Đồ án Butanol và ứng dụng của nó trong thực tiễn

ung dịch glucose, xylose, galactose và arabinose. Như vậy, arabinose dù không lên men được hoàn toàn nhưng lại cho hiệu suất sinh butanol cao nhất. Nồng độ tế bào vi sinh vật từ dịch lên men của glucose cũng cho kết quả cao nhất (2.50 g/L), điều này cho thấy glucose tạo môi trường thuận lợi nhất cho sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Để đánh giá tốc độ sử dụng glucose, xylose, galactose và arabinose trong quá trình lên men, Nasib Qureshi và các cộng sự đã thực hiện lên men hỗn hợp 15g mỗi loại đường trên pha trong 1L môi trường P2 ở 35oC. Kết quả được biểu diễn trên đồ thị hình 4: Hình 4: Quá trình lên men từ hỗn hợp chứa 15 g/L các loại đường glucose, xylose, galactose và arabinose sử dụng Clostridium acetobutylicum P260. (A): nồng độ sản phẩm của quá trình lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦) Acetone, (■): butanol, (▲): ethanol, (): acid acetic, (□): acid butylic. (B): nồng độ đường còn lại trong dịch lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦): glucose, (■): xylose, (▲): arabinose, (●): galactose. Hình 4B cho thấy, glucose được sử dụng nhanh hơn các loại đường còn lại, tất cả 15g glucose được sử dụng hết trong 35h lên men. Sự tiêu thụ arabinose ngừng lại sau 53h lên men và còn sót lại hơn 0.6 g/L. Quá trình sử dụng xylose và galactose diễn ra khá chậm, sau 70h lên men 8.7 g/L xylose và 9.4 g/L galactose vẫn chưa được sử dụng hết. Nồng độ ABE đạt được sau 70h lên men từ hỗn hợp đường trên là 16.25 g/L với nồng độ butanol đạt xấp xỉ 12 g/L, năng suất là 0.23g/L.h và hiệu suất là 0.40. Với những kết quả này cho thấy Clostridium acetobutylicum P260 tuy có thể sử dụng được nhiều loại đường khác nhau nhưng việc tiêu thụ các loại đường xylose và galactose diễn ra khá chậm, hàm lượng đường sót còn nhiều làm giảm nồng độ butanol. Phát triển các chủng mới từ loài Clostridium acetobutylicum có khả năng sử dụng đường xylose và galactose tương đương với glucose và arabinose sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong lên men. Một nghiên cứu khác trên loài Clostridium beijerincki, đã khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn khác nhau. Ezeji và cộng sự (2007) đã sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101 để lên men các loại đường glucose, xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose. Dịch lên men được chuẩn bị trong môi trường P2, 55g mỗi loại đường sẽ được pha vào 1L môi trường P2 ở 35oC không kiểm soát pH trong suốt quá trình lên men. Kết quả được biểu diễn trên hình 5: Hình 5: Nồng độ dung môi ABE đạt được khi lên men các đường đơn (55g/L: glucose, xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose) sử dụng Clostridium beijerinckii BA101. Quá trình lên men được thực hiện sau 60h thì Clostridium beijerinckii ngừng tạo sản phẩm. Nồng độ dung môi ABE đạt được cao nhất trong dịch lên men của cellobiose 19.1 g/L, đạt hiệu suất 0.35. Trong khi đó, dịch lên men từ glucose cho nồng độ dung môi cuối là 17.8 g/L đạt năng suất 0.30 g/L.h, nồng độ các acid trong dịch lên men chỉ còn 2.5 g/L. Năng suất tạo dung môi của các loại đường còn lại dao động trong khoảng 0.23-0.32 g/L.h. Galactose tiếp tục thể hiện là loại đường cho hiệu suất thấp khi được sử dụng để lên men ABE khi cho nồng độ dung môi thấp nhất. Nồng độ acid trong dịch lên men của galactose khá cao (>7 g/L), điều này cho thấy sự giảm khả năng hấp thu và chuyển hóa các acid của vi khuẩn trong dịch lên men của galactose, từ đó làm giảm nồng độ dung môi ABE cuối. Để đánh giá khả năng lên men hỗn hợp các loại đường khác nhau của Clostridium beijerinckii, Ezeji và cộng sự đã thực hiện quá trình lên men hỗn hợp đường gồm glucose, mannose, arabinose và xylose bổ sung vào dịch lên men với tỉ lệ tương ứng là 5:1:2:4. Sau 84h lên men (khi quá trình lên men dừng lại), nồng độ dung môi ABE đạt được là 17.9 g/L với nồng độ butanol đạt tối đa là 13.9 g/L ( hình 6). Mặc dù lượng butanol và tổng lượng ABE được tạo ra xấp xỉ như trong quá trình lên men từ đường glucose nhưng thời gian lên men lại dài hơn ( 84h so với 60h của glucose), do đó dẫn tới kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tương đối thấp (0.21 g/L.h). Hình 6: Lên men ABE từ hỗn hợp đường glucose, mannose, arabinose và xylose với tỉ lệ 5:1:2:4 bởi Clostridium beijerinckii BA101. (A): nồng độ các sản phẩm đạt được trong suốt quá trình lên men. (B): nồng độ các loại đường còn lại. HAc: acid acetic, HBu: acid butylic, HAB: tổng acid acetic vả acid butylic. Trong suốt quá trình lên men, nồng độ các acid trong dịch lên men tương đối thấp (hình 6A), điều này cho thấy quá trình lên men cho hiệu quả tốt. Tất cả các loại đường được sử dụng đồng thời trong suốt quá trình lên men mặc dù tốc độ sử dụng là khác nhau (hình 6B). Khả năng sử dụng đường glucose nhanh tiếp tục được thể hiện ở loài Clostridium beijerinckii, điều này cho thấy glucose là cơ chất ưa thích trong quá trình trao đổi chất của hầu hết các loài. Khi nồng độ glucose dần cạn kiệt, loại đường tiếp theo được Clostridium beijerinckii sử dụng nhiều hơn là xylose. Có thể sắp xếp thứ tự ưu tiên sử dụng các loại đường trong hỗn hợp của Clostridium beijerinckii theo thứ tự là glucose > xylose > arabinose > mannose. Kết thúc quá trình lên men, nồng độ các loại đường còn lại không được sử dụng trong dịch lên men là 0 g/L glucose, 4.0 g/L xylose, 3.3 g/L arabinose và 1.7 g/L mannose. Như vậy, sự khác nhau về khả năng sử dụng các loại đường giữa hai loài C.acetobutylicum và C.beijerincki đã được ghi nhận: sau glucose thì C.acetobutylicum thể hiện khả năng sử dụng đường arabinose tốt hơn nhiều so với đường xylose. Để so sánh rõ hơn về khả năng sử dụng đường glucose và đường pentose (xylose) trên loài Clostridium beijerinckii, N. Qureshi và cộng sự (2008) đã tiến hành hai thí nghiệm lên men. Chủng C.beijerinckii BA101 được sử dụng, hai môi trường lên men lần lượt chứa 25 g/L glucose và 25 g/L xylose. Sau 60 giờ lên men, tất cả đường glucose đã được sử dụng và tạo ra 9.9 ± 0.4 g/L ABE trong đó có 6.1 g/L butanol. Nồng độ acetone và ethanol lần lượt là 3.9 và 0.4 g/L. Năng suất đạt được là 0.17 ± 0.006 g/L.h và hiệu suất là 0.39 ± 0.025. Trong khi đó quá trình lên men từ đường xylose cho nồng độ ABE đạt 9.6 ± 0.4 g/L với năng suất trong 60 giờ lên men đạt 0.16 ± 0.01 g/L.h và hiệu suất là 0.39 ± 0.011. Hình 7: Nồng độ các sản phẩm thu được trong quá trình lên men ABE từ chủng C.beijerinckii BA101, (A): Glucose, (B): Xylose Kết quả lên men đã cho thấy nồng độ ABE thu được từ glucose và xylose xấp xỉ bằng nhau, N. Qureshi và cộng sự đã kết luận khả năng sử dụng đường xylose của C.beijerinckii là tương đương so với glucose. Những kết quả trên cho thấy các loài Clostridium đều có khả năng sử dụng đa dạng nhiều loại đường khác nhau (hexose và pentose) đặc biệt phát triển rất tốt trên cơ chất là đường glucose. Trên môi trường là hỗn hợp nhiều loại đường khác nhau, Clostridium cũng cho thấy khả năng lên men khá tốt. Điều này chứng tỏ việc sử dụng các nguồn phế phẩm nông nghiệp có chứa sinh khối lignocellulosic (biomass) làm cơ chất cho quá trình lên men ABE là khả thi. Khi thủy phân các nguồn sinh khối chứa lignocellulosic sẽ cho ra hỗn hợp nhiều loại đường, việc thủy phân có thể tách riêng hoặc thực hiện đồng thời với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên các nguồn cơ chất khác nhau với mục đích làm giảm chi phí cho quá trình lên men tổng hợp butanol. Việc xử lý các nguồn biomass trước khi sử dụng làm dịch lên men là khá phức tạp, có thể ảnh hưởng và làm giảm nồng độ dung môi đạt được. Vì vậy, việc tối ưu hóa các điều kiện lên men với từng loại cơ chất để đạt hiệu quả cao nhất là tương đối phức tạp. b. Lên men từ bột sắn (cassava flour CF) Trong một nghiên cứu của Leonardo và cộng sự (2010), bột sắn được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101. Bột sắn sẽ được xử lý bằng hai phương pháp sử dụng enzyme (a-amylase và b-glucoamylase)và acid (HCl). Bột sắn được pha vào nước cất thành dung dịch huyền phù ở các nồng độ 60, 80 g/L. Với phương pháp xử lý bằng acid (CT: acid chemical treatment), dung dịch HCl 1M được bổ sung vào dung dịch CF đến khi pH đạt 1.5. Quá trình thủy phân thực hiện trong 2h ở nhiệt độ 121oC, sau đó được làm lạnh đến 4oC để ngừng quá trình thủy phân. Với phương pháp xử lý bằng enzyme (E1), CaCl2 (1g/L) được bổ sung vào dung dịch huyền phù để đạt 40 mgCa/L, điều chỉnh pH đến 6.5 bằng NaOH 1M. a-amylase được bổ sung vào ( 1ml/kg bột) và thực hiện quá trình hồ hóa ở 93oC trong 2h. Sau đó, bổ sung b-glucoamylase (1.7 ml/kg bột) thực hiện quá trình dịch hóa ở 60oC, tốc độ khuấy đảo 150 rpm trong 1h. Cuối cùng hỗn hợp được đưa về 40oC giữ trong 39h trước khi lên men. Quá trình lên men được thực hiện ở các nhiệt độ 35 và 40oC với nồng độ CF là 60 và 80 g/L. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 5: Bảng 5: Kết quả lên men ABE của chủng Clostridium beijerinckii BA101 trên cơ chất bột sắn ở các điều kiện khác nhau. Nhiệt độ (oC) Nồng độ CF (g/L) Phương pháp thủy phân Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Acetone (g/L) Tổng lượng dung môi (g/L) 35 60 CT 21.87 14.58 0.01 36.46 40 60 CT 26.73 1.70 7.19 35.62 35 80 CT 27.54 20.25 0.01 47.80 40 80 CT 17.82 6.32 0.01 24.15 35 60 ET 12.53 2.75 0.01 13.29 40 60 ET 31.59 10.21 2.69 44.49 35 80 ET 19.44 8.91 0.01 28.36 40 80 ET 22.68 2.84 8.14 33.66 35 60 CT 19.44 1.54 6.87 27.85 40 60 CT 25.92 3.56 11.85 41.33 35 80 CT 20.25 9.72 8.69 38.66 40 80 CT 18.63 0.01 5.14 23.78 35 60 ET 16.20 12.15 0.01 28.36 40 60 ET 24.30 7.70 0.01 32.01 35 80 ET 11.34 0.01 8.69 20.04 40 80 ET 18.63 0.01 7.51 26.15 Trung bình 20.81 6.39 4.18 31.38 Như vậy, với kết quả thu được từ bảng 5, nồng độ butanol đạt được cao nhất là 31.59 g/L ứng với quá trình lên men ở 40oC sử dụng nồng độ CF là 60g/L xử lý bằng enzyme. Nồng độ butanol đạt được thấp nhất là 11.34 g/L khi lên men ở 25oC, nồng độ CF là 80 g/L xử lý bằng enzyme. Kết quả này chứng tỏ, quá trình xử lý cơ chất trước khi lên men cũng như nồng độ cơ chất ban đầu sử dụng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp butanol của vi khuẩn. Khi thủy phân bằng phương pháp acid, các tạp chất lẫn trong dung dịch HCl có thể gây ức chế khả năng hoạt động của vi khuẩn làm giảm hiệu suất tổng hợp butanol. Nồng độ butanol trung bình đạt 20.81 g/L sau 96h lên men, tốc độ sinh tổng hợp butanol tương ứng là 0.22 g/L.h. c. Lên men từ Xơ bắp ( corn fiber) Xơ bắp là phụ phẩm từ trái bắp, không có giá trị về mặt kinh tế được sử dụng làm thức ăn gia súc. Tuy nhiên trong xơ bắp chứa tới 60-70 % các thành phần carbohydrate, 30% trong số đó là arabinoxylan hoặc hemicellulose. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng xơ bắp như là nguồn cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Trong nghiên cứu của N. Qureshi và cộng sự (2008) sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101, xơ bắp trước khi lên men được thủy phân bằng hai phương pháp sử dụng enzyme và acid sulfuric. Các tác giả đã so sánh khả năng tổng hợp butanol từ dịch thủy phân của hai phương pháp trên. Kết quả thu được từ quá trình lên men dịch thủy phân bằng acid sulfuric ( nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 29.8 g/L; glucose chiếm 4.3 g/L) cho bởi bảng sau: Bảng 6: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ xơ bắp được thủy phân bằng acid sulfuric. Thời gian (h) Nồng độ tế bào (g/L) Acetone (g/L) Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Tổng ABE (g/L) 0 0.02 - - - - 24 0.58 0.0 0.1 0.1 0.2 54 0.75 0.2 1.4 0.1 1.7 72 0.60 0.1 1.0 0.2 1.3 96 0.31 0.1 0.9 0.2 1.2 Nồng độ tế bào đạt được tối đa trong dịch lên men là 0.75 g/L ứng với lượng ABE đạt được là 1.7 ± 0.2 g/L. Kết quả trên cho thấy vi khuẩn bị ức chế mạnh bởi một số sản phẩm của quá trình thủy phân làm tế bào không thể phát triển. Việc sử dụng acid để thủy phân đã tạo ra nhiều yếu tố gây ức chế lên canh trường. Trong khi đó, quá trình lên men từ dịch thủy phân xơ bắp được thủy phân bằng enzyme cho kết quả tốt hơn. Nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 25 g/L. Sau 72 giờ lên men 24.6 g/L đường đã được sử dụng. Hình 8: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ dịch thủy phân xơ bắp bằng enzyme. Tổng nồng độ ABE đạt được là 8.6 ± 1.0 g/L trong đó butanol đạt 6.5 g/L tương ứng với tốc độ sinh tổng hợp 0.1 ± 0.011 g/L.h và hiệu suất 0.35. Kết quả đã cho thấy phương pháp thủy phân xơ bắp bằng enzyme đã hạn chế các chất ức chế so với phương pháp thủy phân bằng acid. Nồng độ tế bào đạt được trong dịch lên men là 1.65 ± 0.40 g/L. Hàm lượng đường sót chỉ còn 0.4 g/L cho thấy sơ bắp được thủy phân bằng enzyme là nguồn cơ chất tiềm năng cho sản xuất butanol ở quy mô lớn. Trong một nghiên cứu khác của Xin-Liang Li và cộng sự (2006), xylan lấy từ xơ bắp ( corn fiber xylan) được tiến hành đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chủng C.acetobutylicum P260. Mục đích của nghiên cứu là xác định khả năng tự thủy phân các hợp chất carbohydrate phức tạp thành đường đơn của C.acetobutylicum.Thí nghiện tiến hành với môi trường ban đầu chứa 60 g xylan trong 1 lít môi trường P2, lên men ở 35oC. Tuy nhiên, quá trình lên men đã không diễn ra, canh trường vi sinh vật không phát triển và không tổng hợp được bất cứ dung môi nào. Điều này chứng tỏ C.acetobutylicum không có khả năng thủy phân xylan. Xin-Liang Li và cộng sự (2006) tiếp tục quá trình lên men như trên có bổ sung 0.5 ml enzyme xylanase hỗ trợ cho quá trình thủy phân. Kết quả cho thấy vẫn không có sự phát triển của tế bào trong canh trường, điều này được giải thích là do enzyme thủy phân xylan không đủ nhanh và đủ lớn để vi sinh vật sử dụng. Thí nghiệm tiếp theo, 5 g/L xylose được bổ sung vào môi trường trên nhằm cung cấp cơ chất cho vi sinh vật có thể sống sót trong quá trình xylanase thủy phân xylan trong môi trường. Kết quả là vi khuẩn đã phát triển và tổng hợp được 9.6 g/L ABE (hình 9). Hình 9: Nồng độ các sản phẩm đạt được trong quá trình lên men ABE chứa 60 g/L xylan + 5g xylose + 0.5ml xylanase. c. Lên men từ dịch bo bo ( sweet sorghum juice) A.Areesirisuk và cộng sự (2010) đã sử dụng dịch đường lấy từ việc thủy phân thân cây bo bo làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Hạt và thân cây của bo bo có thể được sử dụng để sản xuất đường, ethanol, syrup, nhiên liệu, giấy…(Rajvanshi và Nimbkar, 2005). Mục đích nghiên cứu của A.Areesirisuk và cộng sự (2010) là khảo sát khả năng phát triển và tổng hợp butanol của C.beijerinckii JCM 1390 từ dịch bo bo mà không cần bổ sung thêm các nguồn dinh dưỡng từ đường đơn khác. Dịch thủy phân từ thân cây bo bo sẽ được ly tâm, bổ sung vào môi trường P2 điều chỉnh pH về 6.0 bằng dung dịch NaOH 1.0M. Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị lên men yếm khí 2-L chứa 1500ml dịch lên men ở 37oC. Các thông số trong suốt quá trình lên men được biểu diễn trên đồ thị hình 10: Hình 10: Các thông số của quá trình lên men từ dịch bo bo do chủng C.beijerinckii JCM 1390 thực hiện. Từ đồ thị có thể thấy sau 60 giờ lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi khuẩn bắt đầu giảm dần, sau 80 giờ thì quá trình lên men gần như không còn xảy ra. pH trong suốt quá trình lên men có sự thay đổi không đáng kể, điều này chứng tỏ các acid sinh ra trong giai đoạn acidogenesis đã được vi khuẩn chuyển hóa thành dung môi. Nồng độ các sản phẩm đạt được sau quá trình lên men được biểu diễn trên hình 11: Hình 11: Nồng độ dung môi trong suốt quá trình lên men dịch bo bo của C.beijerinckii JCM 1390 Như vậy nồng độ butanol đạt được sau 60 giờ lên men là 8.0 g/L và tối đa là 8.8 g/L sau 120 giờ lên men, hiệu suất đạt 0.30. Như vậy so với kết quả từ nghiên cứu của N. Qureshi và cộng sự (2008) trên cơ chất là dịch thủy phân xơ bắp ( nồng độ butanol đạt được sau 60 giờ lên men là 6.5 g/L, hiệu suất 0.35), dịch bo bo có khả năng cho nồng độ butanol cao hơn. Tuy nhiên, hàm lượng đường sót trong dịch sau lên men của bo bo lại khá cao làm cho hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm giảm đáng kể. Tốc độ tổng hợp dung môi chỉ đạt 0.09 g/L.h. d. Lên men từ bã nho (grape pomace) Bã nho là một phế phẩm trong các ngành công nghiệp sản xuất rượu vang, cứ 100 kg nho sẽ cho khoảng 18-20 kg bã nho sau quá trình ép lấy dịch. Ngoài các ứng dụng trong thực tiễn khá phổ biến để sản xuất acid tartaric, trích ly chất màu anthocyan, làm thức ăn gia súc… bã nho còn chứa một lượng đường sót khá lớn 7.81-10.81 % w/w (Hang và Woodams 2008) có thể được sử dụng làm cơ chất cho các quá trình lên men từ vi sinh vật. Laurent Law (2010) đã tiến hành nghiên cứu khả năng lên men tổng hợp butanol từ bã nho lấy từ giống nho trắng Chardonnay sử dụng giống vi khuẩn Clostridium acetobutylicum P262. Để chuẩn bị cho dịch lên men, bã nho sẽ được pha vào nước cất theo tỷ lệ 12.5% w/v, bổ sung dung dịch đệm kali phosphate 1M. Toàn bộ môi trường sẽ được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Quá trình lên men sẽ được thực hiện ở 35oC, pH môi trường ban đầu 5.5. Hình 12: Nồng độ đường và nồng độ tế bào trong quá trình lên men từ bã nho sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P262 Có thể thấy trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi sinh vật còn tương đối thấp, nồng độ tế bào tăng không đáng kể. Có thể đây là quá trình thích nghi với môi trường của vi khuẩn, canh trường chưa bước vào giai đoạn sinh trưởng. Tuy nhiên, trong 48 giờ lên men tiếp theo, tốc độ sử dụng cơ chất của vi khuẩn tăng rất nhanh. Sau 72 giờ lên men, 97.6% hàm lượng đường trong dịch lên men đã được sử dụng, nồng độ tế bào tăng đều trong 72 giờ lên men và đạt nồng độ 0.81 g/L. Như vậy, Clostridium acetobutylicum P262 phát triển khá tốt trên môi trường lên men từ bã nho, nồng độ đường sót còn lại khá thấp ( 2.4%). Nồng độ dung môi đạt được trong quá trình lên men được biểu diễn trên hình 13: Hình 13: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men bã nho sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P262 Tốc độ sinh tổng hợp các acid acetic và butylic trong 24 giờ đầu lên men tăng khá cao 0.59 g/L.h, chứng tỏ canh trường đang trong giai đoạn acidogenesis chủ yếu tổng hợp acid. Sau đó nồng độ các acid giảm nhanh trong 48 giờ tiếp theo, nghĩa là canh trường đã bước sang giai đoạn solventogenesis, vi khuẩn bắt đầu sử dụng các acid sinh ra trong giai đoạn trước để tổng hợp nên dung môi. Nồng độ các dung môi đạt được trong suốt quá trình lên men được tóm tắt trong bảng sau: Bảng 7: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men từ bã nho Thời gian lên men (h) pH Acetone (g/L) Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Acid Acetic (g/L) Acid butylic (g/L) Nồng độ tế bào (g/L) 0 5.49 0 0 0 0 0 0.59 24 5.06 0 0.53 1.55 6.13 3.39 0.65 48 4.67 0.87 2.99 0.93 5.7 2.98 0.80 72 4.75 2.83 5.96 0.51 3.03 2.49 0.81 Sau 24 giờ lên men, acetone và butanol mới bắt đầu được hình thành và đạt nồng độ lần lượt là 2.83 và 5.96 g/L sau 72 giờ lên men. Như vậy tỷ lệ nồng độ các dung môi là 6:3:1 (butanol:acetone:ethanol), kết quả này tương tự với kết quả đạt được trong nghiên cứu của Jones và Woods (1986). Tổng nồng độ dung môi đạt được là 9.08 g/L, hiệu suất và tốc độ tổng hợp sản phẩm lần lượt là 0.36 g/g và 0.16 g/L.h. Hiệu suất đạt được khá cao gần bằng với hiệu suất đạt được khi lên men bằng đường glucose ( 0.40 g/g) theo Nasib Qureshi và các cộng sự (2006). Kết quả này đã chứng minh bã nho là một nguồn cơ chất đầy tiềm năng cho quá trình lên men sản xuất butanol. Bảng 8: Bảng tổng hợp một số nghiên cứu thực hiện trên các chất mang khác có nguồn gốc tự nhiên Cơ chất Chủng vi sinh vật Nồng độ ABE (g/L) Hiệu suất (g/g) Năng suất (g/L.h) Thực hiện Gỗ thông C. acetobutylicum P262 17.6 0.36 0.73 Parekh et al.(1988) Cây hoàn diệp ( Aspen) C. acetobutylicum P262 20.1–24.6 0.31–0.34 0.84–1.03 Parekh et al.(1988) Xác mía C. saccharoperbutylacetonicum ATCC 27022 18.1 0.33 0.30 Soni et al. (1982) Vỏ lúa gạo C. saccharoperbutylacetonicum ATCC 27022 13.0 0.28 0.15 Soni et al. (1982) Vỏ lúa mì C. acetobutylicum IFP 921 17.7 0.18 0.47 Marchalet al. (1984) Rơm từ thân bắp C. acetobutylicum P262 25.8 0.34 1.08 Parekh et al.(1988) 4.2.2. Điều kiện lên men a. pH pH ban đầu của môi trường lên men phụ thuộc nhiều vào pH tối thích của chủng vi sinh vật sử dụng để tổng hợp butanol. Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách điều chỉnh về pH tối thích và không kiểm soát trong suốt quá trình lên men. Các loài Clostridium có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH từ 5.0-6.5. Với mỗi loài nhất định cần tiến hành lên men ở một giá trị pH ban đầu xác định nhằm đạt được hiệu suất tổng hợp cao nhất. Trong nghiên cứu của Shamsudin và cộng sự (2006), loài C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4 được sử dụng để lên men tạo butanol. Thí nghiệm tiến hành ở các giá trị pH ban đầu khác nhau của môi trường lên men nhằm xác định giá trị pH tối ưu của loài này. Môi trường sử dụng là môi trường TYA chứa 40 g glucose, pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1M. Kết quả đạt được trên hình 14: Hình 14: Ảnh hưởng của pH lên nồng độ dung môi (♦), hiệu suất (◊) và tốc độ sinh tổng hợp (○) butanol của chủng C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4. Từ kết quả trên có thể thấy rõ pH tối thích của loài C.Saccharoperbutylacetonicum trong quá trình lên men là 6.0. Trong khi tại pH là 5.5 lại cho hiệu suất tổng hợp thấp nhất. Trong nghiên cứu của Madihah (2002) cũng cho kết quả tương tự khi pH ban đầu của dịch lên men từ loài C.Saccharoperbutylacetonicum cho hiệu suất cao nhất. Để so sánh các quá trình lên men được thực hiện bằng cách chỉ điều chỉnh pH ban đầu một lần và duy trì pH ổn định trong suốt quá trình lên men. George và Chen (1983) đã sử dụng chủng C.beijerinckii VPI 13436 tiến hành lên men trên môi trường TYS. Thí nghiệm được tiến hành ở pH ban đầu là 6.8, sử dụng dung dịch KOH 8N để điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men. Hình 15: Khả năng tổng hợp dung môi của C.beijerinckii VPI 13436 trên môi trường TYS không kiểm soát pH và duy trì pH ở 6.8. butanol (▲), acetate (○), butyrate (), mật độ tế bào (●) Trong môi trường không kiểm soát pH, vi sinh vật bắt đầu sinh tổng hợp dung môi sau 5 giờ lên men khi pH môi trường đạt 4.5-4.6, nồng độ butanol bắt đầu tăng nhanh sau 10 giờ lên men và đạt tối đa 100 đến 120 mM butanol sau 120 giờ lên men ( không hiển thị trên hình). Trong khi đó ở môi trường được duy trì pH ở 6.8, có thể tổng hợp dung môi sau 2 giờ lên men và nồng độ butanol đạt tối đa là 90 mM sau 120 giờ lên men. Việc kiểm soát pH của môi trường lên men đã làm giảm khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn, trong khi đó nồng độ của các acid (acetate) trong dịch lên men lại tăng liên tục. Như vậy việc duy trì pH cố định trong môi trường lên men không có nhiều ý nghĩa, do đó hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện ở các giá trị pH tối thích ban đầu của vi sinh vật và không điều chỉnh trong suốt quá trình lên men. b. Nhiệt độ Tương tự như điều kiện về pH, giá trị nhiệt độ lên men sẽ phục thuộc nhiều vào chủng vi sinh vất sử dụng. Tùy vào từng loài có nhiệt độ tối thích khác nhau mà ta sẽ lựa chọn nhiệt độ lên men thích hợp. Khoảng nhệt độ tối thích của các loài Clostridium nằm trong vùng từ 30-40oC, nhiều thí nghiệm trên các loài Clostridium acetobutylicum và C. beijerinckii đều thực hiện ở nhiệt độ trung bình là 35oC. Shamsudin và cộng sự (2006) nghiên cứu trên loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại cho thấy khả năng tổng hợp butanol cao nhất ở 30oC. Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men tổng hợp dung môi của C.Saccharoperbutylacetonicum. Ở 30oC, khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn đạt cao nhất (15g/L). Trong khi đó, ở 40oC hầu như vi khuẩn đều bị ức chế làm mất khả năng tổng hợp dung môi. Như vậy có thể thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men tổng hợp dung môi, cần kiểm soát và duy trì ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình lên men. c. Nồng độ các muối trong môi trường tổng hợp Ngoài các đường pentose và hexose là cơ chất chính được Clostridium sử dụng để lên men tổng hợp butanol, môi trường lên men còn chứa nhiều loại muối khoáng (Fe2+, Mn2+, K+, Mg2+, NH4+..) giúp cho vi sinh vật có thể sinh trưởng và tạo sản phẩm. Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ các muối ban đầu trong môi trường lên men có thể ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm của vi khuẩn. F. Monot và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các hợp chất của môi trường tổng hợp đến quá trình lên men ABE sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lần lượt thay đổi nồng độ ban đầu của các muối MgSO4, FeSO4, KCl, ammonium acetate trong môi trường tổng hợp. KCl: Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối KCl, các thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ KCl ban đầu là 0, 3, 6, 9, 15, 30, 60, 120, 360, 600 mg/l và 1.2, 2, 4, 8, 12 g/l. Kết quả nồng độ dung môi thu được trong các thí nghiệm cho bởi bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng của nồng độ KCl ban đầu tới quá trình lên men ABE. KCl Nồng độ (mg/l) Nồng độ tế bào* Butanol (g/l) Acetone (g/l) Ethanol (g/l) Tổng ABE (g/l) 0 0.8 0 0 0 0 3 0.59 0.48 - - 0.48 6 0.72 0.78 - - 0.78 9 0.88 4.22 1.39 0.23 5.84 15 1.28 4.26 1.28 0.25 5.79 30 1.88 4.26 1.05 0.28 5