 0,0017 0,8192 ± 0,0029 0,8914 ± 0,0022 0,9316 ± 0,0033 0,9337 ± 0,0010 (Tiếp bảng 4): NaCl n 32,5 A11 32,6 A12 32,7 A13 32,8 A14 32,9 A15 1 2 3 4 5 0,7135 0,7102 0,7206 0,7186 0,7218 0,7073 0,7166 0,7054 0,7091 0,7125 0,6467 0,6474 0,6508 0,6623 0,6457 0,6491 0,6472 0,6389 0,6596 0,6460 0,6393 0,6308 0,6412 0,6381 0,6481 ồ 3,5847 3,5509 3,2529 3,2408 3,1975 TB 0,7169 ± 0,0061 0,7102 ± 0,0054 0,6506 ± 0,0085 0,6482 ± 0,0092 0,6395 ± 0,0077 Các số liệu trên được biểu diễn bằng đồ thị 3. Đồ thị 3: Mối liên quan giữa khối lượng Berberin và nồng độ NaCl. Nhận xét: Qua đồ thị 3 ta thấy Berberin clorid tủa nhiều nhất ở nồng độ là từ 32,2-> 32,4 (%). *Thay đổi số lần chiết: Sau khi tìm được nồng độ H2SO4, NaCl đạt năng suất chiết tối ưu chúng tôi tiến hành khảo sát số lần chiết xuất Berberin từ dược liệu. Chiết với dung dịch acid H2SO4 2,0%, V = 40ml, chiết 3 lần, lượng muối 32,4 (g). Tiến hành như quy trình trên. Kết quả ở bảng 5. Bảng 5. Khối lượng Berberin thu được khi thay đổi số lần chiết Số lần chiết n 2 3 4 5 1 2 3 4 5 0,6961 0,6813 0,6938 0,7048 0,7082 0,8443 0,8550 0,8476 0,8493 0,8513 0,8445 0,8490 0,8507 0,8473 0,8586 0,8668 0,8672 0,8591 0,8732 0,8701 ồ 3,4842 4,2475 4,2501 4,3364 TB 0,6968 ± 0,0130 0,8495 ± 0,0049 0,8500 ± 0,0066 0,8673 ± 0,0064 Từ kết quả trên chúng tôi đưa ra đồ thị sau: Đồ thị 4: Mối liên quan giữa khối lượng tủa berberin và số lần chiết. Với 2 lần chiết thì lượng dịch chiết khoảng 70-> 75ml mà lượng NaCl là 32,4(g) nên NaCl không thể tan hết. Sau khi sấy thì tủa Berberin clorid còn lẫn rất nhiều muối và muối berberin thu được sẽ không khô và rất bết. Mặt khác nếu chiết 2 lần thì không thể lấy hết hoạt chất có trong dược liệu. Với 4 lần chiết ta thu được 0,8500 (± 0,0066) (g), với 5 lần chiết được 0,8673 (± 0,0065) (g) so với chiết 3 lần (0,8495 ± 0,0049) thì có cao hơn nhưng không đáng kể. Mặt khác nếu chiết 4 lần, 5 lần thì sẽ tốn thời gian, tốn dung môi để chiết và lẫn nhiều tạp , xét về hiệu quả kinh tế thì không bù được nhân công và hoá chất, do đó ta chỉ chọn phương pháp chiết 3 lần. *Thay đổi tỷ lệ dung môi /dược liệu: Sau khi khảo sát được nồng độ H2SO4, nông độ muối NaCl và số lần chiết, để chiết được berberin từ vàng đắng đạt năng suất chiết cao, chúng tôi tiếp tục tiến hành thay đổi tỷ lệ dung môi/ dược liệu. Tiến hành tương tự như trên: dung dịch H2SO4 2%, m NaCl = 32,4 (g) chiết 3 lần. Kết quả ghi ở bảng 6. Bảng 6. Khối lượng Berberin thu được sau khi thay đổi tỷ lệ dung môi/ dược liệu. V H2SO4 2%(ml) n 30 40 50 60 1 2 3 4 5 0,8770 0,8560 0,8668 0,8713 0,8692 0,8150 0,8210 0,8089 0,7960 0,8132 0,6646 0,6543 0,6610 0,6702 0,6589 0,5266 0,5248 0,5132 0,5301 0,5272 ồ 4,3403 4,0541 3,3090 2,6220 TB 0,8681 ± 0,0062 0,8108 ± 0,0115 0,6618 ± 0,0074 0,5244 ± 0,0081 Đồ thị 5: Mối liên quan giữa khối lượng Berberin và tỷ lệ dung môi/dược liệu. Nếu chiết với 30ml dung dịch H2SO4 2% thì sau khi chiết xong lượng dịch chiết khoảng 70-80ml, tương tự như trường hợp chiết với 2 lần. Còn nếu chiết với 50, 60ml dung dịch H2SO4 2% thì muối sẽ tan hết nhưng lượng tủa Berberin clorid thu được không cao, lại tốn dung môi, tủa thu được không tơi, mà bết. Do đó ta chọn thể tích dung môi để chiết là: 40(ml)/5g nguyên liệu tức là tỉ lệ dung môi /dược liệu là 8/1. 2.4. Định lượng berberin trong sản phẩm chiết được từ vàng đắng: - Theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Cân 8,0mg berberin clorid đã chiết được pha trong dung môi động (ethyl acetat: acid formic: metanol= 13:5:2) ở trong bình định mức 100ml. Sau đó hút 1ml bằng pipet chính xác của dung dịch này pha vào trong bình định mức 100ml. Sau đó tiến hành đo. (xem phụ lục) Kết quả: C Berberin clorid = 6,7.10-5 (mg/ml) Từ đó tính được: Hàm lượng Berberin clorid trong sản phẩm chiết được là 83,75(%). 2.5. Phương pháp tinh chế: Hiện nay Berberin clorid được chiết ra dưới dạng thô, còn lẫn rất nhiều tạp chất, bán ra thị trường với giá rẻ, hiệu quả chữa bệnh lại không cao. Mặt khác Berberin clorid thô được bán cho Trung Quốc với giá rẻ, tại đó người ta tinh chế bán lại cho Việt Nam với giá rất cao. Vậy tại sao chúng ta có nguồn nguyên liệu dồi dào, dung môi dễ kiếm, sau khi chiết xong lại không tinh chế để đạt hiệu quả kinh tế cao. Chính vì thế chúng tôi đưa ra phương pháp tinh chế Berberin clorid sau khi chiết được Berberin thô từ vàng đắng như sau: Cân 1,5g berberin clorid thô hoà tan trong 30ml cồn tuyệt đối, đem đun nóng cho tan hết, thêm 0,1g than hoạt, đun sôi cách thuỷ khoảng 15 phút. Sau đó lọc nóng qua giấy lọc, loại bỏ than hoạt. Dịch lọc đem cô còn 1/4 thể tích, để kết tinh ở điều kiện bình thường, lọc lấy tinh thể. Tiếp tục tinh chế tiếp 2 lần nữa ta thu được berberin clorid tinh khiết. Kết quả: Lần 1: 0,5178 (g) Lần 2: 0,3806 (g) Lần 3: 0,2789 (g) Sau khi tinh chế chúng tôi tiến hành đem định lượng berberin trong sản phẩm theo DĐVN II - tập 3. Kết quả: hàm lượng berberin sau khi tinh chế là 98%. 2.6. Dự kiến xây dựng, mô tả quy trình chiết: Sau một quá trình thực nghiệm, chúng tôi dự kiến đưa ra quy trình chiết berberin từ vàng đắng như sau: Sơ đồ quy trình chiết: Bột dược liệu vàng đắng +Chiết với acid H2SO4 2,0-2,2% chiêt 3 lần (tỉ lệ dung môi/ dược liệu: 8/1) Ngâm 2-3h, thỉnh thoảng lắc,lọc. Chiết 3 lần Dịch chiết + Than hoạt, lắc khoảng 10’ lọc Dịch lọc Bã than hoạt + NaCl nồng độ 32,2->32,4% lắc cho tan hoàn toàn, Berberin clorid tủa để tủa qua đêm. Lọc Dịch lọc Berberin clorid thô + Cồn tuyệt đối, đun cách thuỷ đến tan hết, thêm than hoạt, đun thêm 15’. Lọc nóng. Bốc hơi còn khoảng 1/4 thể tích. Để yên, kết tinh thành tinh thể hình kim. Lọc lấy tinh thể. Berberin clorid Kết tinh lại 2-3 lần nữa Berberin clorid tinh khiết * Mô tả: Thân vàng đắng đem về thái mỏng, sấy khô ở nhiệt độ 600C, đem xay thành bột thô cỡ 0,1mm. Bột dược liệu đem chiết với acid sulfuric 2,2%, tỷ lệ dung môi/ dược liệu là 8/1, ngâm 2-3h, thỉnh thoảng lắc. Chiết 3 lần, gộp các dịch chiết, thêm than hoạt, lắc khoảng 10 phút sau đó lọc loại bỏ than hoạt. Từ số ml dịch lọc thu được tính xem cần khối lượng NaCl là bao nhiêu để dung dịch có nồng độ NaCl là 32,2 - 32,4%, lắc cho muối tan thấy xuất hiện tủa Berberin clorid, tiếp tục lắc cho muối tan hoàn toàn. Để yên qua đêm. Lọc lấy tủa được berberin clorid thô. Đem tinh chế: hoà tan Berberin clorid thô thu được ở trên trong cồn tuyệt đối, đun cách thuỷ để Berberin clorid tan hoàn toàn, thêm than hoạt đun thêm khoảng 15’ sau đó đem lọc nóng. Dịch lọc thu được đem bốc hơi còn khoảng 1/4 thể tích. Để yên ở điều kiện bình thường Berberin clorid sẽ kết tinh thành tinh thể hình kim màu vàng. Lọc loại bỏ nước mẹ lấy tinh thể. Tiếp tục kết tinh 2-3 lần nữa ta thu được Berberin clorid tinh khiết đem sấy khô ở nhiệt độ 50-600C. Kiểm tra sản phẩm, cân sản phẩm, tính hiệu suất. 2.7. Khảo sát các quy trình chiết xuất cũ. So sánh với quy trình chiết Berberin trên: Quy trình sản xuất Berberin clorid từ vỏ cây Hoàng Bá VN của BM công nghiệp dược: Bột dược liệu cho vào thiết bị, chiết với cồn 900. Đun nóng dung môi ở 790C, đun như thế trong 5,30 giờ kể từ khi cồn sôi. Sau đó đem tháo kiệt dịch chiết và đem thu hồi dung môi. Cất thu hồi dung môi: dịch chiết cho vào thiết bị cất thu hồi dung môi (còn khoảng1/3 thể tích ban đầu), dung môi thu hồi dùng để chiết mẻ sau. Dịch đậm đặc chuyển sang thiết bị kết tủa. Kết tủa Berberin clorid: thêm từ từ nước muối bão hoà (tỷ lệ 500g/1lít) vào dịch chiết cô đặc. Khuấy đều trong 30’. Để nguội ở điều kiện bình thường Berberin clorid sẽ kết tủa đặc. Lọc tủa bằng lọc chân không, nước cái thải bỏ. Rửa tủa ngay trên phễu lọc bằng cồn 900. Tinh chế: Hoà tan tủa Berberin clorid ở trên vào cồn, đun