Đồ án Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4-D lên mẫu cấy lá kim ngân (lonicera japonica thunb)

thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế. Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen: Auxin Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D,...). Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp RNA ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004). Cytokinin Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể. Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn. Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in vitro. Gibberellin Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3. Đây là các chất có cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây. Tác động này cũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các loài nho có chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn). GA3 được sử dụng trong môi trường dinh dưỡng kích thích vươn thân, đặc biệt trong trường hợp có hàm lượng cytokinin cao dẫn đến việc hình thành các cụm chồi có cấu trúc chặt (Economou, 1982). Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái; với mục đích này, nó được sử dụng để cho phép thu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…). Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, quan trọng nhất là trái cây, kém hơn là hoa và ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. Abscisic acid Acid abscisic (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuôi cấy phôi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium (K+), do tác động này nó đã ảnh hưởng trên sự đóng mở khí khổng của tế bào. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nó có thể bị ức chế hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi (như cây Epinard, Lolium temulentum). Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khó khăn. Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ. Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mô sẹo. Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô Khi tiến hành nuôi cấy mô khó khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống in vitro vô trùng. Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy. Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng thông thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Nhằm tăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần. Một số chất khử trùng thường sử dụng như: Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cần cẩn thận khi tiếp xúc. Sodium hypochlorite NaOCl: Có trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v). Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mô về sau. Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mô cấy từ 5 – 30 phút. Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút. Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch. Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô. Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này. Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: Những kháng sinh này có tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy. Như vậy, việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn nhất và nồng độ khử trùng thấp mà vẫn thu được mẫu cấy vô trùng là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng có thể phá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002). Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliaceae Chi: Lonicera L Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.1. Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb) Tên nước ngoài: Japanese honeysuckle (Anh), chèvrefeuille du Japon (Pháp). Tên khác: Nhẫn đông hoa (Tân Tu Bản Thảo) Ngân hoa (Ôn Bệnh Điều Biện) Kim Ngân Hoa, Kim Ngân Hoa Lộ, Mật Ngân Hoa, Ngân Hoa Thán, Tế Ngân Hoa, Thổ Ngân Hoa, Tỉnh Ngân Hoa (Đông Dược Học Thiết Yếu). Song Hoa (Trung Dược Tài Thủ Sách) Song Bào Hoa (Triết Giang Dân Gian Thảo Dược) Nhị Hoa (Thiểm Tây Trung Dược Chí) Nhị Bảo Hoa (Giang Tô Nghiệm Phương Thảo Dược Tuyển Biên) Kim Đằng Hoa (Hà Bắc Dược Tài) Đặc điểm quan trọng của cây Kim Ngân Hoa Kim Ngân Hoa có tên khoa học là Lonicera japonica Thunb, là loại dược liệu quan trọng thuộc họ Kim Ngân (Caprifoliaceae). Họ này gồm khoảng 800 lồi tập trung phổ biến ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu, với trung tâm đa dạng nằm ở miền đông Bắc Mỹ và miền đông châu Á, trong khi không có mặt tại khu vực châu Phi nhiệt đới và miền nam của châu lục này. Trong phân loại của hệ thống APG II năm 2003 Caprifoliaceae Leycesteria: 6 loài Lonicera: 180 loài Symphoricarpos: 17 loài Triosteum: 6 loài Tại Việt Nam, chi Lonicera L. có khoảng 10 loài, tất cả đều được dùng làm thuốc. Kim Ngân Hoa là cây bụi hay dây leo, ít thấy cây thân thảo có các đặc điểm hình thái sau: Thân có thể dài đến 9-10m, rỗng, có nhiều cành, lúc non màu xanh, khi già màu đỏ nâu, trên thân có những vạch chạy dọc. Lá mọc đối nhau, hình trứng dài. Phiến lá rộng 1,5 - 5cm, dài 38cm. Lá cây quanh năm xanh tươi, mùa rét không rụng. Hoa khi mới nở có màu trắng, nở ra lâu chuyển thành màu vàng. Hoa mọc ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 2 hoa mọc trên 1 cuống chung. Lá bắc giống như lá cây nhưng nhỏ hơn. Tràng hoa cánh hợp, dài từ 2,5 – 3,5 cm, chia làm 2 môi không đều. Môi rộng lại chia thành 4 thùy nhỏ, 5 nhụy đính ở họng tràng, mọc thò dài ra ngoài hoa. Quả hình cầu, màu đen. Mùa quả: tháng 6 – 8. Nụ hoa hình gậy, hơi cong queo, dài 25cm, đường kính đạt đến 5mm. Mặt ngoài màu vàng đến vàng nâu, phủ đầy lông ngắn. Mùi thơm nhẹ vị đắng. Mùa hoa: tháng 3 – 5. Theo Tài nguyên Cây Thuốc Việt Nam, ngoài Kim Ngân nói trên người ta còn dùng một số loại Kim Ngân sau: Kim Ngân Dại (Lonicera dasystyla Rehd): Lá hình trứng nhọn dài 28 cm, rộng 14 cm; Mép lá trên nguyên, lá gốc chia thùy; Phiến lá mỏng, mặt trên nhẵn, mặt dưới phủ lông mịn; Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 1,8 – 2,2 cm; Bầu nhẵn. Kim Ngân Lông (Lonicera cambodiana Pierre): Lá hình thuôn hơi dài, dài khoảng 5 – 12 cm, rộng 36 cm; Mép lá nguyên cuộn xuống dưới mặt lá; Phiến lá khá dày, mặt trên nhẵn, trừ cuối gân giữa, mặt dưới lông xù xì, nhất là ở gân lá; Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 56 cm; Bầu có nhiều lông. Lonicera confusa D C: Lá hình thuôn dài, dài 46 cm, rộng 1,5 – 3 cm; Mép lá nguyên; Phiến lá hơi dày, mặt trên nhẵn, mặt dưới có nhiều lông ngắn mịn; Hoa ống tràng thẳng hoặc hơi cong, dài 3 cm; Bầu có lông. Trong cây Kim Ngân Hoa có chứa các thành phần hóa học như sau Luteolin, Inositol, Tannin, saponin (Trung Dược Học). Hoa chứa Scolymozid (Lonicerin), 1 số Carotenoid (e. caroten, cryptoxanthin, auroxantin). Lá chứa Loganin (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Chlorogenic acid, Isochlorogenic acid (Lý Bá Đình, 1986). Ginnol, b-Sitosterol, Stigmasterol, b-Sitosterol-D-Glucoside, Stimasteryl-D-Glucoside (Sim và cộng sự, 1981). Bộ phận dùng làm thuốc thường là hoa mới chớm nở, lá và thân thì ít dùng hơn. Khi hoa sắp chớm nở thì thu hái; nên hái vào khoảng 9-10 giờ sáng (lúc này sương đã ráo), nhặt bỏ tạp chất, đem tãi mỏng phơi trong râm mát hoặc sấy nhẹ đến khô. Dây lá có thể thu hái quanh năm, thái nhỏ, phơi khô, bảo quản nơi khô ráo, tránh ẩm. Có tác dụng dược lý như sau: Tác dụng kháng khuẩn: nước sắc hoa Kim Ngân có tác dụng ức chế mạnh đối với tụ cầu khuẩn, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shiga. Nước sắc có tác dụng mạnh hơn các dạng bào chế khác (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp  khuyếch tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cận thương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả. Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng. Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Tác dụng trên đường huyết: Nước sắc hoa Kim Ngân cho uống có tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ ở chuột lang. Ở chuột lang uống Kim Ngân, số lượng và tính chất các dưỡng bào ở mạc treo ruột ít thay đổi. Lượng Histamin ở phổi chuột lang bị choáng phản vệ cao gấp rưỡi so với chuột lang bình thường và chuột lang uống Kim Ngân trước khi gây choáng (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam). Tác dụng kháng viêm: Làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm tăng tác dụng thực bào của bạch cầu (Trung Dược Học). Tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh: Cường độ bằng 1/6 của cà phê (Trung Dược Học). Tác dụng chống lao: Nước  sắc Kim Ngân Hoa in vitro có tác dụng chống Mycobacterium tuberculosis. Cho chuột uống nước sắc Kim Ngân hoa rồi cho chích vi khuẩn lao cho thấy ít thay đổi ở phổi hơn lô đối chứng (Trung Dược Học). Kháng Virus: Nước  sắc Kim Ngân Hoa  có thể làm giảm sức hoạt động của PR8 ở virus cúm nhưng không có tác dụng ở phôi gà con đã tiêm chủng (Trung Dược Học). Tác dụng chuyển hóa Lipid: Cho chuột béo phì dùng lượng lớn Cholesterol vỗ béo cho chuột đồng thời cho uống nước  sắc Kim Ngân Hoa, mức Cholesterol trong máu của chúng thấp hơn so với nhóm đối chứng (Trung Dược Học). Trong nhãn khoa: Nước  sắc Kim Ngân Hoa có hiệu quả trong điều trị cho những trường hợp bị kết mạc viêm mạn, giác mạc loét (Trung Dược Học). Làm hạ Cholesterol trong máu (Trung Dược Học). Tăng bài tiết dịch vị và mật (Trung Dược Học). Tăng tác dụng thu liễm do có chất Tanin (Sổ Tay Lâm Sàng Trung Dược). Có tác dụng lợi tiểu (Sổ Tay Lâm Sàng Trung Dược). Điều kiện trồng trọt Kim Ngân có nguồn gốc ở vùng Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản và Triều Tiên. Ở Việt Nam, Kim Ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung du phía bắc, như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây,… Kim Ngân thích nghi với nhiều loại đất và khí hậu khác nhau. Cây ưa sáng, thường mọc ở rừng thứ sinh, đồi cây bụi và rừng thưa núi đá vôi. Giống Cây Kim Ngân có 2 cách nhân giống: Nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính Nhân giống hữu tính: Dùng hạt để gieo, đầu tháng 11 thu hoạch quả chín, trong mỗi quả có 4-7 hạt. Đem hạt phơi khô, cất giữ đến cuối tháng 3 năm sau đem gieo. Bỏ hạt vào nước ấm 300C ngâm 21 giờ, vớt ra trộn với cát ẩm để thúc đẩy sự nảy mầm, khi hạt đã nứt vỏ trên 30% thì đem gieo. Nhân giống vô tính truyền thống Cho tới nay các nơi trồng Kim Ngân phần lớn dùng cách nhân giống vô tính truyền thống gồm hai cách: trồng bằng cắm hom và trồng bằng đánh tỉa chồi. + Cách nhân giống bằng đánh tỉa chồi: Đánh tỉa chồi thường phải chọn lúc trên chồi có nụ hoa đang nở. Vì thế nếu đánh chồi đi trồng thì sang năm cây mẹ sẽ không ra hoa và ảnh hưởng tới sản lượng. Do đó cách này thường ít khi được sử dụng + Cách trồng bằng hom: Cách trồng bằng hom là cắt lấy đoạn thân cây chưa ra hoa để mang đi trồng. Cách làm này đơn giản, cây ra hoa sớm nên bà con nông dân thích dùng cách nhân giống này. Lúc cắm hom tốt nhất là chọn ngày râm mát sau khi mưa, vì đất ẩm, độ ẩm không khí cao, cắm xong tỷ lệ cây sống cao.  Hom cần phải chọn ở cây khoẻ mạnh, cây đã một, hai tuổi, tỷ lệ sống cao nhất, sinh trưởng cũng nhanh. Trước khi cắm phải cuốc hốc rồi đặt hom vào hốc; ở dốc núi và đất bờ ruộng khoảng cách giữa các cây 1,3 – 1.7m chỗ đất đai khác nói chung hàng cây cách nhau là 1,7m, hốc sâu. Chăm sóc Vun xới đất: Vun xới đất có thể làm cho đất tơi xốp giữ cho gốc cây được vững chắc, làm cho rễ mọc nhiều, cây mọc nhiều cành. Hàng năm vào tiết trước kinh trập (khoảng ngày 5 tháng 3 hàng năm), tiến hành vun xới đất một lần và vào trước lúc bước vào mùa đông lạnh giá cuối thu vun gốc cây lần thứ hai. Làm cỏ: Mỗi năm có thể làm cỏ 3 - 5 lần. Khi làm cỏ nên chú ý trước hết bắt đầu từ ngoài vào gốc, về sau làm dần vào, lần trước xới đất sâu, các lần sau xới nông dần để tránh rễ bị tổn thương. Bón phân: Mỗi năm bón phân thúc một lần, bón vào lúc trước khi bước vào mùa đông hoặc trước khi cây đâm chồi nảy lộc đầu xuân. Những lần sau có thể bón vào sau lúc đâm chồi một lần và sau khi hái hết hoa bón một lần. Tưới nước: Thực tế cho thấy tưới nước có tác dụng nhất định đối với việc làm tăng sản lượng. Vì thế vào mùa xuân khô hạn nên tiến hành tưới nước cho cây Tỉa bớt cành: Tỉa ở những cây cành mọc quá dày. Khi tỉa phải nắm vững nguyên tắc tỉa từ trong ra ngoài, chia ra từng lớp. Việc tỉa cành này sẽ góp phần làm cho cây ra hoa nhiều hơn Phòng trừ sâu bệnh Kim Ngân rất ít sâu bệnh. Sâu hại Kim Ngân có rệp là nghiêm trọng nhất, loài này thường xuất hiện trước khi cây ra hoa. Để phòng rệp thì cuối đông đầu xuân phát và cuốc hết cỏ dại ở xung quanh gốc cây, đào xới cho đất tơi xốp ở xung quanh gốc cây là đã tiêu diệt được môi trường lây lan của rệp. Hạn chế dùng hoá chất trừ sâu bệnh vì nó sẽ làm cho hoa bị nhiễm độc không an toàn cho dược liệu sau này. Thu hoạch và chế biến:  Thu hoạch: Thời vụ thu hoạch Kim Ngân là từ cuối tháng 5 đến đầu tháng 6, từ lúc cây có nụ hoa đến lúc hoa nở trong khoảng 15 ngày. Thời gian hái hoa nên chọn lúc nụ hoa màu xanh trở thành màu trắng, lúc hoa bắt đầu nở là tốt nhất.Sau khi hái hoa về nên phơi và sấy khô ngay. Hoa sau khi đã phơi sấy khô nên chú ý bảo quản ở nơi thoáng gió, tránh nơi ẩm ướt. Những nghiên cứu chính về Kim Ngân Hoa Trong nước Lê Thị Diễm Hồng và cộng sự (2007) đã nghiên cứu tác dụng chống viêm mãn tính của saponin và flavonoid cây Kim Ngân kết hợp với α-chymotrypsin và α-amylase cho thấy saponin và flavonoid Kim Ngân có tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm mạn tính. Khi kết hợp saponin và flavonoid Kim Ngân với α-chymotrypsin và α-amylase, tác dụng tăng lên so với khi dùng đơn độc từng hoạt chất. Saponin và flavonoid Kim Ngân kết hợp với α-chymotrypsin và α-amylase có tác dụng làm giảm số lượng bạch cầu, không làm thay đổi nồng độ protein huyết thanh, làm tăng tỷ số A/G, làm giảm nồng độ seromucoid huyết thanh tương đương với của indomethacin ở lô đối chứng. Ngoài nước Nghiên cứu đầu tiên của sự phát sinh mô sẹo từ cây trên 6 tháng tuổi do D. Georges và cộng sự (1993) đã nghiên cứu thành công sự tái sinh cây Lonicera japonica "Hall's Prolific" từ nuôi cấy mô lá trưởng thành, thân và đốt rễ trên môi trường chứa 10,7 µM NAA và 2.7 µM BA, trong khi đó môi trường chứa 2,4-D lại làm chết nhanh chóng các mẫu cấy. Kết quả cho thấy sự tái sinh chồi đạt được tỷ lệ cao nhất trên môi trường chỉ chứa BA (4.4 từ 44.4 µM ). Sự phát sinh chồi dễ dàng và đã bén rễ trên môi trường dùng để nhân. Cây con đem ra trồng ngoài tự nhiên có tỷ lệ sống khá cao. Năm 2003, Suk Weon Kim và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tái sinh Lonicera japonica Thunb thông qua phát sinh phôi soma từ nuôi cấy phôi và nuôi cấy huyền phù tế bào. Từ phôi hợp tử trưởng thành đã tạo được mô sẹo với tần suất cao 46.7% trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 4.52 µM 2,4-D. Nuôi cấy huyền phù tế bào trên môi trường MS lỏng có bổ sung 4,52 µM 2,4-D đã phát sinh rất nhiều phôi soma rồi phát triển thành cây con với tần suất 68%. Cây con đem trồng ngoài tự nhiên có tỷ lệ sống rất cao. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2009 tại phòng thí nghiệm thực vật trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. HCM. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu là cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb) được trồng tại thành phố Hồ Chí Minh. Nguồn mẫu được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm là phần lá Kim Ngân được tuyển chọn trực tiếp từ các vườn trong thành phố Hồ Chí Minh. Các cây Kim Ngân được chọn phải khỏe, gốc cây to, thân leo tốt, có sức sống tốt, phần lá non, xanh, phiến lá to, không bị sâu bọ phá hoại. Mẫu lá sau khi cắt ra từ cây được cho vào hộp nhựa và tiến hành tuần tự theo các bước khử trùng mẫu như sau: Khử trùng sơ bộ Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Rửa kỹ từng mẫu lá trong nước rửa chén được pha loãng. Rửa lại bằng nước máy từ 4 – 5 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng mẫu bên trong tủ cấy Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. Tiến hành lắc khử trùng mẫu lá bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sung thêm vài giọt Tween 20 trong các khoảng thời gian khác nhau. Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần cho sạch hết chất khử trùng. Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm. Trang thiết bị và dụng cụ