Đồ án Công nghệ cố định enzym và ứng dụng

glutaraldehyde có thể giữ đƣợc 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính. Ngƣời ta nhận thấy rằng chế phẩm β-galactosidase đƣợc liên kết chéo bằng canavalin A có thể thủy phân lactose vƣợt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữ đƣợc hoạt tính cao, cụ thể là giữ đƣợc 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ đƣợc 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4oC. Phương pháp liên kết cộng hóa trị Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua các nhóm chức năng không nằm trong trung tâm hoạt động của enzym nhƣ amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức năng trên chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học nhƣ cyanogen bromide, carbodimide, và glutaraldehyde. Enzym từ A. oryzae đƣợc cố định trên bột nylon-6 và zeolite. Zeolite thì không lý tƣởng vì lƣợng liên kết tạo thành ít trong khi đó nylon-6 tạo ra đƣợc khung mạng ổn định. Các dẫn xuất thu đƣợc hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lớp glycophase. Enzym β-galactosidase từ E. coli đƣợc cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ đƣợc tƣơng ứng 25% và 22% hoạt tính. Enzym đƣợc cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid. Các dẫn xuất β-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhƣng hoạt tính khác nhau sau khi đƣợc tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm một thời gian dài, enzym đƣợc cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic đƣợc xem là ổn định nhất. Dẫn xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ở 70oC. Gần đây sự liên kết ngang của β-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau đƣợc thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Kết quả là hoạt tính của enzym cố định đƣợc tăng lên. Khi cố định β-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose ngƣời ta nhận thấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạt động của enzym trong công nghiệp. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 13 ~ Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase Phƣơng pháp cố định Nguồn β-galactosidase Tác nhân cố định Hấp phụ vật lý K. fragilis and K. lactis A. oryzae E. coli B. circulans B. stearothermophilus A. niger K. fragilis K. lactis Chitosan Phenol-formaldehyde resin Chromosorb-W Polyvinyl chloride, Silica gel Chitosan Porous ceramic monolith Chitosan beads CPC-silica, agarose Bao gói K. bulgaricus E. coli A. oryzae Thermus aquaticus YT-1 Penicillium expansum F3 K. lactis Alginate using BaCl3 Polyacrylamide gel Nylon-6 and zeolite Agarose bead Calcium alginate Poly(vinylalcohol) hydrogel Liên kết cộng hóa trị L. bulgaricus S. anamensis E. coli K. latis A. niger A. oryzae Egg shells Calcium alginate Hen egg white Cotton fabric Magnetic polysiloxane- polyvinyl alcohol Silica 2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định 2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2] Sữa đƣợc thủy phân lactose đƣợc sử dụng cho việc chế biến hƣơng liệu sữa, phô mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thƣờng là bƣớc làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hƣơng vị cho phó mat. Chất lƣợng của sữa đông lạnh và kem làm từ sữa cũng đƣợc cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 14 ~ lại sự kết tinh đƣờng lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu trúc cát sạn. Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của β-galactosidase trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu đƣợc qua lọc màng có thể đƣợc sử dụng nhƣ chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng hợp và nƣớc giải khát. β-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol đƣợc nhận thấy là bền nhiệt hơn so với enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50oC và 5% hoạt tính ở 60 oC. Thủy phân đƣợc 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm 50% sau 30 lần sử dụng. Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định β- galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ƣu phụ thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhƣng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi lactose. Enzym β-galactosidase từ A. niger thủy phân đƣợc 70% lactose trong sữa gầy ở 40oC trong 10 phút. Enzym β-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel đƣợc dùng để thủy phân whey, sau 7h thủy phân đƣợc 70-75% whey. Sự cố định enzym β-galactosidase từ A. niger trên silica gel đã đƣợc kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định sử dụng silica gel đƣợc kích hoạt bằng TiCl3 và FeCl3 sẽ thủy phân đƣợc 81% đến 84% trong dung dịch chứa 4% lactose. Enzym β-galactosidase từ K. lactis đƣợc cố định trên CPC-silica (đã đƣợc silan hóa và kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (đƣợc kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển đổi đƣợc 90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor”. β-galactosidase đƣợc nhốt trong gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quá trình thủy phân lactose ở 5oC cho quá trình sản xuất sửa nghèo lactose. Mô hình động học sử dụng cho enzym β-galactosidase từ K. lactis cũng đƣợc khảo sát. Enzym cố định có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp và áp dụng đƣợc cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn sự kết tinh của lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hƣơng vi cho sản phẩm sữa. Enzym β- galactosidase từ K. lactis cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo đƣợc dùng để thủy phân lactose trong sữa nguyên kem và chuyển đổi đƣợc 95% lactose trong 2h trong thiết bị phản ứng gián đoạn, và khi đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị với polysiloxane-polyvinyl alcohol, sử dụng glutaraldehyde nhƣ là tác nhân liên kết chéo cho thấy độ hoạt động cao hơn và độ ổn định nhiệt cao hơn so với enzym hòa tan. Vì thế enzym này đƣợc sử dụng có hiệu quả trong thủy phân lactose từ sữa. β-galactosidases từ K. lactis cũng đƣợc cố định trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính đƣợc Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 15 ~ dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g. L−1) trong một quá trình gián đoạn vừa đƣờng hóa vừa lên men đồng thời. β-galactosidase từ A. oryzae cố định trên chất mang concanavalin A-cellulose đƣợc sử dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Ngƣời ta nhận thấy rằng pH tối ƣu của enzym hòa tan và enzym cố định là 4.8 nhƣng nhiệt độ tối ƣu tăng từ 50oC lên 60oC đối với enzym cố định. Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60oC. Gần đây thiết bị phản ứng packed bed cùng với tế bào có tính thấm đƣợc nhốt trong alginate đƣợc sử dụng để thủy phân lactose trong sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%. β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định bằng 3 kĩ thuật khác nhau: hấp phụ trên celite, liên kết cộng hóa trị với chitosan, hoặc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo. Các chế phẩm enzym cũng đƣợc so sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp oligosaccharide. Các enzym β-galactosidase đƣợc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo đƣợc cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h. β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên silica, hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của enzym đã đƣợc thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu đƣợc bằng cách sử dụng glutaraldehyde nhƣ chất hỗ trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym. Trong các phƣơng pháp xử lí whey khác nhau (vi lọc, siêu lọc, xử lí nhiệt), siêu lọc đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất đối với dung dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng. Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau Nguồn VSV Tác nhân cố định Hiệu suất thủy phân Thời gian thủy phân Fungal galactosidase E. coli K. lactis K. fragilis K. lactis Fungal β-galactosidase K. marxianus A. oryzae Bacillus stearothermophilus Polyvinyl-alcohol Polyacrylamide gel Thiosulfinate/thiosulfonae Cellulose beads Cotton fabric Hydrogels Calcium alginate Concanavalin A layered calcium alginate-starch hybrid Chitosan 75% 47% 85%–90% >90% 95% 70%–75% 84.8% 89% >80% 5-6 h 6 h 2.5 h 5 h 2 h 7 h 2.5 h 3 h 2 h Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 16 ~ 2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) [2] Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym β-galactosidase còn có tác dụng chuyển nhóm bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi cho các vi sinh vật có ít trong đƣờng ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể đƣợc dùng để gắn galactose vào hợp chất hóa học khác, kết quả tạo thành galacto-oligosaccharide. Do đó cho thấy tiềm năng trong việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dƣợc phẩm, và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác. Các điều kiện của phản ứng chuyển nhóm galactose nên có nồng độ lactose cao, nâng nhiệt độ và giảm hoạt độ nƣớc trong môi trƣờng phản ứng. Nhiệt độ, nồng độ cơ chất và nguồn gốc enzym đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp oligosaccharide. Tuy nhiên ảnh hƣởng của nồng độ lactose ban đầu thì lớn hơn. Nói chung với nồng độ lactose ban đầu càng cao thì càng nhiều galacto-oligosaccharide đƣợc tổng hợp. Nhiệt độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất tổng hợp oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn ở nhiệt độ cao hơn là một lợi thế bổ sung khi tiến hành phản ứng ở nồng độ lactose ban đầu cao. Do đó, enzym β-galactosidase nên đƣợc ổn định ở nhiệt độ cao hàm lƣợng nƣớc thấp để làm cho hoạt động chuyển nhóm galactose tăng lên. Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide bằng β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc tối ƣu hóa bởi nồng độ lactose, enzym, tỉ lệ cơ chất. Trong quá trình sản xuất gián đoạn liên tiếp galacto-oligosaccharide, hiệu quả xúc tác tăng lên 190% đối với enzym tự do trong dung dịch, và 8500g galacto-oligosaccharide trên 1g enzym đƣợc sản xuất trong 10 đợt. Enzym β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên Fe3O4–chitosan cho kết quả hiệu suất tổng hợp galacto-oligosaccharide cao nhất là 15,5%. Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide sử dụng β- galactosidase từ A. oryzae cố định trên polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã đƣợc thực hiện. Lƣợng galacto-oligosaccharide đạt đƣợc khoảng 26% (w/v) so với lƣợng đƣờng tổng, có khoảng 55% lactose đƣợc chuyển đổi từ dung dịch có nồng độ lactose là 50% (w/v) ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Trisaccharides chiếm hơn 81% tổng lƣợng GOS đƣợc sản xuất. Việc hình thành GOS không bị ảnh hƣởng đáng kể bởi nhiệt độ và pH. Hệ thống enzym cố định dùng polyethyleneimine, glutaraldehyde, và cotton đƣợc nghiên cứu và so sánh sự sản xuất galacto-oligosaccharide trong hệ thống siêu lọc enzym tự do và hệ thống sử dụng enzym cố định. Trong quá trinh cố định sử dụng kết hợp PEI và GA, ngƣời ta nhận thấy khoảng 50% đến 90% enzym bị hoạt hóa. Hệ thống enzym tự do và enzym cố định tƣơng đƣơng cho thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22% (w/v) và 20% (w/v) trong thời gian khoảng 15 – 17 phút, và chuyển đổi đƣợc 50% lactose. β-galactosidase tinh khiết từ Bullera singularis ATCC 24193 đƣợc cố định trên hạt Chitopearl BCW 3510 đƣợc sử dụng cho phản ứng tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOSs) Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 17 ~ từ lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng hợp đƣợc 55% GOS với năng suất 4.4 g/(L-h) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ lactose ban đầu là 27% (w/w), 50% lactose đƣợc chuyển đổi với nồng độ ban đầu là 500 g/L. Trisaccharides là một sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lƣợng GOS đƣợc tạo ra. β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên hạt chitosan tạo ra lƣợng trisaccharides cao nhất (17,3% trong tổng lƣợng đƣờng), sử dụng 20% (w/v) lactose trong vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối với tập hợp enzym có liên kết chéo. 2.1.2. Enzym lipase 2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ các enzym mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác cho các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù hợp lipase còn cho thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng alcoholysis [4]. Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzym đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzym lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzym lipase mang lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thông thƣờng. Lipase có thể sử dụng một cách có hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó, việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và các sản phẩm phụ bằng cách phƣơng pháp tốn kém năng lƣợng [3]. Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn còn nhiều trở ngại do chi phí cao. Vấn đề này có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng và qui trình sản xuất có thể đƣợc vận hành liên tục [3]. 2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase Enzym lipase thƣơng mại thƣờng đƣợc thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày của động vật nhai lại) hoặc từ nấm sợi nhƣ (Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Mucor spp. or Candida spp…). Enzym lipase từ động vật có tính đặc hiệu cao trong việc giải phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử triglyceride, trong khi đó các lipase từ nguồn vi sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5]. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 18 ~ Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase [6] Nguồn VSV Tính chất enzym Nhiệt độ tối ƣu pH tối ƣu Bacillus acidocaldarius 70 - Bacillus sp. 50 8.0-9.0 Bacillus strin 60 8.0 Bacillus stearothermophilus 68 - Bacillus thermocatenletus 60-70 8.0-9.0 Bacillus thermoleovorans 70-75 7.5 Geobacillus sp. 70 9.0 Pseudomonas sp. 65 9.6 Pseudomonas sp. 90 11.0 Pyrobaculum calidifontis 90 - Pyrococcus furiosus 100 - Pyrococcus horikoshii 97 5.6 Pyrococcus horikoshii 95 7.0 2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase Phương pháp hấp phụ vật lí Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tƣơng tác bề mặt thuận nghịch giữa enzym và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tƣơng tác kỵ nƣớc. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là chi phí thấp, quá trình thực hiện đơn giản và nhanh chóng; không có sự biến đổi về mặt hóa học enzym cũng nhƣ chất mang, đây là sự cố đinh thuận nghịch. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là sự giải hấp enzym ra khỏi chất mang, sự cản trở về mặt không gian của chất mang và sự hình thành các liên kết không đặc hiệu. Các vật liệu vô cơ nhƣ than hoạt tính, silica,… và vật liệu hữu cơ nhƣ các polymer tự nhiên hoạt tổng hợp có thể đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym lipase [7]. Lipase đƣợc hấp phụ trên chất mang kỵ nƣớc rất ổn định đối với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Dẫn xuất enzym lipase từ C. antarctica B cố định trên Octadecyl– Sepabead giữ đƣợc 100% hoạt tính sau khi ủ trong 200h ở 50oC và pH 7.0. Ngoài ra, dẫn xuất này còn giữ đƣợc hoạt tính đầy đủ trong thời gian dài (200h) trong dung dịch 50% dioxane ở nhiệt độ 25oC ở pH 7.0. Mặc dù đƣợc cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí đơn giản Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 19 ~ nhƣng các dẫn xuất enzym lipase này có tính ổn định nhiệt hơn các dẫn xuất đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị và các enzym tự do trong dung dịch [8]. Phương pháp liên kết cộng hóa trị Phƣơng pháp này dựa trên liên kết công hóa trị giữa chất mang và một vài nhóm chức năng của amino acid trên bề mặt của enzym. Chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa trƣớc bằng các hợp chất đặc biệt làm cho các nhóm chức năng trở nên ái điện tử mạnh, các nhóm này sau đó phản ứng với các nhóm ái nhân mạnh của enzym. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tạo đƣợc các liên kết bền vững và sự cố định đạt đƣợc sự ổn định cao. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là chi phí cao và hiệu suất cố định thấp. Bên cạnh đó, cấu trúc và hoạt tính của enzym bị ảnh hƣởng mạnh bởi các liên kết cộng hóa trị [7]. Lipase đã đƣợc cố định thành công trên nhiều chất mang khác nhau nhƣ chitosan, agarose, và các polypeptide kỵ nƣớc sử dụng carbodiimide làm tác nhân hoạt hóa nhóm carboxyl của chất mang khi cố định enzym lipase từ C. rugosa. Ƣu điểm của carbodiimide là có khả năng hoạt hóa cao và độc tính thấp đối với enzym [9]. Nhóm carboxyl của -PGA (Poly(-glutamic acid)) đƣợc hoạt hóa bằng cách phản ứng với carbodiimide (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC). - PGA sau khi đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc cho vào dung dịch đệm có chứa lipase tự do. Việc cố định enzym lipase từ C. rugosa đƣợc thực hiện ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau. Sau giai đoạn này enzym lipase cố định đƣợc làm lạnh khô trong máy sấy thăng hoa sau đó rửa lại vài lần bằng n-hexan. Điều kiện cố định tối ƣu đạt đƣợc ở nhiệt độ 13,3oC trong thời gian 2,3h và hoạt tính cao nhất đạt đƣợc là 1196 U/g-chất mang [9]. Lipase từ Candida Antarctica cũng đƣợc cố định trên agarose và chitosan, sử dụng các chất hoạt hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng chất mang là agarose với chất hoạt hóa glycidol đạt đƣợc hoạt tính cao nhất là 845U/g gel trong sau 72h cố định. Khi sử dung chất mang là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì hoạt tính cao nhất đạt đƣợc tƣơng ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định. Sự ổn định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose- glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng agarose-glutaraldehyde. Dẫn xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so với enzym tự do, thu đƣợc khi cố định trên chitosan đƣợc hoạt hóa qua 2 bƣớc, sử dụng glycidol và glutaraldehyde, thời gian cố định là 72h. Mức độ ổn định của dẫn xuất cố định tăng lên theo thời gian cố định, điều này cho thấy liên kết cộng hóa trị đa điểm giữa chất mang và enzym đã thực sự xảy ra [10]. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 20 ~ Phương pháp bao gói Để cố định enzym bằng phƣơng pháp nhốt có thể dùng các polyme khác nhau ở dạng hạt nhƣ là agarose, alginate và chitosan. Agarose có độ trƣơng không mong muốn trong nên enzym dễ bị rửa trôi trong môi trƣờng phản ứng và polyme này không đƣợc sử dụng. Alginate và chitosan đƣợc chuẩn bị bằng cách gel hóa sử dụng calcium chloride hoặc sodium tripolyphosphate làm tác nhân liên kết chéo. Hiệu suất cố định với chitosan và alginate tƣơng ứng là 43% và 50%. Hoạt tính của alginate thì thấp 240 ± 33 and 220 ± 26 unit/ml so với chitosan là 1110±51 và 1150±11 unit/ml tƣơng ứng với hạt ƣớt và hạt đƣợc sấy đông khô. Do đó chitosan thƣờng đƣợc chọn làm chất mang cố định enzym lipase [11]. Lipase từ C. rugosa đƣợc cố định bằng cách trộn đều với dung dịch sodium alginate, ngay sau đó hỗn hợp dung dịch đƣợc nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 bằng vòi phun tia, khi đó Ca-alginate dạng hạt chứa enzym đƣợc hình thành. Gel đƣợc hình thành là do có sự liên kết chéo giữa Ca2+ và alginate, do đó nồng độ Ca2+ và alginate hai thông số quan trọng ảnh hƣởng đến sự cố định enzym lipase. Khi cố định nồng độ CaCl2 (50 mM), tăng nồng độ alginate (từ 1% lên 2%), tỉ lệ enzym và alginate là 1:8 thì phần trăm enzym đƣợc cố định sẽ tăng. Nếu cố định nồng độ alginate (1%) và tăng nồng độ CaCl2 (từ 50mM lên 300mM) thì phần trăm enzym đƣợc cố định dƣờng nhƣ không đổi. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ alginate thì hoạt độ riêng của enzym cố định sẽ giảm. Nồng độ của alginate có ảnh hƣởng nhiều đến tỉ lệ enzym đƣợc cố định và hoạt độ riêng của enzym hơn sự ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2, do đó nồng độ alginate cần đƣợc tối ƣu hóa để hiệu suất cố định enzym đạt cao nhất [12]. 2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây [13] Các ester có cấu tạo acid béo chuỗi ngắn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc tạo hƣơng cho các loại nƣớc ép trái cây, phô mai, bánh nƣớng, kẹo, đồ uống và kem. Hai ester tạo mùi loại này (n-butyl acetate và n-propyl acetate) đƣợc tổng hợp bằng enzym thông qua phản ứng chuyển ester của vinyl acetate với hai rƣợu tƣơng ứng là n-butanol và n-propanol. Hai ester này có mặt trong tự nhiên ở nhiều loại trái cây khác nhau nhƣ táo, dâu tây, lê,… Lipase từ Rhizopus oligosporus NRRL 5905 đƣợc cố định trên silica gel sử glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo dùng để tổng hợp ester. Hiệu suất tạo thành n-butyl acetate và n-propyl acetate tƣơng ứng là 50% và 56% đạt đƣợc sau 24h ở nhiệt độ ở 30oC với nồng độ enzym là 25%(w/v). Enzym lipase cố định có thể đƣợc sử dụng trong 3 chu kỳ mà vẫn giữ đƣợc 100% hiệu suất tổng hợp ester. Giá tri Km và Vmax đƣợc xác định là 227mM và 322 µmol/(g.h) đối với n-butyl acetate và 222mM và 385 µmol/(g.h) đối với n-propyl acetate. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 21 ~ Trong phản ứng sử dụng xúc tác là enzym cố định, tồn tại hệ thống xúc tác hai pha do sự không hòa tan của enzym trong hỗn hợp phản ứng dẫn đến hạn chế sự truyền khối trong hệ thống phản ứng. Để quan sát ảnh hƣởng của sự hạn chế truyền khối ngƣời ta tiến hành thí nghiệm ở các tốc độ khuấy khác nhau từ 50 đến 300 rpm, qua đó nhận thấy hiệu suất tổng hợp đạt cao nhất khi tốc độ khuấy là 200 rpm. Để khảo sát ảnh hƣởng nồng độ enzym đối với việc tổng hợp ester ngƣời ta tiến hành phản ứng với nồng độ enzym từ 2.5% (w/v) (1.5U/ml) đến 30% (w/v) (18U/ml) và cố định các thông số khác của hỗn hợp phản ứng. Sau 24h phản ứng hiệu suất tổng hợp lần lƣợt là 50% và 56% tƣơng ứng với n-butyl acetate và n-propyl acetate với nồng độ enzym là 25% (w/v) (15 U/ml). Khi tăng lƣợng enzym thì tốc độ phản ứng không tăng thêm, điều này có thể giải thích là do thiếu cơ chất để kết hợp với trung tâm hoạt động và khó duy trì độ bền của hệ huyền phù chất xúc tác khi nồng độ enzym cao hơn. Sự ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc ban đầu đến hiệu suất phản ứng cũng đƣợc kiểm tra bằng cách thêm nƣớc từ 2%-20% (v/v) vào hỗn hợp phản ứng. Hiệu suất phản ứng cao nhất đạt đƣợc khi không có mặt nƣớc là 10% đối với n-butyl acetate và 13% đối với n-propyl acetate. Trong khi đó hiệu suất sẽ giảm khoảng 5% khi hàm lƣơng nƣớc là 20%. Khi tăng nhiệt độ từ 30oC lên 50oC thì tốc độ phản ứng tăng, qua giá trị 50oC thì tốc độ phản ứng giảm xuống. Với n-butyl acetate tốc độ phản ứng tăng từ 217 đến 410 µmol/(g.h) và tăng từ 298 đến 529 µmol/(g.h). 2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ [14] Monoacylglycerols (MAG) đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là chất nhũ hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm là chất tạo nhũ cho các loại bánh, sản phẩm sữa và các loại nƣớc sốt… Hiện nay, MAG đƣợc sản xuất trên qui mô công nghiệp bằng cách thủy phân liên tục chất béo ở nhiệt độ cao (220–250oC), sử dụng chất xúc tác vô cơ trong môi trƣờng khí Nitơ. Sản phẩm đƣợc sản xuất theo con đƣờng này có một số nhƣợc điểm. Một lƣợng glycerol bị hao phí do nhiệt độ phản ứng cao hơn 220oC, các sản phẩm phụ tạo gây màu sẫm và tạo mùi không mong muốn. Hơn nữa, hiệu suất tạo MAG là khá thấp. Quá trình chƣng cất phân đoạn phân tử là cần thiết vì MAG sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cần độ tinh sạch cao, vì chúng có tính chất nhũ hóa tốt hơn các hỗn hợp các acylglycerol. Gần đây có nhiều phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu để sản xuất MAG bằng enzyme. Đây là quá trình thủy phân chọn lọc sử dụng enzyme 1,3-regiospecific lipase, sự ester hóa của các acid béo hoặc sự chuyển ester của ester của các acid béo với glycerol và quá trình glycerolysis của mỡ hoặc dầu. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 22 ~ Hiện nay, những bất lợi của việc sử dụng lipase để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là giá cả của enzyme. Để vƣợt qua vấn đề này, lipase đƣợc sử dụng ở dạng cố định, vì phƣơng pháp này cho phép tái sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme, qua trình sản xuất liên tục cũng đƣợc thực hiện dễ dàng hơn. Phƣơng pháp cố định enzyme có thể đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp cố định vật lí hoặc hóa học trên bề mặt chất mang. Nhiều loại