Đồ án Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men

ool), benzaldehyde, các hợp chất phenol như eugenol ; trong khi đó đối với các cấu tử thuộc nhóm ester (ethyl acetat, ethyl caproat), hydrocacbon và pyridin thì khả năng tách kém hơn. Các yếu tố ảnh hưởng trong SPME [35,36,57,70] Pha tĩnh Chất mang sử dụng làm chất hấp phụ trong cột SPME bao gồm một hoặc hai loại polymer (như PDMS, PA, carboxen-PDMS, PDMS-polydivinylbenzen, carbowax- DVB). Nguyên tắc làm giàu cấu tử như đã trình bày ở trên, đó là nguyên tắc hấp phụ. Bề dày lớp chất mang PDMS thường là 7m, 30m, 100m ; PA là 85m; carboxen-PDMS là 75m; PDMS-DVB là 65m. Yêu cầu của pha tĩnh: Độ phân cực của pha tĩnh phải gần với độ phân cực của cấu tử cần tách. Pha tĩnh phải chịu được các điều kiện nhiệt độ cao, pH, muối... PDMS là một trong các pha tĩnh không phân cực chịu được các điều kiện khắc nghiệt nhất và cột PDMS có khả năng hấp phụ và giải hấp phụ nhiều lần. Khi cần phân tích các cấu tử có độ phân cực thấp thì có thể sử dụng cột PA. Bề dày của pha tĩnh của các loại pha tĩnh được đưa ra như trên là do tính toán dựa vào yêu cầu về độ nhạy và tốc độ hấp phụ: Bề dày 100m thường được sử dụng khi cần độ nhạy cao và ít quan tâm đến thời gian, Bề dày 7m sử dụng khi cần thời gian ngắn và không cần quá nhạy (trường hợp nồng độ cấu tử cần phân tích đủ cao). Phương pháp tách chiết Phương pháp Headspace (HS) thường được khuyến cáo sử dụng khi có thể vì khi đó sẽ làm giảm tải trọng của cột (không phải hấp thụ những chất cao phân tử như protein), vì vậy mà tuổi thọ của cột cũng cao hơn. Mặt khác, phương pháp HS cũng tránh được tính thuận nghịch trong hấp phụ nên tính chính xác cũng cao hơn. Các cấu tử có phân tử khối dưới 200, hay có cấu trúc không có những nhóm tạo liên kết hydro (-OH,-NH2...) rất phù hợp cho phương pháp HS vì chúng thường có áp suất hơi cao. Phương pháp thực hiện SPME trực tiếp trong pha lỏng (direct SPME) thường sử dụng khi phương pháp HS cho các peak quá nhỏ. Sự khuấy đảo Thời gian để đạt trạng thái cân bằng hấp phụ sẽ rút ngắn nếu ta tiến hành khuấy mẫu. Các phương pháp khuấy thường sử dụng là khuấy từ, khuấy cơ học, khuấy nhờ vào chuyển động của cột SPME, hoặc khuấy nhờ siêu âm. Thể tích mẫu (Vw) và thể tích phần HS (Vh) Với phương pháp Headspace SPME: Lượng cấu tử tách được sẽ càng nhiều khi Vw càng lớn (trong mức giới hạn), đồng thời Vh nên nhỏ đối với những cấu tử bay hơi tốt. Phương pháp Direct SPME: Vw không ảnh hưởng đến tốc độ tách cấu tử. Đến nay người ta vẫn chưa tìm hiểu được ảnh hưởng của Vw và Vh đến thời gian tách cấu tử. Tuy nhiên, các nhà khoa học khuyến cáo nên sử dụng Vh lớn hơn Vw chừng 20 lần. Thời gian tách cấu tử bằng hấp phụ (te) Thời gian te được xác định từ khi đưa cột vào để hấp phụ cho đến khi không còn thấy peak nào xuất hiện thêm. Thời gian thí nghiệm càng gần với te thì càng tốt vì như thế thì sẽ giảm được những sai số trong quá trình thí nghiệm và khi đó độ nhạy sẽ là cực đại. te trong SPME thường ngắn hơn trong các phương pháp khác Nhiệt độ Theo nhiệt dộng học thì hằng số cân bằng Kfw (là tỉ lệ giữa nồng độ cân bằng của cấu tử trong cột hấp phụ và nồng độ cân bằng của cấu tử trong mẫu) giảm khi nhiệt độ giảm. Nhiệt độ ảnh hưởng nhiều nhất đến phương pháp Direct SPME: hệ số khuếch tán càng tăng khi độ nhớt giảm (độ nhớt thấp khi nhiệt độ càng cao) nhưng khi đó thì độ nhạy sẽ giảm. Với HS SPME, Kfh (hằng số cân bằng giữa pha tĩnh và headspace) và Khw (hằng số cân bằng giữa headspace và pha lỏng của mẫu) lần lượt sẽ tăng và giảm theo việc tăng nhiệt độ. Và theo [70] , việc tăng nhiệt độ sẽ làm giảm tính nhạy của phương pháp tách SPME dựa vào cân bằng, tuy nhiên, tốc độ tách mẫu sẽ tăng. Khw càng lớn thì các cấu tử có độ bay hơi thấp sẽ tách hiệu quả hơn. Ngoài ra, do việc truyền nhiệt kém trong HS nên nhiệt độ của cột hấp phụ sẽ thấp hơn nhiệt độ của mẫu nên lượng cấu tử cần tách sẽ hấp phụ chậm dần theo thời gian. Nhìn chung, với mỗi dung dịch, cột hấp phụ và loại cấu tử cần tách, nhiệt độ tối thích thường được xác định bằng thực nghiệm. Điều kiện giải hấp phụ Thời gian giải hấp phụ càng ngắn càng tốt, vì vậy nhiệt độ cao nhất mà không làm phá hủy cột hấp phụ và các cấu tử phân tích thường được lựa chọn là nhiệt độ giải hấp phụ. Với cột PDMS, nhiệt độ giải hấp phụ là 340oC (7m), 280oC (30 và 100m); cột PDMS-DVB thường là 270oC; cột PA thường là 320oC; cột carboxen-PDMS là 265oC. Các giá trị nhiệt độ này thu được chủ yếu là từ các kết quả thực nghiệm. So sánh phương pháp SPME và phương pháp bơm mẫu trực tiếp Để so sánh, ta thực hiện thí nghiệm sau: lấy 0,5ml dung dịch, giữ ổn định ở 55oC không khuấy đảo, không bổ sung muối. Sau một thời gian thích hợp để đạt trạng thái cân bằng lỏng khí, cột SPME được đưa vào để hấp phụ cấu tử đã bốc hơi trên bề mặt dung dịch trong 10 phút (phương pháp Headspace SPME) trước khi đem đi sắc kí khí với đầu dò FID. Diện tích peak mỗi cấu tử trong mỗi trường hợp được chuẩn hóa với n-butanol được trích từ cột PDMS. [57] Bảng 2.2: So sánh diện tích peak của các phương pháp tách cấu tử hương [57] Chất Bơm mẫu trực tiếp SPME lấy mẫu trực tiếp dạng dung dịch Headspace SPME Ethyl acetate Ethyl butyrate Limonene Ethyl caproate 3-Hexenyl acetate cis-3-Hexenol Benzaldehyde Linalool Diethyl succinate Neral 2-Methylbutyric acid Anethole Caproic acid Ethyl vanillin 4,4 5,0 6.4 4.3 4.3 4.9 5.5 4.5 3.4 2.9 2.6 4.8 3.2 3,3 0,2 2,6 1.2 6.9 7.8 0.3 1.1 1.1 <0,1 7.0 0,1 14,1 0.1<0,1 1.2 11,5 2.6 8.4 12.0 2.1 6.0 6.0 <0,1 5.9 <0,1 5,0 <0,1 <0,1 Từ bảng 2.2, ta thấy phương pháp SPME đều cho các diện tích peak nhỏ hơn phương pháp bơm mẫu trực tiếp. Điều này có thể giải thích là do quá trình hấp phụ chỉ tách được một phần các cấu tử cần phân tích. Do vậy, SPME không phát hiện ra các cấu tử có hàm lượng quá bé như diethyl succinate, acid Caproic, ethyl vanilin… và phương pháp tách chiết này thường được ứng dụng nhất khi phân tích các cấu tử có hàm lượng tương đối cao (C>0,1mg/L) Ưu và nhược điểm của SPME [35,57,70] a. Ưu điểm Các ưu điểm chính của SPME là không cần dùng dung môi trích ly, dễ thực hiện, cần ít thiết bị hơn các phương pháp khác, thời gian tiến hành ngắn, dễ tự động hóa, và có độ nhạy cao. Phương pháp SPME có thể sử dụng để tách các cấu tử có độ bay hơi thấp lẫn các cấu tử có độ bay hơi cao. b. Nhược điểm Quá trình tách cấu tử của SPME diễn ra chậm hơn hẳn các phương pháp khác (Liquid-liquid extraction, Solid-phase extraction với cột nhồi). Thời gian tách cấu tử chậm, lượng cấu tử tách được là nhỏ làm cho độ nhạy của một số cấu tử có hàm lượng thấp là không đạt yêu cầu. Phương pháp tách trực tiếp (nhúng cột vào dung dịch) sẽ làm bẩn dung dịch cần phân tích. Thời gian giải hấp phụ cũng lâu hơn các phương pháp khác (SPE). Thường thời gian giải hấp là 12-20 phút, và do đó thời gian sắc kí cũng dài hơn. Cột hấp phụ sau mỗi lần sử dụng cần phải tốn thời gian để vệ sinh cột. SPME chỉ thường được sử dụng để tách các cấu tử có hàm lượng tương đối cao, >0,1 mg/L. Một nhược điểm ảnh hưởng lớn đến chi phí thực hiện đó là phương pháp trên chỉ thực hiện gián đoạn. Ứng dụng trong định lượng cấu tử hương của dịch nho sau lên men.[47] Phương pháp SPME đã được sử dụng rộng rãi trong định lượng các cấu tử hương trong dịch nước nho sau lên men, nhất là các cấu tử hương có hàm lượng cao (>0,1mg/L) như ethyl acetat, methanol và các rượu bậc cao khác (butanol-1, butanol-2, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1, isobutanol, 1-propanol). Phần này sẽ trình bày việc định lượng cấu tử hương trong dịch nho sau lên men sử dụng phương pháp xử lý mẫu HS-SPME. Nguyên liệu Các chất sử dụng để nội chuẩn bao gồm ethyl acetat, methanol, butanol-2, propanol-1, isobutanol, butanol-1, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1. Các dung dịch chuẩn sau đều được chuẩn bị trong hỗn hợp ethanol- nước (13%) và được bảo quản ở 5oC: 1,32g/L ethyl acetat; 4g/L methanol 0,55g/L butanol-2 ;0,55g/L propanol-1; 0,88g/L isobutanol; 0,66g/L butanol-1 ; 1,10 g/L 2-methyl butanol-1; 3,30g/L 3- methyl butanol-1 Dung dịch để nội chuẩn gồm 4-methyl pentanol-2 (1,6g/L) ; 2-methyl-3-buten-2-ol (28,8g/L); 2,3-butadione (56,0g/L) được pha trong ethanol. Dung dịch A dùng để định tính và xác định tính khả thi của SPME: 11g/L acid tartaric, ethanol 13%, NaOH để chỉnh pH về 3,4. Lấy 4 ml dung dịch trên pha thêm 2,3 g NaCl, cho thêm 1ml các dung dịch chuẩn, 50l dung dịch nội chuẩn. Cột hấp phụ Có thể sử dụng các loại cột với các pha tĩnh khác nhau như: cột PDMS 100m (PDMS-100), PDMS-7, Polydimethylsilosane-divinylbenzen 65m (PDMS-DVB), Polyacrylat 85m (PA) và cột Carbowax- divinylbenzen 65m (CW-DVB). Giai đoạn tách chiết SPME Các dung dịch sau khi được chuẩn bị sẽ đem đị chạy SPME với các điều kiện sau: lắc 10phút với tốc độ 200 vòng/phút. Thời gian hấp phụ 20 phút và giải hấp phụ trong 2 phút ở 250oC. Chạy sắc kí Hệ thống sắc kí được chuẩn bị như sau: sử dụng máy sắc kí 3400 GC, đầu dò FID, nhiệt độ đầu dò 300oC, tỉ lệ chia dòng 1/20; cột sắc kí mao quản CP Wax 57CB (50m x 0,25mm I.D; dày 0,2m), nhiệt độ injector 250oC . Chương trình chạy: 50oC trong 4 phút, tăng 8oC/phút đến 180oC, sau đó duy trì 5 phút. Khí mang là Heli, áp lực 20psi. Kết quả Theo [2], tác giả đã thực hiện một loạt các thí nghiệm và đưa ra các kết quả sau: Cột tốt nhất sử dụng trong trường hợp này là cột CW- DVB Đo diện tích peak các cấu tử theo thời gian tách SPME, kết quả thu được là: sau 5 phút tách, diện tích peak hầu như không thay đổi Với các cấu tử có nồng độ cao, thể tích pha lỏng sử dụng hầu như không ảnh hưởng đến diện tích peak. Điều này có thể được giải thích là các cấu tử có nồng độ cao sẽ nhanh chóng làm bão hòa pha hơi. Quá trình tách SPME sẽ không bị ảnh hưởng bởi nồng độ sacharose trong rượu vang. Diện tích peak của các cấu tử không bị ảnh hưởng bởi nồng độ ethanol trong rượu. Thực hiện chạy dung dịch A để xác định tính khả thi của SPME, kết quả thu được là các giá trị t-value đều thấp hơn giá trị tới hạn, có nghĩa là sử dụng SPME sẽ xác định nồng độ cấu tử hương thu được kết quả gần bằng nồng độ thực. Từ đó, cũng xác định được các chất nội chuẩn cần sử dụng để tính nồng độ của các cấu tử hương. Bảng 2.3: Các chất nội chuẩn phù hợp cho các cấu tử hương Cấu tử hương Chất nội chuẩn Ethyl acetat Methanol Butanol-2 Propanol-1 Iso butanol Butanol-1 2-methyl butanol-1 3-methyl-butanol-1 2-methyl-3-buten-2-ol 2,3-butaodione 4-methyl-2-pentanol 2-methyl-3-buten-2-ol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol Nồng độ các cấu tử hương: Bảng 2.4: Nồng độ một số cấu tử hương chính của các loại rượu Canary Island (mg/L) Cấu tử hương Trung bình Độ lệch chuẩn Min Max Ethyl acetat Methanol Butanol-2 Propanol-1 Iso butanol Butanol-1 2-methyl butanol-1 3-methyl-butanol-1 156,7 103,3 30,1 55,6 40,2 186,8 227,1 312,8 33,9 30,3 8,9 18,4 12,1 57,3 68,3 74,3 115,8 62,3 20,0 30,6 19,9 111,4 131,3 187,6 225,5 158,4 46,2 85,7 56,0 289,5 344,7 421,9 Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và trích ly đồng thời (Simultaneous steam distillation /extraction – SDE) Giới thiệu SDE (chưng cất lôi cuốn hơi nước và tách chiết đồng thời) là một trong những phương pháp có từ lâu đời và được sử dụng phổ biến nhất để tách chiết các cấu tử dễ bay hơi. Phương pháp này được phát minh bởi 2 nhà khoa học Likens và Nickerson, nhưng người nghiên cứu nhiều và đưa ra nhiều cách thức đổi mới trong việc tiến hành phân tích là nhà khoa học Chaintreau. [23] Việc phân tích các cấu tử hương luôn đòi hỏi việc phải tách chiết các phân đoạn dễ bay hơi từ hỗn hợp ban đầu rồi sau đó mới đem đi phân tích sắc kí khí. Phương pháp bơm mẫu trực tiếp vào thiết bị GC sau khi xử lý dung môi (như phương pháp LLE, phương pháp dùng chất lỏng siêu tới hạn) có thể gây nhiễm bẫn injector và làm ảnh hưởng đến khả năng làm giàu của các cấu tử. Phương pháp chưng cất chân không trực tiếp thì khá rườm rà và tốn nhiều thời gian vì sử dụng lượng mẫu khá lớn và phải qua nhiều giai đoạn khác nhau. Từ khi hai nhà khoa học Likens và Nickerson đưa ra nguyên tắc của phương pháp SDE 1964, phương pháp này ngày càng trở nên phổ biến, nhất là khi phân tích trong các phòng thí nghiệm. Tiếp bước Likens và Nickerson, lần lượt các nhà khoa học như Godefroot, Sandra, Verzele… đã nghiên cứu các bước phát triển của phương pháp nhằm rút ngắn thời gian tách chiết và thiết bị nhỏ gọn hơn. [39] Nguyên tắc tách chiết [55] SDE là một trong những kĩ thuật khá đơn giản và phù hợp với các mẫu dạng lỏng. Đây là quá trình tách chiết có sự kết hợp của hai hiện tượng hóa lý : chưng cất lôi cuốn hơi nước và tách chiết bằng dung môi. Nguyên tắc tách chiết bằng dung môi sẽ được nhắc đến nhiều hơn trong phần 2.3.3.3 về phương pháp tách chiết bằng dung môi. Hiệu quả tách chiết các cấu tử phụ thuộc vào tính chất vật lý của chúng trong hỗn hợp phân tích, thiết bị sử dụng và phương pháp chưng cất. Nguyên lý chung là các cấu tử hương kị nước cần phân tích sẽ được trích từ pha ưa nước của mẫu sang một dung môi hữu cơ không tan lẫn trong nước, do sự phân bố của cấu tử cần phân tích trong 2 pha, đặc trưng bằng hệ số phân bố Kow ở điều kiện cân bằng: Kow= Cio/ Ciw Cio: nồng độ cấu tử cần phân tích ở điều kiện cân bằng trong dung môi trích Ciw: nồng độ cấu tử cần phân tích ở điều kiện cân bằng trong pha ban đầu Nguyên tắc chưng cất lôi cuốn hơi nước thường sử dụng cho các cấu tử khó bay hơi hơn. Quá trình bay hơi của mẫu xảy ra nhờ sự cấp hơi nước liên tục cho mẫu hoặc tự tạo ra hơi nước bằng cách gia nhiệt cho hỗn hợp mẫu và nước tới một nhiệt độ đủ cao. Khi đó, các cấu tử ít tan trong nước sẽ bị cuốn theo dòng hơi nước đến bộ phận ngưng tụ nên chúng được tách ra khỏi những phân đoạn không bay hơi. Thiết bị SDE Hình 2.15: cấu tạo thiết bị tách chiết SDE [23] Thiết bị SDE có cấu tạo như hình sau, gồm: Một bình chứa mẫu và một bình chứa dung môi tách chiết đều được gia nhiệt đến nhiệt độ sôi nhờ vào thiết bị gia nhiệt vỏ áo. Phần không gian phía trên hai bình cầu có chứa một hệ thống sinh hàn làm lạnh để ngưng tụ các cấu tử sau khi bay hơi xuống một hệ thống ống có cấu tạo sao cho mực chất lỏng dâng đến một một mức nào đó sẽ chảy tràn về các bình chứa mẫu và dung môi ban đầu. Phần không gian phía trên hai bình cầu sẽ được thông với hệ thống bơm chân không để tạo độ chân không thích hợp cho toàn bộ hệ thống tách chiết. [23] Quá trình tách chiết bằng SDE Quá trình thực hiện SDE như sau: mẫu phân tích được đưa vào bình có cổ có dung tích 500ml- 5l. Lượng mẫu chứa chừng một nửa dung tích bình. Nên thực hiện khuấy đảo nếu mẫu là huyền phù đặc để tránh việc bơm bị tắc nghẽn. Trước khi tiến hành chưng cất, pH của mẫu được đo trước và có thể điều chỉnh nếu cần thiết. Nhiệt được cấp cho mẫu nhờ lớp vỏ áo gia nhiệt. Dung môi tách chiết thường chứa trong bình cầu có cổ thể tích 10-50ml và cũng được gia nhiệt. Rất nhiều dung môi có thể sử dụng để tách chiết như : hexan, diethyl ete, methylen chloride, hỗn hợp pentan và diethyl ete… [57] Quá trình chưng lôi cuốn hơi nước và tách chiết đồng thời diễn ra như sau: mẫu có chứa nước cất được gia nhiệt đến nhiệt độ sôi, hơi nước bốc mạnh lôi cuốn các cấu tử hương ít tan trong nước bốc hơi lên, đồng thời ở bình chứa dung môi cũng được gia nhiệt và dung môi cũng được bốc hơi và hòa trộn với phần hơi của mẫu. Hỗn hợp này sau đó sẽ được ngưng tụ trong ống sinh hàn, lúc này các cấu tử hương sẽ được chiết sang dung môi. Sau khi ngưng tụ, phần lỏng được tách làm hai pha, pha trên chứa dung môi và các cấu tử hương dễ bay hơi, pha dưới là nước. Mực chất lỏng của pha trên sau đó sẽ dần chảy tràn về bình cầu chứa dung môi ban đầu, còn nước ở dưới cũng chảy về bình chứa mẫu ban đầu. Quá trình này diễn ra khá chậm, khoảng 1-3h. Sau đó, phần dung môi chứa các cấu tử cần phân tích sẽ được làm khô với tác nhân là các hạt Na2SO4 rồi sau đó được làm giàu bằng cách chưng cất nhẹ và chậm. [57] Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của SDE là nhiệt độ của nước sôi khá cao (105oC) sinh ra một số cấu tử thứ cấp không mong muốn. Để giảm nhiệt độ của nồi chưng, một số tác giả đã đưa ra phương pháp tiến hành ở áp suất chân không. Picardi, Issenberg, Seifert và King đã cố gắng duy trì nhiệt độ mẫu chừng 45-50oC. [63] Khi chưng cất ở áp suất thường, các loại nguyên liệu mẫu chứa amino acid (như dịch nho) thì phản ứng Maillard rất dễ diễn ra và làm cho kết quả phân tích trở nên không đáng tin cậy nữa. Theo như nghiên cứu trong [63], các tác giả đã làm thí nghiệm và đưa ra kết luận: trong điều kiện chân không, phản ứng trên được hạn chế rất nhiều, tỉ lệ thu hồi các cấu tử cũng khá tốt và hiệu quả định lượng sẽ tăng so với hệ thống vận hành trong điều kiện áp suất thường. Hiệu quả này sẽ còn được cải thiện hơn nữa khi kéo dài thời gian chạy mẫu (do trong điều kiện chân không thì gần như không có sự phân hủy do nhiệt) [23,39] Vấn đề hiện nay khi sử dụng phương pháp SDE là phải đưa ra thiết bị dễ sử dụng trong việc tách chiết các cấu tử dễ bay hơi mà không bị thất thoát, thực hiện trong nhiệt độ phòng, với thời gian hợp lý.[39] Ưu- nhược điểm của phương pháp SDE a. Ưu điểm Phương pháp này phổ biến ở chỗ các cấu tử dễ bay hơi có điểm sôi trung bình và cao thì thu hồi tốt, đồng thời dung môi lỏng dùng trích ly cũng dễ kiếm và không đắt. [23,32] Bên cạnh đó, SDE có những ưu điểm nổi bật sau: [57] Chỉ qua một giai đoạn mà thực hiện được cả việc tách chiết các cấu tử dễ bay hơi và làm giàu (tăng nồng độ của chúng) Thể tích dung môi yêu cầu là thấp Tỉ lệ thu hồi các cấu tử dễ bay hơi là khá cao Hệ thống làm việc dưới điều kiện áp suất chân không nên sẽ góp phần làm giảm sự phân huỷ các cấu tử dưới tác động của nhiệt độ. Do lượng mẫu sử dụng nhiều nên phân tích bằng phương pháp SDE cũng thu được số lượng các cấu tử hương đa dạng hơn các phương pháp khác [31] Có thể đem đi phân tích GC ngay sau khi tách chiết SDE mà không cần qua bước làm sạch mẫu. Ngoài ra, dịch thu được sau tách chiết sẽ hoàn toàn không chứa các cấu tử không bay hơi không mong muốn. [63] b. Nhược điểm [31,39] Nhược điểm dễ thấy nhất của SDE là lượng mẫu sử dụng để phân tích là lớn hơn hẳn những phương pháp phân tích khác (thường trên 50ml). Điều này làm cho việc phân tích tốn chi phí khá nhiều về nguyên liệu. Bên cạnh đó, đây là phương pháp thực hiện khá lâu, tốn thời gian hơn hẳn những phương pháp phân tích khác (thường mất từ 3-4h trở lên) Mặt khác, phương pháp SDE này phải tốn thêm chi phí vì sử dụng thêm dung môi và nhiệt lượng khi tách chiết. Nhược điểm lớn nhất của SDE là khi thực hiện ở nhiệt độ và áp suất thường, do nhiệt độ của nước sôi khá cao (105oC) nên sẽ có phản ứng phân hủy sinh ra một số cấu tử thứ cấp không mong muốn. Trong một số trường hợp, người ta có sử dụng thêm các chất chống oxi hoá để giảm thiểu việc phân hủy các cấu tử do phản ứng oxi hóa dưới tác động của nhiệt độ cao. Do những lý do trên, phương pháp này ít khi sử dụng cho các mẫu có các cấu tử nhạy cảm với nhiệt độ (ở nhiệt độ cao sẽ xúc tác xảy ra những phản ứng Maillard, oxi hóa, chuyển vị…). [39] Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết SDE Mỗi giai đoạn của quá trình tách chiết đều có ảnh hưởng đến thành phần và tỉ lệ các cấu tử trong hỗn hợp sau tách chiết . Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm độ bay hơi của các cấu tử khi chưng cất lôi cuốn, khả năng hoà tan của hỗn hợp sau chưng cất trong quá trình chiết bằng dung môi, và lại là độ bay hơi trong quá trình cô đặc hỗn hợp, loại bớt dung môi [23] Dung môi tách chiết Những dung môi có điểm sôi thấp như diclometan, pentan, diethyl ete thường được sử dụng trong phương pháp SDE vì chúng có khả năng tách chiết rất tốt (có hệ số phân bố của các cấu tử Kow cao), được tách rửa nhanh chóng trong quá trình GC và chúng dễ bốc hơi khi tiến hành làm giàu các cấu tử cần phân tích. Trong điều kiện áp suất chân không, các dung môi trên ngưng tụ ở nhiệt độ rất thấp (-40oC). Các dung môi có điểm sôi gần với nước sẽ làm cho các cấu tử bị thất thoát đi nhiều, làm việc phân tích không còn chính xác. Với phương pháp SDE thực hiện trong điều kiện chân không, có thể sử dụng các dung môi sử dụng có nhiệt độ sôi cao hơn như diclometan và hexan. Tuy vậy, các dung môi sử dụng trong phương pháp này sẽ dễ dàng loại ra khỏi hỗn hợp ở ngay nhiệt độ phòng bằng cách cho một dòng khí nitơ di chuyển nhẹ qua mẫu trong thời gian ngắn. Trường hợp này, các loại ankan thường được sử dụng và thích hợp hơn các dung môi như Toluen vì ít gây mùi hơn. [39] Bảng 2.5: Thông số của một số dung môi tách chiết trong SDE [39] Dung môi Điểm sôi (oC) Độ chân không (mbar) Nhiệt độ mẫu (oC) Nhiệt độ dung môi (oC) Mùi dung môi Iso-octan Heptan 2-Pentanon Toluen Hexan Octan 99 99 102 111 69 125 49 35 31 37 115 20 37 30 31 37 115 20 20 17 17 26 22 26 Yếu Yếu Khó chịu Khó chịu Yếu Yếu Thời gian tách chiết Một yếu tố ảnh hưởng quan trọng khác là thời gian tách chiết. Nếu thực hiện ở áp suất thường, thời gian tách chiết càng dài thì các cấu tử cần phân tích càng dễ bị phân hủy. Trong điều kiện chân không, khi đã chỉnh áp suất và nhiệt độ hợp lý, thời gian càng dài thì tách chiết được càng nhiều. Nhìn chung, tùy bản chất của cấu tử cần phân tích mà ta lựa chọn thời gian tách chiết cho phù hợp.[63] Nhiệt độ Nhiệt độ của các hỗn hợp đạt được khi gia nhiệt cũng đóng vai trò rất quan trọng. Nhìn chung, cần gia nhiệt đến nhiệt độ bay hơi của dung môi (bình chứa dung môi) và nhiệt độ bay hơi của nước (bình chứa mẫu). Nhiệt độ sôi của nước có thể làm phân hủy một số cấu tử hương, vì vậy người ta có xu hướng thực hiện tách chiết trong điều kiện chân không. [39,63] Các yếu tố khác Ngoài các yếu tố kể trên, còn hàng loạt các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp đến quá trình như thể tích mẫu và dung môi, tốc độ làm lạnh, khoảng cách giữa hai mức chảy tràn… Nhìn chung, với mỗi loại mẫu khác nhau, người ta thường thí nghiệm để rút ra các thông số phân tích tối ưu nhất.[31,39,63 So sánh SDE với những phương pháp tách chiết khác So sánh SDE với SBSE Phương pháp SDE thường dùng trong phân tích các