Đồ án Đánh giá hiệu quả phòng trừ của chế phẩm Chitosan đối với tuyến trùng hại tiêu tại Bình Phước

P. Việc quản lý tuyến trùng nói riêng và dịch hại hồ tiêu nói chung đã có nhiều chuyển biến. Các biện pháp được thực hiện theo hướng quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) Canh tác: Đào mương thoát úng trong vườn tiêu triệt để. Đây là biện pháp rất quan trọng để hạn chế bệnh nấm trong đất. Phủ rác hoặc cây xanh trong vườn tiêu, không để mặt đất trơ bị rửa trôi, xói mòn. Dùng choái tiêu sống, có thể dùng cây neem làm choái thay cho cây vông (cây vông hiện nay bị một loại ong đục ngọn, gây chết rất nghiêm trọng). Phân bón: Bón phân hữu cơ có chất lượng ủ hoai triệt để, và phân hữu cơ sinh học là chính (phân bón gốc, bón lá). Chỉ bón thêm phân hóa học cho cân đối dinh dưỡng. Biện pháp này tạo dinh dưỡng tối ưu cho cây tiêu phát triển, tạo sức đề kháng sâu bệnh cho cây, kìm hãm rất hiệu quả nguồn nấm bệnh và tuyến trùng có từ trong đất. Sử dụng thuốc BVTV: Dùng nấm đối kháng Trichoderma bón vào đất (ủ chung với phân bón), phun Trichoderma nước vào đất và phun lên cây để trừ nấm bệnh. Bón bã dầu neem cùng với phân bón. Sử dụng chất kích thích tính kháng. Sử dụng thuốc trừ sâu sinh học. Sử dụng thuốc hóa học hạn chế khi thật cần thiết, không đổ thuốc độc hóa học xuống gốc tiêu. Mô hình IPM/ICM nói trên là biện pháp chẳng những rất có hiệu quả quản lý dịch hại trên cây hồ tiêu mà còn làm tăng chất lượng của sản phẩm hồ tiêu Việt Nam hiện nay. Hướng giải quyết vấn đề kiểm soát mầm bệnh và bảo vệ đất đai: Tiến sĩ Paul Sultie (người mỹ) chuyên gia nghiên cứu độ phì nhiêu của đất đã đưa ra quan điểm: Quản lý đất đai tổng hợp và cây trồng (IPSM : Integrated Plant Soil Management). Hướng giải quyết này lúc đầu chưa được chú ý nhiều, nhưng sau đó không những các nhà khoa học mà nông dân ngày càng quan tâm ủng hộ nhiều hơn nhờ tính xác thực của nó. Theo nguyên lý của TS. Paul Sultie, giải quyết vấn đề tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật và phân bón vô cơ có 2 cách như sau: - Dùng tác nhân sinh học để làm vệ sinh đất, giúp lông hút của cây trồng không bị sự cản ngại của tuyến trùng và các mầm bệnh, để có thể hút hữu hiệu phân bón và nước sẵn có trong đất hoặc được cung cấp vào. Nhờ vậy giảm hẳn nhu cầu bón đạm của cây trồng cạn. - Dùng tác nhân sinh học để khởi động trực tiếp hoạt động của rễ và khởi động hoạt động của vi sinh vật vùng rễ, giúp cho đất tơi xốp, dễ thoát hơi nước, hòa tan lân, vi lượng, phân hủy hữu cơ… và vì vậy sinh khối rễ tăng lên, nuôi được thân rễ, củ, quả, lá tốt hơn. Sinh khối rễ gia tăng cũng có nghĩa là đã bón hữu cơ vào trong đất. Bên trên mặt, nếu là các loài cây trồng được thu hoạch hết như các loại rau cải, ta cần bón loại phân hữu cơ. Nếu còn dư thừa xác bã ta cần vùi hoặc ủ phân để tái tạo nhu cầu mới. Với nhiều tiến bộ của khoa học kỹ thuật ngành công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp, người ta nghiên cứu sản xuất ra nhiều chế phẩm phân bón, thuốc trừ sâu sinh học có hiệu quả cao. Đặc biệt là các chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc từ cây Neem (Azadirachta Indica A.Juss) tên Việt Nam là xoan chịu hạn rất được chú ý. Các hoạt chất sinh học từ hạt Neem có tác dụng diệt trừ sâu rầy, tuyến trùng phá rễ và không độc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, người dân có thể dễ dàng tự cách chiết dầu Neem để phun xịt, diệt trừ vật gây hại hoa màu. 1.3. Các nghiên cứu chiết xuất và sử dụng Chitosan 1.3.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - Chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (đứng thứ hai sau xenllulose). Trong tự nhiên Chitosan tồn tại trong cả động vật và thực vật. Trong động vật, Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số loài động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp sát và giun tròn. Trong động vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liến các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin - Chitosan là polysacharit có đạm không độc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối đẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1.1 – Chitin, Chitosan và vỏ tôm Trong các loài thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao dao động từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin – chitosan. Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập được một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. 1.3.2. Tính chất lý hóa và độc tính của chitosan Cấu trúc hóa học. Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan rất đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổi nhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là Chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vị 2-amino-2-deoxy-b-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết b- (1-4) glucozit. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: MChitosan = (161,01)n Công thức cấu tạo của Chitosan: Hình 1.2 – Công thức cấu tạo Chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-b-D-glucose; Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-b-D-glucopyranose,3 Qua cấu trúc của Chitin – Chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt động là –OH (H ở nhóm hydroxit bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn Chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH và –NH2, do đó, Chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn Chitin. Trong thực tế các mạch Chitin – Chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. Hình 1.3 – Chitin, Chitosan và một số dẫn xuất Tính chất hóa học. Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt độ nóng chảy 309 – 3110 C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hòa tan được trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic..., tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch axit acetic 1 – 1,5%. Độ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãnh liên quan đến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (đây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polime). Chitosan kết hợp với aldehit trong điều kiện thích hợp để hình thành gel, đây là cơ sở để bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit đậm đặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với Iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Tính chất sinh học. Chitosan không độc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u. Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid trong máu, hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptit – insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan đã được dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư, chống tia tử ngoại, chống ngứa... của chitosan. Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định Chitosan hầu như không độc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn. Nghiên cứu tiêm Chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã kết luận: Chitosan là vật liệu hòa hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô. Dùng Chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích lũy ở gan. Loại chitosan có DD » 50%, có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều tác giả đã chỉ rõ những lợi điểm của Chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất của Chitosan ở Việt Nam và trên thế giới Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh, trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chất chitin này, họ có thể chiết tách thành chất chitosan để ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: hoá dược, mỹ phẩm và đặc biệt trong ngành dược phẩm, chất chitosan đã hỗ trợ đắc lực trong việc bào chế ra rất nhiều sản phẩm thuốc chữa được nhiều loại bệnh khác nhau. Trước đây, người ta thử chiết tách Chitosan từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không đủ đáp ứng cho nhu cầu sản xuất. Trữ lượng Chitosan phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian các chất phế thải này không được thu hồi mà thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977, Viện Kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của chitosan và protein trong vỏ tôm, cua đã cho thấy việc thu hồi chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần protien thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn phần Chitosan sẽ được dùng như một chất khởi đầu để diều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp. Năm 1961, nhà khoa học Nga BousBeloisov đã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ Chitosan. Các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm tiêm thuốc cho động vật chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ, kết quả cho thấy, khả năng sống sót tới 45%. Rất tiếc, trong thảm hoạ hạt nhân Chernobyl năm 1968, các thuốc chống xạ trên chưa được công bố rộng nên không được áp dụng cứu người. Đến sau thảm hoạ tàu nguyên tử Komsomlets, các nhà khoa học đã lên tiếng kêu gọi nên sử dụng chitosan làm vật liệu kết cấu trong xây dựng các lò phản ứng nguyên tử và làm vỏ cách ngăn cho các con tàu nguyên tử. Tại Nhật Bản, năm 1975, Chitosan đã được đưa vào làm chất xúc tác để xử lý nước thải. Hiện nay, các hãng mỹ phẩm trên thế giới đã ứng dụng thành phần chitosan vào hàng loạt các sản phẩm của mình. Chúng ta có thể tìm thấy chất này trong các sản phẩm kem đánh răng, kem chống nắng, phấn mắt, nước xúc miệng, kẹo chewing-gun... Riêng hãng Mỹ phẩm Wella đã dùng Chitin-Chitosan trong ít nhất 15 sản phẩm bảo vệ tóc, và hãng Shiseido, thương hiệu nổi tiếng có mặt nhiều năm tại thị trường Việt Nam cũng đã dùng chất này trong 13 sản phẩm mỹ phẩm của hãng. Thế giới ngày càng có xu hướng sử dụng dược phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, trong nhiều năm qua, các nhà khoa học trên thế giới và cả ở Việt Nam đã tích cực nghiên cứu chiết tách chitosan từ hàng ngàn tấn vỏ tôm đang được thải ra tại các cơ sở chế biến đông lạnh, để sản xuất ra nhiều loại thuốc điều trị bệnh phục vụ cho cuộc sống con người. Điển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin đang được thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng, không độc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh. Vì thế, chỉ trong năm 1998, nước Mỹ đã tiêu thụ được hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Thậm chí tại các siêu thị, thuốc bán không cần đơn, chúng được coi như một loại thực phẩm chức năng. Những năm gần đây, loại thuốc chữa khớp này còn đựợc phổ cập rộng ở nhiều nước như: Nhật, Pháp, ấn Độ, Thái Lan và cả Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan và ứng dụng trong sản xuất phục vụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 – 1980 Trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của Kỹ sư Đỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần đây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đông lạnh đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay, ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Trung tâm nghiên cứu Polyme – Viện Khoa học Việt Nam, Viện Hóa thuộc Phân viện Khoa học Việt Nam tại TP.HCM, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. Ở Miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và đã thu được một số kết quả đáng khích lệ. Ở Miền Nam, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại học Y dược TP.HCM, Phân viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam,... đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng Chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm. 1.3.4. Ứng dụng của chitosan trong BVTV Một trong những tồn tại lớn của sản xuất nông nghiệp đang được quan tâm hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học. Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ đi ngược lại mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta đang nỗ lực tiến tới. Để góp phần hạn chế tồn tại trên, nhiều chế phẩm BVTV có nguồn gốc sinh học đã được đăng ký sử dụng. Tuy vậy, trong thực tế sản xuất, việc sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng trừ sâu bệnh còn nhiều hạn chế. Một trong những lý do chủ yếu là các chế phẩm sinh học thường chỉ được sử dụng riêng lẻ với mục tiêu diệt trừ ngay sâu bệnh khi chúng đã phát sinh gây hại. Kết quả là trong đa số các trường hợp hiệu quả diệt trừ sâu bệnh tỏ ra không bằng so với sử dụng thuốc hóa học nên chưa được nhiều nông dân chấp nhận. Để hiệu quả phòng trừ sâu bệnh hại của các chế phẩm sinh học thể hiện rõ, các chế phẩm sinh học cần phải được sử dụng theo quy trình xác định trong từng điều kiện cụ thể. Theo nghiên cứu của Halina Kurzawinska (2007) Khoa bảo vệ thực vật trường Đại học Nông nghệp Ba Lan chứng minh rằng: Ảnh hưởng lớn của Chitosan trong việc bảo vệ rau và cho rằng bệnh về rễ (Pythium của Dưa chuột) được khống chế khi sử dụng chitosan sử dụng với liều lượng 100 - 400 mg/ml. Biochikol 020 PC khi được tưới vào đất thì tốt hơn việc xịt lên cây để chống các loài nấm thuộc dòng Phytopthora và Fusarium. Ngoài ra chitosan là hoạt chất của Biochikol 020 PC và hoạt động kích thích miễn dịch của cây, chống lại hoạt động của nấm tác động đến cây. Chitosan còn là nhân tố giúp cây có phản ứng tự vệ ở trong cây. Khi phun lên lá và tưới gốc, Chitosan được cây hấp thụ nhanh và lưu dẫn trong toàn cây. Chitosan kích thích hoạt động của hệ thống kháng bệnh trong cây, giống như một loại vắc xin thực vật, tăng khả năng đề kháng của cây với các loài vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả nấm, vi khuẩn, tuyến trùng và virus. Ngoài ra, khi tiếp xúc với vi sinh vật, chất Chitosan có thể phá hủy màng tế bào làm vi sinh vật không phát triển được. Chitosan còn có tác dụng như một chất kích thích tăng trưởng cây trồng.     Ở nước ta hiện nay chất Chitosan bước đầu đã được đăng ký phòng trừ nhiều loại bệnh cho nhiều loại cây trồng như các bệnh đạo ôn, đốm vằn, bạc lá, lem lép hạt hại lúa, bệnh sương mai hại dưa, bắp cải, khoai tây, thán thư hại ớt, bệnh héo rũ, lở cổ rễ, bệnh chết nhanh hồ tiêu, bệnh gỉ sắt cà phê, bệnh thối quả xoài, bệnh do tuyến trùng trên nhiều loại cây như thanh long, cà phê, hồ tiêu, chè, hoa cúc, hoa huệ… Đối với cây có múi, chất Chitosan có thể hạn chế tác hại nhiều loại bệnh như thán thư, loét, tuyến trùng… Ngoài ra, Chitosan còn được sử dụng kích thích sinh trưởng cho nhiều loại cây như lúa, cà chua, chè, mía... Khi phun lên cây dung dịch được pha với nồng độ 0,1 – 0,3%, phun phòng bệnh với nồng độ thấp hơn khi phun trừ bệnh (Nguyễn Mạnh Hùng và Phạm Anh Cường Nam, 2006). Các kết quả thử nghiệm cho thấy, Chitosan hoàn toàn không độc với người và môi trường nên đã được phép sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và trên thế giới. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ Chitosan đã được đăng ký sử dụng ở Việt Nam như: thuốc trừ bệnh Olicide, humb 0.5 SL (hoạt chất Chitosan) phòng trừ bệnh sương mai cà chua, thán thư ớt, đốm vàng dưa leo, phấn trắng bí xanh (dẫn theo Cục Bảo vệ Thực vật, 2008). CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu Mật độ của tuyến trùng trong vườn tiêu bị hại tại Bình Phước. Hiệu quả của Chitosan trong việc phòng trị tuyến trùng hại tiêu. Độc tính của Chitosan đến cây hồ tiêu. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu Giống tiêu: Tiêu sẻ tại Bình Phước. Dụng cụ thí nghiệm: Phễu lọc, giá đỡ phễu, giấy lọc, ống cao su, rây lọc (bằng sắt), kính hiển vi, đĩa petri, cốc thủy tinh, cân phân tích, bình phun thuốc. Thuốc BVTV: Abamectin 5 WP. Sincocin 0.56 SL: 0,2 % Oligo Sacarit (Chitosan): 50 g/lít (được Cục Bảo Vệ Thực Vật nhập nội từ Trung Quốc) 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được bố trí dưới dạng khảo nghiệm diện rộng. Khảo nghiệm được bố trí trên những khu vực trồng cây tiêu đang có biểu hiện bị tuyến trùng gây hại (vàng lá, còi cọc). Các điều kiện trồng trọt như đất đai, phân bón, mật độ cây, chế độ chăm sóc… được tiến hành đồng đều trên mọi ô khảo nghiệm và phù hợp với tập quán canh tác của địa phương. Khảo nghiệm được chia thành 8 lô, mỗi ô có 10 cây (10 nọc), tổng số lượng cây tiêu thí nghiệm là 80 cây, gồm 7 lô sử dụng thuốc và một lô đối chứng không xử lý thuốc được trình bày như sau: Nghiệm thức Nồng độ sử dụng Cách xử lý 1 Chitosan 0,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 2 Chitosan 1% Tưới vào gốc + phun lên lá 3 Chitosan 1,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 4 Chitosan 0,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 5 Chitosan 1% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 6 Chitosan 1,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 7 Sincocin 0.56 SL (0,2 %) Tưới đẫm quanh gốc 8 Đối chứng Không tưới Chitosan và không phun thuốc Phương pháp xử lý: Đào rảnh xung quanh gốc cây (cách gốc khoảng 20 cm), sau đó tưới thuốc vào rảnh với liều lượng 1 lít/gốc (tránh nước chảy tràn ra ngoài) rồi lấp đất lại. Sau khi xử lý thuốc dưới gốc, dung dịch (cùng nồng độ với dung dịch tưới dưới gốc) được phun ướt đều trên tán lá tiêu cũng với liều lượng 1 lít/gốc. Mẫu rễ và đất được lấy cố định trên 3 cây tiêu thí nghiệm. Mỗi công thức theo dõi 10 cây tiêu. Phương pháp theo dõi thí nghiệm: - Đếm mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và đất ở các thời điểm trước lúc xử lý thuốc và 5, 15, 30 ngày sau khi xử lý thuốc. - Cách lấy mẫu rễ và mẫu đất: Mỗi công thức chọn cố định 3 cây để lấy mẫu rễ và đất bằng cách đào xung quanh vùng cây cách gốc 50 cm, sâu 15 cm. Mỗi cây lấy 3 điểm theo hình tam giác đều mà gốc cây là trung tâm. Trộn tất cả các mẫu của 3 cây trong cùng một công thức lại với nhau, sau đó lấy ra 1 mẫu đựng trong bao nilông dán nhãn để phân tích . - Phương pháp xác định tuyến trùng. Tuyến trùng trong rễ và trong đất được lọc bằng phương pháp phễu lọc Bermann. Trong rễ: Rửa sạch mẫu rễ dưới vòi nước mạnh, để khô và cân 0,5 gam rễ rồi cắt thành từng đoạn dài 0,5 cm. Đặt mẫu bệnh vào phễu, phía dưới đặt một cái rây và một lớp giấy lọc phía trên, cổ phễu được gắn ống cao su có kẹp ở cuối ống. Đổ nước từ từ vào miệng phễu sao cho nước vừa ngập mẫu rễ và tiến hành lọc trong 24 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng. Khi đã đủ thời gian, ta sẽ mở kẹp và lấy ra 10 ml nước chứa tuyến trùng cho vào đĩa petri sạch, dùng kính hiển vi có độ phóng đại 4X/ 0.10 để đếm số lượng tuyến trùng. Trong đất: Cân 10 gam đất cho vào lớp giấy lọc sau đó đặt vào phiễu và lọc như phương pháp lọc rễ. Hiệu lực của thuốc Hiệu lực của thuốc được tính theo công thức Henderson – Tilton (1955) Q (%) = .100 Trong đó: Ta: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm sau xử lý. Tb: Mật độ tuyến trùng của lô thí nghiệm trước xử lý. Ca: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng sau xử lý. Cb: Mật độ tuyến trùng của lô đối chứng trước xử lý. Độc tính của thuốc đối với cây tiêu Nếu cây tiêu có biểu hiện ngộ độc thì cần quan sát nhiều lần cho đến khi cây phục hồi hoặc chết. Các triệu chứng ngộ độc có thể đánh giá bằng mắt như biến vàng, cháy, biến dạng… thì ước lượng độ độc cho toàn ô dựa theo thang đánh giá sau. Cấp Triệu chứng 1 Cây bình thường. 2 Triệu chứng ngộ độc rất nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 3 Triệu chứng ngộ độc nhẹ, nhưng thấy được bằng mắt. 4 Triệu chứng ngộ nặng hơn (ví dụ mất diệp lục) nhưng có thể chưa ảnh hưởng đến năng suất. 5 Cây biến màu, cháy lá nặng. Có ảnh hưởng đến năng suất. 6,7,8,9 Thiệt hại cho đến mức cây chết hoàn toàn. Nguồn: TCN 579 – 2003 Chỉ tiêu quan sát - Mật độ tuyến trùng (số tuyến trùng/10ml dịch lọc) - Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng (%) - Độc tính của thuốc Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphic 7.0 để xử lý số liệu CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật độ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và trong mẫu đất ở các thời điểm Trước khi xử lý thuốc, hầu hết các lô tiêu đều có hiện tượng cây bị vàng lá, rễ có nốt sưng... Theo các tác giả, đây chính là bệnh do tuyến trùng Meloidogyne spp. gây ra (Nguyễn Văn Biên và CTV, 2003; Nguyễn Thơ, 2008). Như vậy, liệu trong thí nghiệm này, tuyến trùng Meloidogyne spp. có mặt hay không và với mật số như thế nào? Kết quả theo dõi được trình bày như sau: Trước khi xử lý thuốc Bảng 3.1 – Mật độ tuyến trùng trước lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 7 ± 1,53 27 ± 2,08 2. Chitosan nồng độ 1% 10 ± 1.53 32 ± 2,08 3. Chitosan nồng độ 1,5% 9 ± 2 34 ± 2 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 13 ± 2,51 92 ± 3,06 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 8 ± 2,08 58 ± 7,23 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 11 ± 1,53 99 ± 2,08 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 9 ± 1,53 62 ± 1,53 8. Đối chứng 7 ± 1 21 ± 2,08 Ghi chú: Biện pháp xử lý: tưới vào gốc Kết quả theo dõi ở bảng 3.1 cho thấy, tuyến trùng có mặt ở trong rễ của tất cả các cây tiêu ở các công thức thực nghiệm. Trong rễ, mật độ tuyến trùng biến động từ 7 – 13 con/10 ml dịch lọc. Tương tự, mật độ tuyến trùng trong đất cũng rất cao và phân bố ở tất cả các công thức. Điều này cho thấy, tuyến trùng Meloidogyne spp. rất phổ biến trong đất và trong rễ cây tiêu có biểu hiện bị bệnh tại vùng thí nghiệm với mật độ khá cao Hình 3.1: Hình lấy mẫu đất và mẫu rễ để quan sát tuyến trùng Hình 3.2: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc rễ ở lô đối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) Hình 3.3: Mật độ tuyến trùng trong dịch lọc đất ở lô đối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) Hình 3.4: Mẫu rễ tiêu sau khi cắt thành đoạn dài 0.5 cm Hình 3.5: Lọc tuyến trùng trong mẫu rễ cây tiêu Hình 3.6 : Mẫu đất (10 gam) dùng để lọc tuyến trùng Hình 3.7: Lọc tuyến trùng trong mẫu đất trồng tiêu Sau khi xử lý thuốc 5, 15 và 30 ngày, rễ và đất xung quanh gốc tiêu được lấy mẫu để kiểm tra sự hiện diện của tuyến trùng. Kết quả được trình bày ở các bảng sau: Sau 5 ngày xử lý thuốc Bảng 3.2 – Mật độ tuyến trùng sau 5 ngày lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ Đất 1. Chitosan nồng độ 0,5% 1 ± 0,58 12 ± 1 2. Chitosan nồng độ 1% 2 ± 1,53 28 ± 1,53 3. Chitosan nồng độ 1,5% 0 ± 0,58 27 ± 1,53 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng độ 0.5% + 2% 0 ± 0,58 42 ± 1 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1% + 2% 0 ± 0,58 23 ± 13,45 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng độ 1,5% + 2% 0 ± 0 46 ± 2 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 0 ± 0,58 26 ± 2,65 8. Đối chứng 8 ± 1 27 ± 2 Số liệu trình bày ở bảng 3.2 và đồ thị 1 cho thấy: - Trong rễ: Mật độ tuyến trùng rất thấp trong dịch lọc rễ tiêu ở nghiệm thức 1(Chitosan 0,5%) và nghiệm thức 2 (Chitosan 1%). Trong dịch lọc rễ của các nghiệm thức 3 (Chitosan 1,5%), nghiệm thức 4 (Chitosan 0,5% + Abamectin 5WP 2 %), nghiệm thức 5 (Chitosan 1% + Abamectin