Đồ án Đánh giá hiệu quả phòng trừ của Chitosan đối với tuyến trùng hại tiêu tại Bình Phước

, không ñổ thuốc ñộc hóa học xuống gốc tiêu. Mô hình IPM/ICM nói trên là biện pháp chẳng những rất có hiệu quả quản lý dịch hại trên cây hồ tiêu mà còn làm tăng chất lượng của sản phẩm hồ tiêu Việt Nam hiện nay.
Hướng giải quyết vấn ñề kiểm soát mầm bệnh và bảo vệ ñất ñai: Tiến sĩ Paul Sultie (người mỹ) chuyên gia nghiên cứu ñộ phì nhiêu của ñất ñã ñưa ra quan ñiểm: Quản lý ñất ñai tổng hợp và cây trồng (IPSM : Integrated Plant Soil Management). Hướng giải quyết này lúc ñầu chưa ñược chú ý nhiều, nhưng sau ñó không những các nhà khoa học mà nông dân ngày càng quan tâm ủng hộ nhiều hơn nhờ tính xác thực của nó. Theo nguyên lý của TS. Paul Sultie, giải quyết vấn ñề tác hại của hóa chất bảo vệ thực vật và phân bón vô cơ có 2 cách như sau: ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 10 - Dùng tác nhân sinh học ñể làm vệ sinh ñất, giúp lông hút của cây trồng không bị sự cản ngại của tuyến trùng và các mầm bệnh, ñể có thể hút hữu hiệu phân bón và nước sẵn có trong ñất hoặc ñược cung cấp vào. Nhờ vậy giảm hẳn nhu cầu bón ñạm của cây trồng cạn. - Dùng tác nhân sinh học ñể khởi ñộng trực tiếp hoạt ñộng của rễ và khởi ñộng hoạt ñộng của vi sinh vật vùng rễ, giúp cho ñất tơi xốp, dễ thoát hơi nước, hòa tan lân, vi lượng, phân hủy hữu cơ… và vì vậy sinh khối rễ tăng lên, nuôi ñược thân rễ, củ, quả, lá tốt hơn. Sinh khối rễ gia tăng cũng có nghĩa là ñã bón hữu cơ vào trong ñất. Bên trên mặt, nếu là các loài cây trồng ñược thu hoạch hết như các loại rau cải, ta cần bón loại phân hữu cơ. Nếu còn dư thừa xác bã ta cần vùi hoặc ủ phân ñể tái tạo nhu cầu mới. Với nhiều tiến bộ của khoa học kỹ thuật ngành công nghệ sinh học phục vụ cho nông nghiệp, người ta nghiên cứu sản xuất ra nhiều chế phẩm phân bón, thuốc trừ sâu sinh học có hiệu quả cao. ðặc biệt là các chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc từ cây Neem (Azadirachta Indica A.Juss) tên Việt Nam là xoan chịu hạn rất ñược chú ý. Các hoạt chất sinh học từ hạt Neem có tác dụng diệt trừ sâu rầy, tuyến trùng phá rễ và không ñộc hại cho người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, người dân có thể dễ dàng tự cách chiết dầu Neem ñể phun xịt, diệt trừ vật gây hại hoa màu. 1.3. Các nghiên cứu chiết xuất và sử dụng Chitosan 1.3.1. Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin - chitosan trong tự nhiên Chitin - Chitosan là một polysacharit tồn tại trong tự nhiên với sản lượng rất lớn (ñứng thứ hai sau xenllulose). Trong tự nhiên Chitosan tồn tại trong cả ñộng vật và thực vật. Trong ñộng vật, Chitin là thành phần cấu trúc quan trọng của các vỏ một số loài ñộng vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp sát và giun tròn. Trong ñộng vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho sự tái tạo và gắn liến các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào nấm họ zygenmyctes, các sinh khối nấm mốc, một số loại tảo... Chitin - Chitosan là polysacharit có ñạm không ñộc, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosacharit (N-acetyl-β-D-glucosamine) liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ chức. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 11 Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi các cầu nối ñẳng trị (coralente) với các protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác. Hình 1.1 – Chitin, Chitosan và vỏ tôm Trong các loài thủy sản ñặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin - chitosan chiếm khá cao dao ñộng từ 14 - 35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ là nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất chitin – chitosan. Về mặt lịch sử, chitin ñược Braconnot phát hiện ñầu tiên vào năm 1821, trong cặn dịch chiết từ một loại nấm. Ông ñặt tên cho chất này là “Fungine” ñể ghi nhớ nguồn gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập ñược một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hy lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong ñó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot ñều ñi ñến kết luận chitin có dạng công thức giống với xellulose. 1.3.2. Tính chất lý hóa và ñộc tính của chitosan
Cấu trúc hóa học. Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế. Việc sản xuất chitosan rất ñơn giản, không cần dung môi, hóa chất ñộc hại, ñắt tiền. Chitosan thu ñược bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến ñổi nhóm N- acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta quy ước nếu ñộ ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 12 deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là Chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin. Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các ñơn vị 2-amino-2-deoxy-β-D- glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β- (1-4) glucozit. Công thức phân tử: [C6H11O4N]n Phân tử lượng: MChitosan = (161,01)n Công thức cấu tạo của Chitosan: Hình 1.2 – Công thức cấu tạo Chitosan Tên gọi khoa học: Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucose; Poly(1-4)-2- amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose,3 Qua cấu trúc của Chitin – Chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt ñộng là –OH (H ở nhóm hydroxit bậc 1 linh ñộng hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2 trong vòng 6 cạnh) còn Chitosan có 2 nhóm chức hoạt ñộng là –OH và –NH2, do ñó, Chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hóa học hơn Chitin. Trong thực tế các mạch Chitin – Chitosan ñan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm ñồng thời, việc tách và phân tích chúng rất phức tạp. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 13 Hình 1.3 – Chitin, Chitosan và một số dẫn xuất
Tính chất hóa học. Chitosan có màu trắng ngà hoặc màu vàng nhạt, tồn tại dạng bột hoặc dạng vảy, không mùi, không vị, nhiệt ñộ nóng chảy 309 – 3110 C. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, trong kiềm nhưng hòa tan ñược trong dung dịch axit hữu cơ loãng như: axit acetic, axit fomic, axit lactic..., tạo thành dung dịch keo nhớt trong suốt. Chitosan hòa tan trong dung dịch axit acetic 1 – 1,5%. ðộ nhớt của chitosan trong dung dịch axit loãnh liên quan ñến kích thước và khối lượng phân tử trung bình của chitosan (ñây cũng là tính chất chung của tất cả các dung dịch polime). Chitosan kết hợp với aldehit trong ñiều kiện thích hợp ñể hình thành gel, ñây là cơ sở ñể bẫy tế bào, enzym. Chitosan phản ứng với axit ñậm ñặc, tạo muối khó tan. Chitosan tác dụng với Iod trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím.
Tính chất sinh học. Chitosan không ñộc, dùng an toàn cho người. Chúng có tính hòa hợp sinh học ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 14 cao với cơ thể, có khả năng tự phân hủy sinh học. Chitosan có nhiều tác dụng sinh học như: tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong ñiều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u. Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid trong máu, hạ huyết áp, ñiều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. Với khả năng thúc ñẩy hoạt ñộng của các peptit – insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên chitosan ñã ñược dùng ñể ñiều trị bệnh tiểu ñường. Nhiều công trình nghiên cứu ñã công bố khả năng kháng ñột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển của các tế bào u, ung thư, chống tia tử ngoại, chống ngứa... của chitosan. Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự ñã xác ñịnh Chitosan hầu như không ñộc, chỉ số LD50 = 16g/kg cân nặng cơ thể, không gây ñộc trên súc vật thực nghiệm và người, không gây ñộc tính trường diễn. Nghiên cứu tiêm Chitosan theo ñường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả ñã kết luận: Chitosan là vật liệu hòa hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho ñường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô. Dùng Chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp ñể tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích lũy ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng phân hủy sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó ñược thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và lá lách. Nhiều tác giả ñã chỉ rõ những lợi ñiểm của Chitosan: tính chất cơ học tốt, không ñộc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hòa hợp sinh học không những với ñộng vật mà còn ñối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 15 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sản xuất của Chitosan ở Việt Nam và trên thế giới Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới ñã chứng minh, trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chất chitin này, họ có thể chiết tách thành chất chitosan ñể ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: hoá dược, mỹ phẩm và ñặc biệt trong ngành dược phẩm, chất chitosan ñã hỗ trợ ñắc lực trong việc bào chế ra rất nhiều sản phẩm thuốc chữa ñược nhiều loại bệnh khác nhau. Trước ñây, người ta thử chiết tách Chitosan từ thực vật biển nhưng nguồn nguyên liệu không ñủ ñáp ứng cho nhu cầu sản xuất. Trữ lượng Chitosan phần lớn có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua. Trong một thời gian các chất phế thải này không ñược thu hồi mà thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977, Viện Kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác ñịnh giá trị của chitosan và protein trong vỏ tôm, cua ñã cho thấy việc thu hồi chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần protien thu ñược sẽ dùng ñể chế biến thức ăn gia súc, còn phần Chitosan sẽ ñược dùng như một chất khởi ñầu ñể diều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp. Năm 1961, nhà khoa học Nga BousBeloisov ñã khởi xướng việc bào chế thuốc chống nhiễm xạ từ Chitosan. Các nhà khoa học ñã tiến hành thử nghiệm tiêm thuốc cho ñộng vật chó và khỉ trước khi chúng bị nhiễm xạ, kết quả cho thấy, khả năng sống sót tới 45%. Rất tiếc, trong thảm hoạ hạt nhân Chernobyl năm 1968, các thuốc chống xạ trên chưa ñược công bố rộng nên không ñược áp dụng cứu người. ðến sau thảm hoạ tàu nguyên tử Komsomlets, các nhà khoa học ñã lên tiếng kêu gọi nên sử dụng chitosan làm vật liệu kết cấu trong xây dựng các lò phản ứng nguyên tử và làm vỏ cách ngăn cho các con tàu nguyên tử. Tại Nhật Bản, năm 1975, Chitosan ñã ñược ñưa vào làm chất xúc tác ñể xử lý nước thải. Hiện nay, các hãng mỹ phẩm trên thế giới ñã ứng dụng thành phần chitosan vào hàng loạt các sản phẩm của mình. Chúng ta có thể tìm thấy chất này trong các sản phẩm kem ñánh răng, kem chống nắng, phấn mắt, nước xúc miệng, kẹo chewing-gun... Riêng hãng Mỹ phẩm Wella ñã dùng Chitin-Chitosan trong ít nhất 15 sản phẩm bảo vệ tóc, và hãng Shiseido, thương hiệu nổi tiếng có mặt nhiều năm tại thị trường Việt Nam cũng ñã dùng chất này trong 13 sản phẩm mỹ phẩm của hãng. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 16 Thế giới ngày càng có xu hướng sử dụng dược phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên. Vì thế, trong nhiều năm qua, các nhà khoa học trên thế giới và cả ở Việt Nam ñã tích cực nghiên cứu chiết tách chitosan từ hàng ngàn tấn vỏ tôm ñang ñược thải ra tại các cơ sở chế biến ñông lạnh, ñể sản xuất ra nhiều loại thuốc ñiều trị bệnh phục vụ cho cuộc sống con người. ðiển hình trên thị trường dược hiện nay là loại thuốc chữa khớp làm từ vỏ tôm có tên Glucosamin ñang ñược thịnh hành trên toàn thế giới. So với sản phẩm cùng loại thì Glucosamin có ưu thế hơn, do sản xuất từ nguồn vỏ tôm tự nhiên nên sản phẩm ít gây phản ứng, không ñộc hại và không bị rối loạn tiêu hoá cho người bệnh. Vì thế, chỉ trong năm 1998, nước Mỹ ñã tiêu thụ ñược hơn 1 tỷ viên nang Glucosamin. Thậm chí tại các siêu thị, thuốc bán không cần ñơn, chúng ñược coi như một loại thực phẩm chức năng. Những năm gần ñây, loại thuốc chữa khớp này còn ñựợc phổ cập rộng ở nhiều nước như: Nhật, Pháp, ấn ðộ, Thái Lan và cả Việt Nam. Việc nghiên cứu sản xuất chitosan và ứng dụng trong sản xuất phục vụ ñời sống là một hướng nghiên cứu tương ñối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978 – 1980 Trường ðại học Thủy sản Nha Trang ñã công bố quy trình sản xuất chitosan của Kỹ sư ðỗ Minh Phụng, nhưng chưa có ứng dụng cụ thể trong sản xuất. Gần ñây, trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản ñông lạnh ñang ngày càng cấp bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng ñã thúc ñẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitosan ở bước cao hơn, ñồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực sản xuất công nghiệp. Hiện nay, ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học ñang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường ðại học Nông Lâm TP.HCM, Trung tâm nghiên cứu Polyme – Viện Khoa học Việt Nam, Viện Hóa thuộc Phân viện Khoa học Việt Nam tại TP.HCM, Trung tâm công nghệ và sinh học thủy sản – Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. Ở Miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam ñã kết hợp với Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp ở ñồng lúa Thái Bình và ñã thu ñược một số kết quả ñáng khích lệ. Ở Miền Nam, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản phối hợp với một ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 17 số cơ quan khác: ðại học Y dược TP.HCM, Phân viện Khoa học Việt Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Miền Nam,... ñang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng Chitosan trong lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm. 1.3.4. Ứng dụng của chitosan trong BVTV Một trong những tồn tại lớn của sản xuất nông nghiệp ñang ñược quan tâm hiện nay là việc sử dụng quá nhiều thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc hóa học. Tình trạng này nếu cứ tiếp diễn sẽ ñi ngược lại mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững và an toàn mà chúng ta ñang nỗ lực tiến tới. ðể góp phần hạn chế tồn tại trên, nhiều chế phẩm BVTV có nguồn gốc sinh học ñã ñược ñăng ký sử dụng. Tuy vậy, trong thực tế sản xuất, việc sử dụng các chế phẩm sinh học ñể phòng trừ sâu bệnh còn nhiều hạn chế. Một trong những lý do chủ yếu là các chế phẩm sinh học thường chỉ ñược sử dụng riêng lẻ với mục tiêu diệt trừ ngay sâu bệnh khi chúng ñã phát sinh gây hại. Kết quả là trong ña số các trường hợp hiệu quả diệt trừ sâu bệnh tỏ ra không bằng so với sử dụng thuốc hóa học nên chưa ñược nhiều nông dân chấp nhận. ðể hiệu quả phòng trừ sâu bệnh hại của các chế phẩm sinh học thể hiện rõ, các chế phẩm sinh học cần phải ñược sử dụng theo quy trình xác ñịnh trong từng ñiều kiện cụ thể. Theo nghiên cứu của Halina Kurzawinska (2007) Khoa bảo vệ thực vật trường ðại học Nông nghệp Ba Lan chứng minh rằng: Ảnh hưởng lớn của Chitosan trong việc bảo vệ rau và cho rằng bệnh về rễ (Pythium của Dưa chuột) ñược khống chế khi sử dụng chitosan sử dụng với liều lượng 100 - 400 mg/ml. Biochikol 020 PC khi ñược tưới vào ñất thì tốt hơn việc xịt lên cây ñể chống các loài nấm thuộc dòng Phytopthora và Fusarium. Ngoài ra chitosan là hoạt chất của Biochikol 020 PC và hoạt ñộng kích thích miễn dịch của cây, chống lại hoạt ñộng của nấm tác ñộng ñến cây. Chitosan còn là nhân tố giúp cây có phản ứng tự vệ ở trong cây. Khi phun lên lá và tưới gốc, Chitosan ñược cây hấp thụ nhanh và lưu dẫn trong toàn cây. Chitosan kích thích hoạt ñộng của hệ thống kháng bệnh trong cây, giống như một loại vắc xin thực vật, tăng khả năng ñề kháng của cây với các loài vi sinh vật gây bệnh, bao gồm cả nấm, vi khuẩn, tuyến trùng và virus. Ngoài ra, khi tiếp xúc với vi sinh vật, chất Chitosan có thể phá hủy màng tế bào làm vi sinh vật không phát triển ñược. Chitosan còn có tác dụng như một chất kích thích tăng trưởng cây trồng. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 18 Ở nước ta hiện nay chất Chitosan bước ñầu ñã ñược ñăng ký phòng trừ nhiều loại bệnh cho nhiều loại cây trồng như các bệnh ñạo ôn, ñốm vằn, bạc lá, lem lép hạt hại lúa, bệnh sương mai hại dưa, bắp cải, khoai tây, thán thư hại ớt, bệnh héo rũ, lở cổ rễ, bệnh chết nhanh hồ tiêu, bệnh gỉ sắt cà phê, bệnh thối quả xoài, bệnh do tuyến trùng trên nhiều loại cây như thanh long, cà phê, hồ tiêu, chè, hoa cúc, hoa huệ… ðối với cây có múi, chất Chitosan có thể hạn chế tác hại nhiều loại bệnh như thán thư, loét, tuyến trùng… Ngoài ra, Chitosan còn ñược sử dụng kích thích sinh trưởng cho nhiều loại cây như lúa, cà chua, chè, mía... Khi phun lên cây dung dịch ñược pha với nồng ñộ 0,1 – 0,3%, phun phòng bệnh với nồng ñộ thấp hơn khi phun trừ bệnh (Nguyễn Mạnh Hùng và Phạm Anh Cường Nam, 2006). Các kết quả thử nghiệm cho thấy, Chitosan hoàn toàn không ñộc với người và môi trường nên ñã ñược phép sử dụng rộng rãi ở Việt Nam và trên thế giới. Một số chế phẩm có nguồn gốc từ Chitosan ñã ñược ñăng ký sử dụng ở Việt Nam như: thuốc trừ bệnh Olicide, humb 0.5 SL (hoạt chất Chitosan) phòng trừ bệnh sương mai cà chua, thán thư ớt, ñốm vàng dưa leo, phấn trắng bí xanh (dẫn theo Cục Bảo vệ Thực vật, 2008). ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 19 CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nội dung nghiên cứu
Mật ñộ của tuyến trùng trong vườn tiêu bị hại tại Bình Phước.
Hiệu quả của Chitosan trong việc phòng trị tuyến trùng hại tiêu.
ðộc tính của Chitosan ñến cây hồ tiêu. 2.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Vật liệu nghiên cứu
Giống tiêu: Tiêu sẻ tại Bình Phước.
Dụng cụ thí nghiệm: Phễu lọc, giá ñỡ phễu, giấy lọc, ống cao su, rây lọc (bằng sắt), kính hiển vi, ñĩa petri, cốc thủy tinh, cân phân tích, bình phun thuốc.
Thuốc BVTV: - Abamectin 5 WP. - Sincocin 0.56 SL: 0,2 % - Oligo Sacarit (Chitosan): 50 g/lít (ñược Cục Bảo Vệ Thực Vật nhập nội từ Trung Quốc) 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm ñược bố trí dưới dạng khảo nghiệm diện rộng.
Khảo nghiệm ñược bố trí trên những khu vực trồng cây tiêu ñang có biểu hiện bị tuyến trùng gây hại (vàng lá, còi cọc). Các ñiều kiện trồng trọt như ñất ñai, phân bón, mật ñộ cây, chế ñộ chăm sóc… ñược tiến hành ñồng ñều trên mọi ô khảo nghiệm và phù hợp với tập quán canh tác của ñịa phương.
Khảo nghiệm ñược chia thành 8 lô, mỗi ô có 10 cây (10 nọc), tổng số lượng cây tiêu thí nghiệm là 80 cây, gồm 7 lô sử dụng thuốc và một lô ñối chứng không xử lý thuốc ñược trình bày như sau: ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 20 Nghiệm thức Nồng ñộ sử dụng Cách xử lý 1 Chitosan 0,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 2 Chitosan 1% Tưới vào gốc + phun lên lá 3 Chitosan 1,5% Tưới vào gốc + phun lên lá 4 Chitosan 0,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 5 Chitosan 1% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 6 Chitosan 1,5% + Abamectin 5 WP 2% Tưới vào gốc + phun lên lá 7 Sincocin 0.56 SL (0,2 %) Tưới ñẫm quanh gốc 8 ðối chứng Không tưới Chitosan và không phun thuốc
Phương pháp xử lý: ðào rảnh xung quanh gốc cây (cách gốc khoảng 20 cm), sau ñó tưới thuốc vào rảnh với liều lượng 1 lít/gốc (tránh nước chảy tràn ra ngoài) rồi lấp ñất lại. Sau khi xử lý thuốc dưới gốc, dung dịch (cùng nồng ñộ với dung dịch tưới dưới gốc) ñược phun ướt ñều trên tán lá tiêu cũng với liều lượng 1 lít/gốc. Mẫu rễ và ñất ñược lấy cố ñịnh trên 3 cây tiêu thí nghiệm. Mỗi công thức theo dõi 10 cây tiêu.
Phương pháp theo dõi thí nghiệm: - ðếm mật ñộ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và ñất ở các thời ñiểm trước lúc xử lý thuốc và 5, 15, 30 ngày sau khi xử lý thuốc. - Cách lấy mẫu rễ và mẫu ñất: Mỗi công thức chọn cố ñịnh 3 cây ñể lấy mẫu rễ và ñất bằng cách ñào xung quanh vùng cây cách gốc 50 cm, sâu 15 cm. Mỗi cây lấy 3 ñiểm theo hình tam giác ñều mà gốc cây là trung tâm. Trộn tất cả các mẫu của 3 cây trong cùng một công thức lại với nhau, sau ñó lấy ra 1 mẫu ñựng trong bao nilông dán nhãn ñể phân tích . - Phương pháp xác ñịnh tuyến trùng. Tuyến trùng trong rễ và trong ñất ñược lọc bằng phương pháp phễu lọc ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 21 Bermann. Trong rễ: Rửa sạch mẫu rễ dưới vòi nước mạnh, ñể khô và cân 0,5 gam rễ rồi cắt thành từng ñoạn dài 0,5 cm. ðặt mẫu bệnh vào phễu, phía dưới ñặt một cái rây và một lớp giấy lọc phía trên, cổ phễu ñược gắn ống cao su có kẹp ở cuối ống. ðổ nước từ từ vào miệng phễu sao cho nước vừa ngập mẫu rễ và tiến hành lọc trong 24 giờ ở ñiều kiện nhiệt ñộ phòng. Khi ñã ñủ thời gian, ta sẽ mở kẹp và lấy ra 10 ml nước chứa tuyến trùng cho vào ñĩa petri sạch, dùng kính hiển vi có ñộ phóng ñại 4X/ 0.10 ñể ñếm số lượng tuyến trùng. Trong ñất: Cân 10 gam ñất cho vào lớp giấy lọc sau ñó ñặt vào phiễu và lọc như phương pháp lọc rễ.
Hiệu lực của thuốc Hiệu lực của thuốc ñược tính theo công thức Henderson – Tilton (1955) Q (%) =       − Tb Cb . Ca Ta 1 .100 Trong ñó: Ta: Mật ñộ tuyến trùng của lô thí nghiệm sau xử lý. Tb: Mật ñộ tuyến trùng của lô thí nghiệm trước xử lý. Ca: Mật ñộ tuyến trùng của lô ñối chứng sau xử lý. Cb: Mật ñộ tuyến trùng của lô ñối chứng trước xử lý.
ðộc tính của thuốc ñối với cây tiêu Nếu cây tiêu có biểu hiện ngộ ñộc thì cần quan sát nhiều lần cho ñến khi cây phục hồi hoặc chết. Các triệu chứng ngộ ñộc có thể ñánh giá bằng mắt như biến vàng, cháy, biến dạng… thì ước lượng ñộ ñộc cho toàn ô dựa theo thang ñánh giá sau. ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 22 Cấp Triệu chứng 1 Cây bình thường. 2 Triệu chứng ngộ ñộc rất nhẹ, sinh trưởng của cây giảm nhẹ. 3 Triệu chứng ngộ ñộc nhẹ, nhưng thấy ñược bằng mắt. 4 Triệu chứng ngộ nặng hơn (ví dụ mất diệp lục) nhưng có thể chưa ảnh hưởng ñến năng suất. 5 Cây biến màu, cháy lá nặng. Có ảnh hưởng ñến năng suất. 6,7,8,9 Thiệt hại cho ñến mức cây chết hoàn toàn. Nguồn: TCN 579 – 2003
Chỉ tiêu quan sát - Mật ñộ tuyến trùng (số tuyến trùng/10ml dịch lọc) - Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng (%) - ðộc tính của thuốc
Phương pháp xử lý số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphic 7.0 ñể xử lý số liệu ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 23 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật ñộ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong mẫu rễ và trong mẫu ñất ở các thời ñiểm Trước khi xử lý thuốc, hầu hết các lô tiêu ñều có hiện tượng cây bị vàng lá, rễ có nốt sưng... Theo các tác giả, ñây chính là bệnh do tuyến trùng Meloidogyne spp. gây ra (Nguyễn Văn Biên và CTV, 2003; Nguyễn Thơ, 2008). Như vậy, liệu trong thí nghiệm này, tuyến trùng Meloidogyne spp. có mặt hay không và với mật số như thế nào? Kết quả theo dõi ñược trình bày như sau:
Trước khi xử lý thuốc Bảng 3.1 – Mật ñộ tuyến trùng trước lúc xử lý thuốc Nghiệm thức Mẫu Rễ ðất 1. Chitosan nồng ñộ 0,5% 7 ± 1,53 27 ± 2,08 2. Chitosan nồng ñộ 1% 10 ± 1.53 32 ± 2,08 3. Chitosan nồng ñộ 1,5% 9 ± 2 34 ± 2 4. Chitosan + Abamectin 5WP , nồng ñộ 0.5% + 2% 13 ± 2,51 92 ± 3,06 5. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng ñộ 1% + 2% 8 ± 2,08 58 ± 7,23 6. Chitosan + Abamectin 5 WP, nồng ñộ 1,5% + 2% 11 ± 1,53 99 ± 2,08 7. Sincocin 0.56 SL (0,2 %) 9 ± 1,53 62 ± 1,53 8. ðối chứng 7 ± 1 21 ± 2,08 Ghi chú: Biện pháp xử lý: tưới vào gốc Kết quả theo dõi ở bảng 3.1 cho thấy, tuyến trùng có mặt ở trong rễ của tất cả các cây tiêu ở các công thức thực nghiệm. Trong rễ, mật ñộ tuyến trùng biến ñộng từ 7 – 13 con/10 ml dịch lọc. Tương tự, mật ñộ tuyến trùng trong ñất cũng rất cao và phân bố ở tất cả các công thức. ðiều này cho thấy, tuyến trùng Meloidogyne spp. rất ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 24 phổ biến trong ñất và trong rễ cây tiêu có biểu hiện bị bệnh tại vùng thí nghiệm với mật ñộ khá cao Hình 3.1: Hình lấy mẫu ñất và mẫu rễ ñể quan sát tuyến trùng Hình 3.2: Mật ñộ tuyến trùng trong dịch lọc rễ ở lô ñối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) Hình 3.3: Mật ñộ tuyến trùng trong dịch lọc ñất ở lô ñối chứng (ảnh chụp dưới kính hiển vi) ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 25 Hình 3.4: Mẫu rễ tiêu sau khi cắt thành ñoạn dài 0.5 cm Hình 3.5: Lọc tuyến trùng trong mẫu rễ cây tiêu Hình 3.6 : Mẫu ñất (10 gam) dùng ñể lọc tuyến trùng Hình 3.7: Lọc tuyến trùng trong mẫu ñất trồng tiêu Sau khi xử lý thuốc 5, 15 và 30 ngày, rễ và ñất xung quanh gốc tiêu ñược lấy mẫu ñể kiểm tra sự hiện diện của tuyến trùng. Kết quả ñược trình bày ở các bảng sau: ðồ án tốt nghiệp GVHD: TS. Nguyễn Thị Hai SVTH: Trương Kim Trọng Trang 26
Sau 5 ngày xử lý thuốc Bảng 3.2 – Mật ñộ tuyến trùn