Đồ án Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh lở cổ rễ trên cây ngô và đậu xanh của nấm Trichoderma konnigii

m: MT (1,64 T/ha), V8-20 (1,64T/ha), D49 (1,55 T/ ha). 2.5.3.1 Tình hình của bệnh LCR trên đậu xanh: Theo Võ Thị Thu Oanh (2000), bệnh LCR của cây đậu xanh thường xâm nhập vào cây khi cây vừa nhú mầm và sau 7 ngày tuổi là lúc bệnh bắt đầu phát triển, dần khoảng 20 ngày tuổi là lúc ta quan sát được bệnh rõ nhất. Bệnh này thường xuất hiện ở phần rễ của cây. Bên cạnh đó nấm bệnh còn có thể cạnh tranh thức ăn, chất dinh dưỡng của hạt giống, làm cho hạt giống không thể nảy mầm trong quá trình trồng. Biểu hiện đặc trưng nhất của triệu chứng bệnh là rễ và gốc thân sát mặt đất bị thâm đen, thối mục, gây bệnh héo chết cây đỗ gục xuống ruộng . Ban đầu vết bệnh chỉ là một chấm nhỏ màu đen ở gốc thân, cổ rễ sau đó lan rộng ra gốc thân và bọc quanh cổ rễ. bộ phận bị bệnh thì thối mục, màu đen ủng nước hoặc hơi khô, cổ rễ bị héo tóp, bộ phận lá thân bị heo rũ nhưng vẫn giữ được màu xanh ở lá. 5-6 ngày bị héo rũ và chết hàng loạt trên đồng ruộng, để lại từng chòm vạt trống khuyết cây. Khi gặp ẩm độ cao, nơi vết bệnh xuất hiện những hạch nấm màu nâu đen trên các đám trơ nấm màu trắng . Nguyên nhân bệnh là do cá loại nấm như Fusarium solani, Rhizoctonia solani … 2.5.3.2 Cách phòng bệnh LCR ở nước ta: Theo thạc sĩ Võ Thị Thu Oanh (2000) thì biện pháp phòng tốt nhất đối với cây họ đậu là : + Thực hiện luân canh với cây họ hòa hảo như lúa nước nhằm hạn chế bệnh tồn tại trong đất từ 2 đến 3 năm . + Áp dụng đúng các kỹ thuật canh tác từ khi gieo hạt đến lúc thu hoạch, cày bừa kỹ, để ải khô, bón vôi để tiêu hủy tàn dư cây bệnh + Chọn giống tốt có sức nảy cao, gieo hạt đúng thời vụ tránh bị mưa going, gieo hạt quá sâu. Sau khi mưa cần phá váng, xới xáo kịp thời, vun luống cao tránh để ứ đọng nước, chú ý bón lót vôi và bón thúc sớm bằng phân lân và phân kali. + Mật độ trồng không quá dày. + Nên xử lí hạt giống trước khi gieo bằng các loại thuốc Rovral 50WP, Viben C 50WP, Ridomil MZ 72…có thể xử lý ướt. + Khi bệnh phát triển, lây lan nhanh có thể phun thuốc trừ bằng các loại thuốc Validacin 3DD, Anvil, Ridomil MZ 72WP, Topsin M 70WP, Rovral 50WP hoặc chế phẩm sinh học Trichoderma. 2.6 Tổng quan về nấm Trichoderma : 2.6.1 Đặc điểm của nấm Trichoderma: Trichoderma là chi khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất. Theo Gary J. Samuels(1932), Trichoderma ít tìm thấy trong thực vật sống và chúng không sống nội ký sinh với thực vật. Ngày nay, hệ thống phân loại của nấm Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Theo Rifai (1969), Barnett H.L v Barry B. Hunter (1972), Trichoderma spp thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes (fungi imperfect); thứ tự vị trí phân loại như sau: Giới : Nấm Ngành : Ascomycota Lớp : Deuteromycetes Bộ : Moniliales Họ : Moniliaceae Giống : Trichoderma spp Hình 2.2: Trichoderma sp. Theo Agrios G.N (1997), Hrman G.E (2002), hầu hết Trichoderma spp có giai đoạn sinh sản vô tính (đây là lý do Trichoderma spp được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn Deuteromycetes, bộ Moniliales), tuy nhiên một vài loài Trichoderma spp. cũng có khả năng sinh sản hữu tính nên được phân vào lớp nấm tíu Ascomycetes, bộ Hypocreales, giống Hypocrea. 2.6.2 Tìm năng của Trichoderma trong phòng trừ sinh học: 2.6.2.1 Quần thể Trichoderma trong đất Trichoderma có khả năng tái tạo quần thể, được xem là một hiện tượng phòng trừ sinh học vẫn chưa được giải thích về cơ chế. Theo Bliss(1959) Trichoderma có khả năng thiết lập quần thể và tái hoạt động rất mạnh mẽ và nhanh trên đất đã được xử lý khử trùng xông hơi bằng cacbon disulfide để diệt nấ, Armillaria mellea trênn cây cam, quýt, nhưng không công bố bằng chứng quần thể Trichoderma phòng chống bệnh. Orh và công tác viên (1973) , cung cấp các bằng chứng xác thực thuyết phục nhất quần thể Trichoderma trong đất có khả năng phòng chống nấm Armillaria mellea trên đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromde, Trichoderma kháng methyl bromide hơn là Acetyl mellea. Các bằng chứng về vai trò của quần thể Trichoderma trong đất được củng cố về vấn đề phòng trừ sinh học như thêm sulfur vào đất để duy trì độ pH dưới 3,9 làm tăng khả năng phòng trừ bệnh thối rễ và thối ngọn dứa ở Úc. Cách phòng trừ bệnh này đã làm giảm túi bào tử của nấm Rhizoctonia solani và làm tăng tính ưa acid của T.longii ( Cook và Baker, 1938). Khả năng hoạt động phòng trừ của trichoderma ở các quần thể tiềm sinh và sợi nấm được công bố trong chỉ phòng thí nghiệm (Ayers,1981; Cook và Baker, 1982) mà còn có trong đất (Hubbard và các công tác viên,1983). Trichoderma có khả năng khuếch tán tính độc của nấm trong phòng thí nghiệm kể các chất hữu cơ trong đất cũng như khả năng kéo dài phòng trừ sinh học của Trichoderma. Ngoài ra, khả năng thứ 2 của nấm Trochoderma là kháng nấm. T. hamatum có nhiều trong đất ở vùng Colombia có khả năng năn chặn nấm R.solani (Chet và Baker,1980-1981) và T. hamatum có nhiều khi phân lập từ đất tại mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất (Lumsden,1977). Dưới nhiệt độ phóng xạ gamma không thể tiêu diệt được nấm này ( Naelson và các công tác Vein,1983), đậy là vai trò của Trichoderma trong phòng trừ sinh học. Khả năng ngăn cản các loài nấm trong đất của đất, đặc biệt là R.solani , Pythium spp. có liên quan đến nấm Trichoderma, đã thành công và được công bố rộng rãi là vấn đề được nghiên cứu trong nhiều năm nay. Các tài liệu Baker (1974,1980) của Barret và các cộng tác viên (1974) , của Cook và Baker (1983) đều công bố khả năng này của Trichoderma. 2.6.2.2 Tính kháng của Trichoderma trong đất: Đây là mật vấn nóng và hấp dẫn được nhiều chuyên gia nghiên cứu trong những năm gần đây. Phòng trừ sinh học bằng cách thêm một số lượng lớn các bào tử t. harizaum cùng môi trường nuôi trồng vào đất được well và các cộng tác viên (1962) thử nghiệm . Các nhà nghiên cứu lân đầu tiên công bố sử dụng một lượng lớn Trichoderma nuôi trong trên môi trường bán rắn ra thử ngoài ruộng kiểm soát các loại nấm gây bệnh trên cà chua. Trong các giống Trichoderma có giống T. harizaum. Nuôi trên môi trường bán rắn có tác dụng chống được các loại bệnh thối trắng trên hành ở Ai Cập (Abd và các cộng tác viên ,1975) ; bệnh chết rạp cây con do Rhizoctonia solani. Hiệu quả phòng trừ sinh học của nấm nuôi trồng trên môi trường bán rắn phụ thuộc vào nhiệt độ, loại môi trường nuôi trồng trên môi trường nuôi trồng và thời điểm cấy nấm vào đất ( Elad và công tác viên,1980) tỷ lê câytrichoderma vào giá thể và mật độ nấm gây bệnh (Hadar và công tác viên 1979). Những vấn đề phức tạp liên quan đến khả năng chống bệnh của Trichoderma cũng được nghiên cứu . Kelley (1976), công bố T.harzianum được cấy vào đất sét với mục đích phòng trừ bệnh chết rạp cây con trên dưa.. Ông ta nhận thấy rằng khả năng kháng bệnh của nấm này phụ thuộc vào dư lượng dinh dưỡng trong đất , đặc biệt trong đất ẩm bệnh chết rạp phát triển rất cao . Khi cấy T.harzianum dạng viên hưu cơ vào môi trường nhiều dinh dưỡng , làm tăng quần thể Pytium, hậu quả là bệnh phát triển trong vườn dây leo (Moody và Gindrat, 1977). Bệnh chết rạp xảy ra khi thêm Trichoderma dạng viên vào trước khi gieo hạt dưa leo. 2.6.2.3 Bào tử nấm Trichoderma trong đất: Với các bào tử phân sinh trần, phương pháp xử lý bằng khử trùng xông hơi hay bay hơi trên đất làm tăng số lượng bào tử trong đất . thí nghiệm phòng trừ bệnh Fusarium trên cây hoa cúc đã được ghi nhận gần đây thêm vào đất dung dịch T. viride kháng thuốc Benomyl. Sử dụng nồng độ 104 bào tử/ cm2 dòng nấm này trộn vào đất sau khi dược khử trùng bằng hơi nước (820C trong 2 giờ), số bào tử của dòng nấm này tăng rất nhanh, nấm gây bệnh cây, không xâm nhập lại vào đất. Các nghiên cứu gần đây (Beagle,1984; Papaviza và Lewis,1983) chỉ ra rằng sản phẩm của phương pháp lên men như dạng bột, bùn than hoặc dạng viên khi cấy vào trong đất không những tăng nhanh số lượng mà còn ngăn cản bệnh hiệu quả hơn là dùng bào tử trần. dạng viên của sản phẩm lên men của T.hamatum, T.haraiam, T.virde, có khả năng làm giảm sự sống sót và sinh trưởng của Rhizoctonia solani trong đất. Cách sử dụng phương pháp lên nấm chắc chắn có ảnh hưởng lớn đến thời gian sống sót của bào tử và nhân sinh khối trong trong đất và tiềm năng phòng trừ sinh học. Dù vậy phương pháp lên men sẽ được sử dụng và cải tiến nhiều trong tương lai cho việc sử dụng nấm kháng trong phòng trừ sinh học. 2.6.2.4 Đặc điểm hình thái về sinh lý: Sinh thái học của Trichoderma cho biết sự phân bố của chúng trong đất Khuẩn lạc Trichoderma spp. Có màu từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục đậm, giống này tăng trưởng rất mạnh: đường kính khuẩn lạc đạt từ 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 250C (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998), khuẩn ty không màu sinh cuống mang bào tử. Cuống bào tử này gọi là bào tử đính dạng hình cầu, hình elip hoặc hình thuôn , màu lục, liên kết nhau nhờ chất nhầy. Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác), chúng cũng tồn tại khi nồng độ CO2 ở mức cao (10%) và sống được ở đất acid và bazơ (pH = 3 – 8). Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và các môi trường khác. Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ. Đất tự nhiên có khả năng kháng nấm và khả năng này mất dần đi. Điều này có liên quan đến sự xuất hiện và mật độ phân bố cơ học của Trichoderma. Bào tử phân sinh của Trichoderma có khả năng kháng nấm cao và liên quan đến hiện tượng làm giảm khả năng kháng nấm trong đất. Độ nhạy của đất kháng nấm được công bố trên đất trung tính, đất kiềm chua và acide. Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hơn hậu mô bào tử, sợi nấm ít kháng nâm hơn bào tử phân sinh Thiết lập quần thể và hiện tượng nảy mầm trong đất: vi sinh vật trong đất hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền trong đất, có nhiều phương pháp xác định khác nhau. Khi sợi nấm non ( chưa có bào tử) vào đất liên quan chặt chẽ với tình trạng thành phần môi trường đất. Bào tử sinh sôi nảy nở và thiết lập quần thể cân bằng trong đất ( mật độ duy trì cân bằng trong đất từ 9-36 tuần sau khi cấy nấm vào đất). Điều này cũng phụ thuộc vào nấm và như vậy có liên quan đến thành phần thức ăn, việc hình thành quần thể sợi nấm. Trichoderma từ thành phần nuôi trồng không liên quan đến loại đất. Thiết lập quần thể tại vùng rễ cây: Trichoderma được phân lập tại vùng rễ cây chính vì thế chúng có thể dùng vào việc phòng trừ sinh học đối với bệnh ở vùng rễ cây. Hiệu quả của Trichoderma không chỉ xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh hệ rễ tạo các bào tử xâm nhiễm cây trồng. Nếu Trichoderma được cây vào trong đất để ngăn bệnh cho cây trồng thì bắt buộc phải cấy theo bề mặt rễ cây. Trichoderma có khả năng trong việc phòng chống bệnh thốii rễ cây, hạt và bệnh cây chết non. Quan sát bào tử trên vùng rễ cây gồ: rễ, vỏ hạt bị thối và lá mầm, số lượng bào tử trên mỗi gram đất luôn luôn ít . Chao, Harama và Nelson (1983) cho biết Trichoderma ít thiết lập quần thể hay ít di chuyển vào vùng rễ cây . Ngược lại, số lượng bào tử tìm thấy nhiều trên lá mầm , đậu bị thối, vỏ hạt giống kể cả mẫu bệnh xung quanh rễ. 2.6.2.5 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma: Nấm đối kháng là những thành viên quan trọng trong hệ vi sinh vật ( Pomch và công tác viên, 1920). Chúng thường tiết ra các men kháng sinh gây độc đối với các nâm gây bệnh hoặc nấm kháng cạnh tranh điều kiện sống với các nấm gây bệnh. Sự phân biệt của chúng dựa vào điều kiện địa lý, tình trạng đất , dinh dưỡng và các điều kiện về sinh trưởng và phát triển và thảm thực vật trong từng khu vực. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự phát triển của nâm gây bệnh , giúp cây hồi phục sinh trưởng và phát triển. Một số loài nấm đối kháng được tìm thấy như: Penicillin axalicum, P.Vermiculata, P.Chregsogtum ,Trichoderma sp, là đối kháng của nấm gây bệnh: Fusarium, Pythium Rhizoctonia solani...( Martin và các cộng tác viên ,1995) 2.6.2.6 Cơ chế đối kháng của nấm Trichoderma: Sự đối kháng của nấm trichoderma thông qua nhiều cơ chế. Vào năm 1932, Weidling đã mô tả hiện tượnh nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh nên đặt tên cho hiện tượng là “ giao thoa sợi nấm” ( cnyder,1976). Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như : (1) sợi nấm Trichoderma vây quanh nấm gây bệnh, (2) sau sự bao quanh, sợi nấm trichoderma thắt chặt đấn các sợi nấm gây bệnh, (3) cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên qua các sợi nấm gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấm gây bệnh bị phân hủy dẫn đến nấm bệnh bị chết. Sau này khi quan sát dưới kính hiể vi thì hiện tượng trên được mô tả như sau: tại những điểm nấm Trichodrma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm cho nấm gây bệnh teo lại và bị chết ( Dubey,1995). Ngược lại ở những chỗ nấm không tiếm xúc với nâm gây bệnh thì nấm vẫn chết mặc dù không tiếp xúc với Trichoderma. Từ đó Agrowcal và các cộng sự (1979,1996) đã khẳng định rằng Trichoderma có khả năng tiết ra chất gây độc làm chết các loại nấm gây bệnh. 2.6.2.6 Các hệ enzyme trao đổi của Trichoderma Trichoderma có thể sinh rất nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease, … để phân hủy xác thực vật và tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình ở Trichoderma. Hệ enzyme cellulase: Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D-glucose nối nhau bởi liên kết beta-1,4-glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase. Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp được phân thành ba lớp: Beta-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose. Endo-1,4-D-glucanase phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc cellulose. Beta-1,4-D-glucanase phân cắt cello-oligosaccharide thành glucose khử. Quá trình thuỷ phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất l hai Enzyme chlobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme beta-glucosidase (Hui et al. 2001), Trichoderma reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, Trichoderma hazianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả khi sử dụng để kiểm soát đối với Pythium, chủng này được biết cũng tạo nhiều loại enzyme cellulase. Hệ enzyme chitinase: Chitin l polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polyme ở nấm và côn trùng, công thức hóa học: [C8H13NO5]n. Công thức cấu tạo: Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên, chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, alcol, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. Enzyme chitinase l thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị: beta-1,4-N-acetylglucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân thành 3 lớp (Sahai và Manocha, 1992): Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetylchitobiose. Endochitinase: phân cắt liên kết bền trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose, diacet lchitobi- - ose; endochitinase được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình kí sinh nấm. Beta-1,4-N-acetylglucosaminedase: phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer. Glucosamine là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. Người ta đã tinh chế được rất nhiều enzyme chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N-acetyl-b-D-glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra cũng có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và cộng sự, 1992), chitobiosidase kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28 kDa (Dean và cộng sự, 1998), beta-1,4-N-acetylglucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây ra sự biểu hiện của các enzyme thủy phân chitin khác nhau nhưng chưa được tinh chế (Harman và cộng sự, 1995). Enzyme chitinase của Trichoderma spp được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như beta-glucanase, sự phối hợp với các enzyme phân giai chitin và glucan đã dẫn đến sự tăng cường hoạt động thủy phân. Tuy nhiên, quan trọng hơn là chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản chất enzyme. Theo báo cáo của Lorito và các cộng sự (1994), cho biết có sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme thủy phân chititn với các hợp chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào (MAC). Hệ enzyme beta - glucanase Beta – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng beta-1,3-glucan và phần nhánh là dạng beta-1,6-glucan, beta-glucanase cũng là một hệ enzyme quan trọng của Trichoderma spp trong đặc tính kí sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: beta-1,3-glucannase v beta-1,6-glucanase. Beta-1,3-glucanase:là enzyme phân cắt liên kết O-glycosidic của beta-1,3-glucan nhờ 2 cơ chế: Exo-beta-1,3-glucanase phân cắt giải glucose ở cuối chuỗi liên kết polyme. Endo-beta-1,3-glucanase cắt lin kết beta ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide, giải oligosaccharide. Trichoderma spp. phân giải beta-1,3-glucan thường kết hợp giữa hai hoạt tính exo và endo-1,3-glucanase, beta-1,3-glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra beta-1,3-glucanse giúp thực vật chống lại mầm bệnh. Các vách tế bào nấm bệnh khác nhau cho chất tạo ra những mức độ hoạt tính khác nhau của enzyme beta-glucanase, bằng chứng trực tiếp cho thấy sự liên quan của beta-glucanase đối với sự ký sinh đã được chứng minh bởi Lorito và cộng sự (1994), và đã tách chiết invitro được một endo-beta-1,3-glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm của một số bào tử khi phối hợp với một GlcNAcase. Ở một số chủng khác nhau như chủng T – 24, người ta cũng tách chiết được một endo-beta-1,3-glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rofsii khi kết hợp với một ensochitinase 43 kDa (El-Katatny v cộng sự, 2001), T. har CECT 2413 cho thấy có thể tạo ra ít nhất enzyme beta-1,3-glucanase ngoại bào, Lora và cộng sự (1995) đã tạo dạng gen và cDNA của một beta-1,6-endoglucanase có kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác. Beta-1,6-glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp tiết beta-1,6-glucanase, enzyme này phân cắt liên kết beta-1,6-glucan trong vách tế bào nấm. Hệ enzyme protease Theo Delgado và Jarana (2000) khi khảo sát trên Trichoderma harvey đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc điều kiện môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon, … T.har tiết ra protease acid như là tác nhân điều hòa, để đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase, ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được T.har sinh ra trong môi trường có nguồn C khó bị phân hủy như vách tế bào nấm. Người ta đã tách chiết được một protease 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase (Haab và cộng sự, 1990). Trong một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000), một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin đã được tách chiết từ việc nuôi cấy T. har. Protease của Trichoderma spp có vai trò trong việc tấn công ký chủ bằng cách thủy phân protein vốn l một phần của bộ khung vách tế bào. 2.6.3 Vai trò của nấm Trichoderma trong việc phòng trị bệnh cây 2.6.3.1 Mối tương tác giữa nấm Trichoderma và tác nhân gây bệnh cây Hình 2.3: Hoạt động tương tác giữa nấm ký sinh Trichoderma và nấm ký chủ. Giai đoạn 1: Nấm ký sinh tiết ra các hợp chất polymers tiến đến ký chủ. Giai đoạn 2: Csinhghaeác sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp (do vách tế bào ký chủ bị phân hủy) tiến đến ký chủ và hoạt hóa gene hoạt động của nấm ký sinh (trích từ Vinale & ctv., 2008). Trichoderma (giai đoan hữu tính là chi Hypocrea) là loại nấm sinh sản vô tính được tìm thấy trong đất của mọi vùng khí hậu. Loài nấm này có tốc độ sinh phân hủy vách tế bào (cell wall degrading enzymes, CWDEs) như: cellulases, chitinases, glucanases... đồng thời cũng là nhà máy sản xuất kháng sinh quan trọng. Đa số các dòng nấm Trichoderma sống quanh rễ được ứng dụng trong nông nghiệp đều có khả năng phân cắt các carbohydrates, chlor phenols và các loại nông dược chứa xenobiotic (Harman & Kubicek, 1998; Harman & ctv., 2004). Cơ chế tác động chính của nấm Trichoderma là ký sinh (Harman & Kubicek, 1998) và tiết ra các kháng sinh (Sivasithamparam & Ghisalberti, 1998) trên các loài nấm gây bệnh trưởng nhanh, sản sinh nhiều bào tử và là nguồn sản xuất các loại enzymes. Quá trình ký sinh của nấm Trichoderma diễn ra khá phức tạp, bao gồm việc nhận ra ký chủ, tấn công, xâm nhập và tiêu diệt. Trong suốt tiến trình này, nấm Trichoderma tiết các enzymes phân hủy vách tế bào (CWDEs) thủy phân vách tế bào của nấm ký chủ thành các oligomers đơn giản hơn (Kubicek & ctv., 2001; Woo & ctv., 2006). Tác động này là do khả năng cảm ứng của chúng đối với các phân tử tiết ra từ sự hiện diện của ký chủ để tiết ra các enzymes phân hủy (Harman & ctv., 2004) Các loài nấm Trichoderma spp. đối kháng hữu hiệu đều chứa nhiều loại enzymes phân hủy nên giử vai trò quan trọng trong việc phòng trừ sinh học (Harman và Kubicek, 1998; Kubicek & ctv., 2001). Lorito (1998) đã tinh chế và khảo sát đặc tính của các enzymes phân hủy vách tế bào (CWDEs) của các dòng nấm Trichoderma. Kết quả cho thấy dù thử nghiệm riêng lẻ hay phối hợp, các protein này đều có khả năng đối kháng các loài nấm bệnh với phổ rất rộng trên các chi Rhizoctonia, Fusarium, Alternaria, Ustilago, Venturia, Colletotrichum và ngay cả với các loài thuộc lớp Oomycetes như Pythium và Phytophthora (với vách tế bào bị thiếu chitin). Việc áp dụng các loài vi sinh đối kháng để phòng trừ sinh học tõ ra có nhiều lợi ích trong nông nghiệp vì các tác nhân đối kháng này tiếp tục sinh sản và phát triển sau khi áp dụng. Tuy nhiên, việc áp dụng cần chọn các dòng chuyên biệt phù hợp cho môi trường phát triển như nhiệt độ, pH, ẩm độ… (Lorito và Scala, 1999). Các tác nhân này sẽ tiết CWDEs khi có nguồn carbon như mono-hay polysaccharides, keo chitin hay khi có tế bào nấm bệnh. Trong nhiều trường hợp, sự phối hợp giữa các loài Trichoderma mang nhiều enzyme đối kháng đã cho hiệu quả cao hơn trong việc phòng trị bệnh cây, ngay cả khi so với các loại thuốc trừ bệnh tổng hợp (Baek & ctv., 1999; Carsolio & ctv., 1999). Ở nấm Trichoderma spp., người ta đã tìm được 18 loại kháng sinh do chúng tiết ra (Vinale & ctv., 2008). Các kháng sinh có trọng lượng phân tử cao và các peptaibols đều phân cực và có ảnh hưởng nhiều đến hoạt động tạo khuẩn ty của các vi sinh vật. Khi khảo sát loài T. harzianum tiết ra β-glucanases ký sinh trên nấm bệnh, Lorito & ctv. (1996) đã xác định được chất kháng sinh thuộc nhóm peptaibols ức chế khả năng tổng hợp β-glucans của nấm ký chủ, làm chúng không thể tái tạo được vách tế bào, giúp enzyme β-glucanases hoạt động hiệu quả hơn. Nấm Trichoderma hoạt động mạnh, hấp thụ nhiều dinh dưởng (C, N và các dưởng chất khác) nên cũng cạnh tranh với các cộng đồng vi sinh vật đất khác. Tác động sinh học của môi trường đất cũng ảnh hưởng đến khả năng phòng trừ sinh học của nấm Trichoderma. Bae và Knudsen (2005) cho biết khi được xử lý trên môi trường có hệ vi sinh vật đất phong phú, loài T. harzianum thường có khuynh hướng tạo bào tử (thay vì là khuẩn ty) làm giảm hiệu quả phòng trừ sinh học. Hiện tượng này được gọi là "soil fungistasis", tùy thuộc vào thành phần của cộng đồng vi sinh vật có trong đất và tùy vào khả năng tiết kháng sinh của nấm Trichoderma. Điều này cũng đã làm hạn chế hiệu quả của một số dòng nấm khi áp dụng vào thực tế sản xuất nông nghiệp. T. longi T. har T.vir Hình 2.4: các loại Trichoderma spp tác động lên loài nấm R.solani gây bệnh được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Hình 2.5: Sự tác động của Trichoderma lên các tác nhân gây bệnh (Pythium) 2.6.3.2 Mối tương tác giữa nấm Trichoderma và thực vật Ngoài hiệu quả trực tiếp trên các tác nhân gây bệnh cây, nhiều loài Trichoderma còn định cư ở bề mặt rễ cây giúp thay đổi khả năng biến dưởng của cây, nhiều dòng nấm đã kích thích sự tăng trưởng của cây, gia tăng khả năng hấp thụ dinh dưởng, cải thiện năng suất cây và giúp cây kháng được bệnh (Harman & ctv., 2004). Khi ứng dụng vào phòng trừ sinh học, sợi nấm Trichoderma có khả năng xâm nhiễm vào vỏ rễ, nhưng liền sau đó đã bị chất callose tiết ra từ rễ ức chế ngay lập tức. Đặc tính này khác hẳn sự ký sinh giữa nấm bệnh và cây trồng và đã giúp nấm cộng sinh bảo vệ bộ rễ cây, kích thích cây phát triển đồng thời còn giúp cây tăng khả năng hấp thụ dinh dưởng (Yedidia & ctv., 2003; Harman & ctv., 2004). Các loài nấm Trichoderma spp. cũng tiết ra các acid hữu cơ như gluconic, citric hay fumar