Đồ án Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn probiotics

tive Microoganims) do giáo sư , tiến sĩ TeRuo Higa, Trường Đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm 1980 và được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cung như bảo vệ môi trường đều cho kết quả khả quan. Đến nay chế phẩm này được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam. (Lương Đức phẩm, 2007). 2.2.2. Thành phần probiotics Các chủng loại vi sinh vật sử dụng trong probiotics được xác định có sự hiện diện của cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophages, nấm men và cả nấm đơn bào (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.1. Vi khuẩn gram dương Các vi sinh vật gram dương, hiếu khí và sinh bào tử như chủng Bacillus spp được sử dụng như probiotics nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số lượng mầm bệnh. Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóa chất trong việc nuôi trồng thủy sản và nâng cao tỷ lệ sống của các loài nuôi trồng thủy sản (Irianto and Austin, 2002). Ngoài các chủng Bacillus, vi khuẩn lactic trong các chế phẩm probiotics được ứng dụng khá nhiều trong nuôi trồng thủy sản như sử dụng chế phẩm chứa Lactobacillus bulgaricus, L. acidophillus, L. sporogenes, L. casei, L. plantarum, Streptococcus thermophillus (Venkat et al., 2004). Lợi ích của việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế phẩm probiotics là làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng cá (Irianto and Austin, 2002) đồng thời làm tăng hiệu quả hấp thu thức ăn (Venkat et al, 2004) 2.2.2.2. Vi khuẩn gram âm Pseudomonas fluorescens được chứng minh là có khả năng ức chế Saprolenia và A. salmocinida trên các loài cá có vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi (Irianto and Austin, 2002) Một vi khuẩn gram (-) khác cũng có tác dụng cải thiện chất lượng của ấu trùng cua, hàu và cá bơn, đó là V. proteolyticus. Chủng này cải thiện quá trình tiêu hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua con đường cho ăn, Alteromonas làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng pacific oyster (Irianto and Austin, 2002). 2.2.2.3. Bacteriophages Hiện nay có rất nhiều tranh cãi về vai trò của bacteriophages trong chế phẩm probiotics. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã nuôi cấy được bacteriophages từ cá thơm, Plecoglossus altivelis và thông qua con đường cho ăn, người ta đã nhận thấy rằng bacteriophages chống lại sự nhiễm P. plecoglossicida trên cá thơm và từ đó họ đi đến kết luận rằng bacteriophages làm giảm nhanh chóng số lượng tế bào vi khuẩn P. plecoglossicida trong thận của cá thơm và trong môi trường nước (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.4. Nấm men Nấm men được ứng dụng trong probiotic phổ biến nhất là chủng Saccharomyces cerevisiae. Với sự hiện diện của nấm men, nó sẽ bám dính vào ruột, làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzyme màng ở ấu trùng sau 27 ngày tuổi (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.5. Vi nấm Nấm đa bào Tetraselmis suecica, được sử dụng làm thức ăn cho các loài tôm thuộc họ tôm he và các loài cá thuộc họ cá hồi đã phát hiện ra rằng loài nấm này làm giảm mật độ bệnh do vi khuẩn. Trên cơ sở đó, một số tác giả cũng đã đưa ra phương thức hoạt động của vi nấm này chống lại các tác nhân gây bệnh dựa vào sự hiện diện của các hợp chất kháng khuẩn không chuyên biệt trên tế bào vi nấm. (Irianto and Austin, 2002) 2.2.3. Tác dụng của probiotics Như chúng ta đã biết, chế phẩm probiotic được sử dụng trong các lĩnh vực: chăn nuôi, trồng trọt, bảo vệ môi trường và sức khoẻ. Hiệu quả của chế phẩm này có nhiều tác dụng dương tính khá bất ngờ như làm cây trồng, vật nuôi tăng sản lượng, tăng trọng, các chỉ tiêu cảm quan đều tốt hơn…, thậm chí còn làm tăng sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ. Cơ chế tác dụng còn nhiều điều bàn cãi, song hiệu quả thực tế là những minh chứng mà nhiều người không thể phủ nhận.Tác dụng cơ bản của chế phẩm probiotics như sau: 2.2.3.1. Trong bảo vệ môi trường Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tuỳ tiện có khả năng sinh ra các enzyme thuỷ phân ngoại bào. Vì vậy, khi vào môi trường nuôi chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh phát triển, chúng còn phân huỷ các chất hữu cơ do thức ăn dư thừa và phân của vật nuôi bài tiết…để làm giảm thiểu ô nhiễm. Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S và các khí thối khác là dẫn xuất của khí này. Các loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh Rhodobacter sp, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palutris, Rhodomicrobium vanniell có khả năng sử dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt. (kể tên loài vi khuẩn làm phân huỷ NH3,NO2..) Đồng thời các nấm men có khả năng lên men rượu từ đường có trong môi trường, tạo mùi thơm, cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hệ số tiêu hoá của thức ăn cho vật nuôi. 2.2.3.2. Trong chăn nuôi Probiotics có tác dụng đối với tất cả vật nuôi, gồm các loại gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy sản. Đối với vật nuôi giúp cho: Phát triển hệ vi sinh vật đường ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ chế phẩm này còn giúp cho hệ vi sinh vật dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn. Khi probiotic được đưa vào đường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong chế phẩm làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái, điều chỉnh môi trường, ức chế vi sinh vật gây hại hoặc gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại này gây nên, làm cho chức năng của đường ruột được hoạt động tốt hơn. Liên quan đến việc làm sạch đường ruột có tác dụng thúc đẩy quá trình lọc máu và lọc các chất độc cần bài tiết. Một số vi sinh vật của chế phẩm, đặc biệt là nhóm vi khuẩn acidlactic và nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột, đó là Samonella, Vibrio, Shigella rất rõ. Ngoài ra, acid lactic tạo thành có tác dụng làm sạch ruột, làm cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho động vật tiêu hoá. Các hoạt chất kháng sinh do vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế (cùng với vi khuẩn lactic) các vi sinh vật gây hại. Tăng cường hiệu quả tiêu hoá của thức ăn: tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Kích thích chức năng miễn dịch của cơ thể. Làm lành mạnh và hoạt hoá khả năng tự nhiên của tế bào. Hai tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ các chế phẩm probiotic có hoạt tính sinh học, như acid amin, các enzyme, các nucleotit, các acid nucleic, các vitamin, đặc biệt là biotin. Các hoạt chất này có lien quan đến khả năng đổi mới của tế bào của cơ thể, làm tăng kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trình não hoá, làm tăng sức khoẻ chống sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Các tác dụng trên đây thường thấy khi sử dụng trộn chế phẩm với thức ăn của vật nuôi, hoặc cho người hay động vật uống các dịch chiết từ chế phẩm. Các chế phẩm này có thể dùng ở dạng dịch hoặc bột (phun hoặc rắc vào môi trường nước hay chuồng trại) để xử lý môi trường. Làm tăng sức khoẻ vật nuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng. Làm cho gia súc, gia cầm mắn đẻ hơn. Tăng chất lượng thịt, tăng năng suất chăn nuôi. Ức chế và có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại. Làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Vì vậy, dung chế phẩm probiotic hoà vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi đều có tác dụng dương tính. Dùng dạng dịch pha loang phun trực tiếp lên cơ thể con vật như chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào đầu vú con cái thì khgi cho con bú se tránh bị nhiễm khuẩn có hại. Với môi trường nước nuôi tôm, cá khi đưa probiotics vào sử dụng thì nước ao đầm có pH thay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột. Các chỉ số BOD, COD cũng vậy, hàm lượng NH3 và H2S thường không quá giới hạn cho phép nên thời gian của một chu kì thay nước sẽ kéo dài hơn. Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khoẻ hơn, tăng trọng nhanh hơn và chi phí thức ăn cho một đơn vị tăng trọng giảm. 2.2.3.3. Trồng trọt Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trông (bao gồm cây lương thực, cây ăn quả, cây rau màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau. Tác dụng với cây trồng ta thấy: Kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả, và quá trình chin của quả. Cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh. Tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng. Kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống, làm cho hoa trái tươi lâu. Dùng chế phẩm probiotic khi được đưa vào đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng dễ. Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ. 2.2.3.4. Cơ chế hoạt động của probiotics trong nuôi trồng thủy sản Cạnh tranh vị trí gắn kết: một trong những cơ chế ngăn ngừa sự hình thành của tập đoàn vi khuẩn gây bệnh là cạnh tranh vị trí gắn kết trên ruột hay trên hay trên bề mặt các mô, đây là hàng rào phòng bệnh đầu tiên chống lại vi khuẩn gây bệnh. Sản xuất các chất ức chế: tạo ra các chất ức chế trong thành ruột của vật chủ tạo nên hàng rào bảo vệ chống lại các bệnh cơ hội. Cạnh tranh nguồn năng lượng: các vi sinh vật probiotics và các vi khuẩn gây bệnh cạnh tranh ion sắt với nhau, siderophore là tác nhân giữ ion sắt chuyên biệt, có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng phân hủy sắt kết tủa và biến nó thành sắt mà vi sinh vật có thể sử dụng được. Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng: sử dụng nấm men để nâng cao sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột, tăng tỉ lệ sống của ấu trùng do kích thích enzyme tiêu hóa. Tác dụng lên hệ thống nước xanh: probiotics bổ sung các vi nấm có lợi nhằm làm tăng tỉ lệ tăng trưởng và sống sót của ấu trùng cá, khởi động quá trình tiêu hóa và hình thành vi sinh vật. Probiotics nâng cao đáp ứng miễn dịch: sử dụng các chất kích thích miễn dịch như bêta-glucan, peptidoglycan… để tăng cường hệ thống phòng vệ đối với vi khuẩn gây bệnh. Can thiệp vào hệ thống quorum sensing: tạo ra một số chất có khả năng phân hủy quorum sensing làm ức chế khả năng gây bệnh của vi khuẩn. 2.2.5. Tình hình sử dụng chế phẩm probiotics ở Việt Nam Hiện nay, Việt Nam đang đẩy mạnh việc nghiên cứu để sản xuất probiotics dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thì giá thành còn cao nên ở nước ta hiện nay vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu là các loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp. Do đó, giá thành của probiotic giảm xuống nhiều và cũng giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và góp phần cải thiện môi trường. Từ bã khoai mì mà ngay cả động vật cũng chê, các chuyên gia thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo ra thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi, kể cả thủy sản. Võ Thị Hạnh với chế phẩm Probiotic Bio I và Bio II gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã nhận được giải thưởng WIPO dành cho nhà khoa học nữ xuất sắc nhất. Trong nuôi trồng thủy sản, công ty công nghệ hóa sinh Việt Nam đã sản xuất những sản phẩm phục vụ công tác cải thiện chất lượng môi trường nước nuôi tôm, cá đạt hiệu quả như sau: BIO - DW - làm sạch nước, nền đáy ao nuôi; ngăn chặn dịch bệnh; tăng sản lượng tôm, cá. BIO - PROBIOTIC - Thức ăn bổ sung cho tôm, cá. EMC - Phức hợp vi sinh vật có lợi, vitamin và các enzyme hữu hiệu dùng nuôi tôm, cá. Probiotics là một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học. Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện. Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotics đang chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Như vậy, nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục hoàn thiện probiotics, đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày được cao hơn, an toàn hơn đáp ứng nhu càu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta. Có thể nói, đây là bản chất tự nhiên trung hòa bản chất tự nhiên, là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn. Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 04 đến tháng 06 năm 2009. Địa điểm thực hiện: Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II. Địa chỉ: số 167 Thùy Vân, Thành phố Vũng Tàu. 3.2. Nội dung thực hiện Giữ giống vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và bổ sung vào các nghiệm thức. Tiến hành đo các yếu tố thủy hóa (nhiệt độ, pH, NH3, NO2, COD) ở cả 2 lô thí nghiệm (bể ương và môi trường). Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn. 3.3. Vật liệu Thí nghiệm gồm 2 hệ thống được bố trí song song nhau: hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm và hệ thống môi trường. 3.3.1 Hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm 3.3.1.1. Vật liệu Bể ương ấu trùng: 15 bể composite 0.5 m3. Hệ thống thoát nước và hệ thống dẫn khí được lắp đặt bằng ống nhựa. Hệ thống sục khí: van khí, dây khí, đá… Hệ thống cấp nước: 2 bể composite 3 và 4 khối, 2 máy bơm nước,.. Nguồn ấu trùng cá chẽm: được cung cấp trực tiếp tại Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam bộ. Nguồn vi khuẩn: được phân lập từ Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, bao gồm các chủng sau: Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm STT Ký hiệu khuẩn lạc Kết quả định danh 1 Ch102 Flavimonas sp. 2 Ch201 Micrococcus sp. 3 Ch104 Bacillus sp. 3.3.1.2. Mô tả Nước biển được xử lý chlorine và được trung hòa bằng Natri thiosulphate, cấp nước vào 15 bể composite 0.5 m3, sục khí liên tục. Tiến hành định lượng ấu trùng cá chẽm và bổ sung vào những bể trên. Vi khuẩn được bổ sung song song với ấu trùng vào bể. Mật độ là 105 CFU/ml và được bổ sung liên tục 2 ngày 1 lần. 3.3.2 Hệ thống môi trường 3.3.2.1. Vật liệu Bể môi trường: 15 bể composite 100 lít. Hệ thống dẫn khí: được lắp đặt bằng ống nhựa. Sục khí: van khí, ống khí, đá… Hóa chất: ammonium chloride NH4Cl. 3.3.2.2. Mô tả Nước biển không xử lý được bơm trực tiếp vào 15 bể, mỗi bể 45 lít và được sục khí liên tục. Bổ sung NH4Cl duy nhất một lần vào đầu mỗi đợt thí nghiệm với nồng độ 10 mg/l. Vi khuẩn được bổ sung song song với hệ thống bể ương ấu trùng. Mật độ cũng là 105 CFU/ml và cũng được bổ sung 2 ngày 1 lần. 3.3.3 Các yếu tố thủy hóa 3.3.3.1. Nhiệt độ: máy đo nhiệt độ (nhiệt kế). 3.3.3.2. pH: máy đo pH. 3.3.3.3. NH3-N Chai nhựa (lấy mẫu). Erlen 250ml (15 cái). Giấy lọc Whatman. Erlen 100ml (15 cái). Pipette (2 cái). Hóa chất: dung dịch phenol, dung dịch Natri nitropruside, dung dịch Citrate kiềm, dung dịch Natri hypochlorite 1.5N hay 5%, dung dịch oxy hóa. Tủ hút. Máy đo quang phổ. 3.3.3.4. NO2-N Chai nhựa (lấy mẫu). Giấy lọc Whatman. Erlen 250ml (15 cái). Erlen 100ml (15 cái). Pittete (2 cái). Hóa chất: nước cất loại nitrite, dung dịch sulfanilamide, dung dịch NED. Tủ hút. Máy đo quang phổ. 3.3.3.5. COD Chai nhựa (lấy mẫu). Erlen 100ml (6 cái). Nước cất. Hóa chất: dung dịch NaOH 25%, dung dịch KMnO4 0.01N, dung dịch H2SO4 25%, dung dịch KI 10%, dung dịch Na2S2O3 0.01N và dung dịch hồ tinh bột. Pittete (2 cái). Máy đun. Bóp cao su. 3.4. Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm theo dõi các chỉ tiêu môi trường trong hệ thống ương cá chẽm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 chủng vi khuẩn probiotics khác nhau tương ứng với 5 nghiệm thức (4 nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn probiotics và 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn). Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần (phụ lục 1). Thí nghiệm được tiến hành trên 15 bể composite 0.5 m3. Thí nghiệm được tiến hành trên ấu trùng cá chẽm mới nở. Nước biển được lọc và xử lý chlorine (nồng độ 30ppm), sục khí mạnh trong 3 giờ đồng hồ, sau đó trung hòa chlorine bằng natrithiosunphat (nồng độ 30ppm) trước khi thả cá. Nước biển dùng để ương nuôi ấu trùng phải được lọc sạch, độ mặn 30-32%o, nhiệt độ 280C-310C, sục khí vừa đủ. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu môi trường: nhiệt độ, pH (đo hằng ngày), NH3-N, NO2-N (mỗi tuần một lần). Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm hệ thống ương ấu trùng cá chẽm Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường Thí nghiệm được thực hiện trên 15 bể composite 100 lít. Thí nghiệm được tiến hành bằng nước biển chưa qua xử lý, được bổ sung NH4Cl một lần vào đầu mỗi thí nghiệm với nồng độ 10 mg/l. Vi khuẩn được bổ sung giống và song song với hệ thống ương nuôi ấu trùng cá chẽm đối với từng nghiệm thức. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu môi trường: nhiệt độ, pH (đo hằng ngày), NH3-N, NO2-N, COD (mỗi tuần một lần). Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Quy trình nhân sinh khối vi khuẩn và bổ sung vi khuẩn 3.5.1.1. Nhân sinh khối vi khuẩn. Được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Ba chủng vi khuẩn sử dụng cho mỗi đợt thí nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, thời gian tối đa 1 tháng. Chỉ bắt đầu nhân sinh khối trước khi bắt đầu thí nghiệm từ 1-2 ngày. Ba chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong 3 erlen (loại 1 lít) khác nhau, có sục khí liên tục. Thể tích nuôi 500ml. Môi trường nuôi sinh khối vi khuẩn là Tryptic Soy Broth (TSB). Cứ sau 2 ngày lại tiến hành cấy chuyển một lần để nhân sinh khối mới. 3.5.1.2. Bổ sung vi khuẩn vào các nghiệm thức. Hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm: có 2 phương pháp : Phương pháp 1: Bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường nước trong bể ương: Mật độ vi khuẩn trong bình nuôi cấy được xác định bằng cách đo quang (OD) bằng máy quang phổ ở bước sóng 600nm. Công thức tính như sau: Mật độ vi khuẩn = 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) Mật độ vi khuẩn cần bổ sung vào bể ương : 105 CFU/ml. Bổ sung vào bể trước khi cho trứng vào ấp. Sau đó bổ sung 2 ngày 1 lần. Công thức tính thể tích dịch vi khuẩn cần thiết bổ sung vào mỗi bể: Thể tích bể nuôi x 105 CFU/ml Thể tích vi khuẩn (ml) = Mật độ vi khuẩn Phương pháp 2: Bổ sung vi khuẩn gián tiếp vào bể ương thông qua giàu hóa thức ăn tự nhiên: Giàu hóa luân trùng (Rotifer): Tính toán số lượng luân trùng cần thiết của mỗi nghiệm thức của 1 lần cho ăn để tiến hành thu luân trùng và làm giàu vi khuẩn trong 10lít/nghiệm thức. Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua luân trùng là: 106 CFU/ml (tính trên thể tích luân trùng sau khi thu). Thể tích vi khuẩn cần thiết để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức (ml) = 106 x thể tích luân trùng sau khi thu x 103 / Mật độ vi khuẩn Thời gian giàu hóa luân trùng: trong 2 giờ (có sục khí). Giàu hóa Artemia: Artemia sau khi nở khoảng 6 giờ cho đến giai đoạn instar 2 (8 giờ sau khi nở) (lúc này ấu trùng Artemia đã mở miệng). Tính toán số lượng Artemia cho ăn cần thiết của mỗi nghiệm thức. Thu và cho vào 5 bình khác nhau tương ứng với 5 nghiệm thức. Xác định thể tích Artemia trong mỗi bình. Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua Artemia là: 106 CFU/ml (tính trên thể tích Artemia sau khi thu). Thể tích cần thiểt để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức: Tương tự như làm giàu thông qua Rotifer. Thời gian giàu hóa Artemia: Trong 2-4 giờ (có sục khí). Không bổ xung vi khuẩn ở các nghiệm thức đối chứng. Sử dụng một chủng vi khuẩn cho mỗi nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần. Hệ thống môi trường Bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường. Mật độ vi khuẩn cần bổ sung vào môi trường nước là 105 CFU/ml. Tiến hành bổ sung 2 ngày 1 lần. Công thức tính thể tích dịch vi khuẩn cần thiết bổ sung vào mỗi bể môi trường cũng tương tự như hệ thống bể ương: Thể tích bể nuôi x 105 CFU/ml Thể tích vi khuẩn (ml) = Mật độ vi khuẩn 3.5.2. Đo các chỉ tiêu thủy hóa 3.5.2.1. Đo pH Dụng cụ: máy đo pH. Cách đo: nhúng trực tiếp đầu máy đo vào bể ương và môi trường, đảo đều, chờ kết quả ổn định và đọc kết quả hiện lên trên máy. 3.5.2.2. Đo nhiệt độ Dụng cụ: nhiệt kế. Cách đo: nhúng trực tiếp nhiệt kế vào nước và đọc kết quả. 3.5.2.3. Đo NH3-N Phương pháp phân tích: phương pháp Indophenol (phenate). Nguyên tắc: phenol và ClO3- phản ứng trong dung dịch có tính kiềm tạo ra phenylquinone-monoimine để tiếp tục phản ứng với amonia tạo thành indophenol theo phản ứng sau: 2 C6H5O - + NH3 + 3 ClO - à -OC6H4N=O + 2 H2O + OH - + 3 Cl – Indophenol làm cho dung dịch có màu xanh, độ đậm phụ thuộc vào nồng độ ammonia. Natri nitropruside được thêm vào để tăng cường màu xanh. Trong phương pháp này cả ammonia và ammonium được đo do trong môi trường kiềm tất cả ammonium chuyển thành ammonia. Đo ở bước sóng 630 nm vì màu xanh này được hấp thu cực đại ở bước sóng này. Cách đo: Lọc nước vào erlen qua giấy lọc Whatman. Đong 50 ml cho vào erlen. Thêm 2 ml dung dịch phenol, lắc đều. Thêm 2 ml dung dịch Natri nitropruside, lắc đều. Thêm 5 ml dung dịch oxy hóa, lắc đều. Để yên mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ. Miệng erlen được phủ bởi giấy nhôm để tránh sự lây nhiễm ammonia từ không khí. Đọc độ hấp thu mẫu ở bước sóng 630 nm. 3.5.2.4. Đo NO2-N Phương pháp phân tích: phương pháp Diazo hóa (0-0.3 mg/l NO2-N hoặc 5-1000 mg/l). Nguyên tắc: NO2-N được xác định thông qua sự hình thành phẩm nhuộm azo màu tím đỏ ở pH = 2.0-2.5 bằng sự ghép nối thông qua liên kết azo giữa sunfanilamide với N-(1-naphthyl)-etylendiamine dihydrocliride (NED dihydrocloride). Hệ màu tuân theo định luật Lambert Beer đến nồng độ 180 microgam/lit với cuvet 1 cm ở 543 nm. Cách đo: Lọc mẫu vào erlen qua giấy lọc Whatman. Đong 50 ml mẫu vào erlen. Thêm 1 ml dung dịch sulfanilamide, lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 1 ml NED, lắc đều, để yên trong 10 phút. Tiến hành đo độ hấp thu mẫu ở bước sóng 540 nm, mẫu trắng là mẫu nước cất. 3.5.2.5. Đo COD Phương pháp phân tích: xác định độ oxy hóa của nước trong môi trường kiềm theo phương pháp permangannat iot thiosulfat. Cách đo: Đong 25 ml mẫu vào erlen. Đong 25 ml nước cất vào erlen. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 25%, thêm 10 ml dung dịch KMnO4 0.01N, đậy giấy bạc và đem đun cách thủy ở 960C trong 90 phút. Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng hay có thể nhúng trong chậu nước. Thêm 2 ml dung dịch H2SO4 25%, thêm 2 ml dung dịch KI 10%, lắc đều và để yên trong 5 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0.01N với chỉ thị là hồ tinh bột (3-5 giọt). Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thủy hóa tại các bể ương ấu trùng. 4.1.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến nhiều phương diện trong đời sống của cá như: hô hấp, tiêu thụ thức ăn, đồng hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng…và có ảnh hưởng không nhỏ đến các chỉ số vật lý, hóa học trong môi trường sống của cá. Đối với ấu trùng cá chẽm có sức sinh trưởng nhanh ở nhiệt độ từ 26 – 30oC. Tiến hành đo nhiệt độ của các bể ương hàng ngày vào lúc 14h và kết quả được biểu diễn ở hình sau: Hình 4.1 – Sự biến thiên nhiệt độ theo ngày Từ hình 4.1 cho thấy nhiệt độ ở các bể ương trong suốt quá trình thí nghiệm diễn ra khá ổn định và chỉ dao động từ 28.50C đến 300C. Mức biến đổi về nhiệt độ sau một ngày luôn không vượt quá 10C, điều đó chứng tỏ nhiệt độ thí nghiệm khá ổn định. Vì các bể ương nuôi được đặt ở trong nhà có mái che, thoáng khí nên không có sự chênh lệch lớn về nhiệt độ nước nuôi khi đo nhiệt độ các bể ương ở cùng một thời điểm trong ngày (cụ thể nhiệt độ được đo vào lúc 14 h hàng ngày). Sự tăng giảm không nhiều về nhiệt độ nước nuôi sau thời gian 1 ngày như vậy sẽ giúp cho ấu trùng cá phát triển tốt và tránh xảy ra hiện tượng sốc nhiệt, đồng thời giảm được sự thay đổi đột ngột của các yếu tố môi trường khác như NH3, NO2 hay ổn định được sự phát triển của các sinh vật, hệ vi sinh trong nước đảm bảo sức khỏe cho ấu trùng cá chẽm trong suốt quá trình ương nuôi. 4.1.2 pH Độ pH của nước rất quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến cá nuôi và phiêu sinh vật. Khi pH quá cao hay quá thấp sẽ không tốt cho sức khỏe của mọi động vật thủy sản, làm thay đổi hệ phiêu sinh vật trong nước nuôi theo chiều hướng không tốt và nhiều yếu tố lý – hóa – vi sinh trong môi trường cũng biến động. Theo Đỗ Văn Khương và cộng tác viên năm 2001 cho rằng, giá trị pH thích hợp cho ương nuôi ấu trùng cá chẽm là 7.5 – 8.5. Trong suốt quá trình thí nghiệm, giá trị pH được đo hàng ngày vào lúc 14h và kết quả được thể hiện dưới bảng sau: Hình 4.2 – Sự biến thiên pH theo ngày Sự chênh lệch độ pH của nước ương nuôi ấu trùng cá chẽm, so sánh giữa các nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn với nhau và với nghiệm thức đối chứng trong cùng một ngày là rất nhỏ (độ pH chênh lệch không quá 0.3 giữa các nghiệm thức). Đặc biệt, ta thấy pH nước ở các bể ương biến động nhiều giữa các ngày liên tiếp trong giai đoạn ấu trùng được 13 ngày tuổi đến 23 ngày tuổi. Độ pH tăng dần từ ngày tuổi thứ 11 đến ngày tuổi thứ 16 và pH cao nhất đạt 8,7. Sau đó lại thấy pH giảm dần đến ngày tuổi thứ 23, rồi ổn định hơn ở giai đoạn 24 – 30 ngày tuổi. Sự biến động pH như vậy có thể là do biến động lượng chất hữu cơ và sự phân hủy các chất hữu cơ trong nước nuôi. Điều này liên quan đến các