Đồ án Khảo sát khả năng nhiễm Coliforms và E.coli trong nước uống, nước uống có gas trên địa bàn quận Bình Thạnh, TP. Hồ Chí Minh

hất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trường. E.coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. 2.2.2.2. Phân loại Dựa vào đặc điểm gây bệnh gồm các đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh. E.coli được chia thành 5 nhóm: VTEC (Verotoxigenic E.coli) hoặc STEC (Shiga toxin – producing E.coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), E.coli gây xuất huyết ở ruột. EPEC (Enteropathogenic E.coli), E.coli gây bệnh đường ruột. ETEC (Enterotoxigenic E.coli), E.coli sinh độc tố ruột. EAGGEC hay EAEC (Enteroaggregative E.coli), E.coli kết tập ở ruột. EIEC (Enteroinvasive E.coli), E.coli xâm lấn niêm mạc ruột. 2.2.2.3. Đặc điểm a. Đặc điểm chung E.coli là trực khuẩn Gram âm, hình que ngắn, kích thước trung bình từ 0,5 x 1 – 3µm hai đầu tròn, di động bằng tiên mao quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có vỏ bao capsule, loại không có động lực thì không có vỏ bao capsule. Theo hệ thống phân loại của Bergey, vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc: Lớp: Schgzomycetes Bộ: Eubacteriales Họ: Enterobacteriaceae Gống: Escherichia Loài: Eschierchia Coli Hình 2.1: Vi khuẩn Escherichia E.coli Escherichia coli còn có tên là Bacteriam colic được ông Theodor Eschrich nhà nghiên cứu người Đức phát hiện và phân lập năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em. b. Đặc điểm sinh hóa E.coli lên men sinh hơi lactose, glucose, manitol, galactose, không sinh hơi đường maltose, lên men không đều saccarose, không lên men dextrin, glycogen. E.coli không sinh H2S, không tan chảy gelatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành nitrite. Phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác thông qua thử nghiệm IMViC: + + - -; phản ứng Indol dương tính (+), phản ứng Methyl Red (MR) dương tính (+), phản ứng Voges – Proskauer (VP) âm tính (-) và Citrate âm tính (-). c. Đặc điểm nuôi cấy E.coli là loại hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển từ 35 – 370C, nhưng có thể phát triển trên 400C, pH thích hợp 6,4 – 7,5 nhưng pH tối ưu nhất từ 7,2 – 7,4. Trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA) tạo khuẩn lạc tròn ướt (dạng S) sau 24 giờ, màu trắng đục hơi lồi, kích thước khoảng 2 – 3mm, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn (dạng R). Trên thạch máu có chủng dung huyết α hoặc β. Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt EMB (Eozin Methylen Blue) tạo khuẩn lạc có ánh kim tím. Trên môi trường Rapid có khuẩn lạc màu tím. Trên môi trường MacConkey (MCK) khuẩn lạc màu hồng đỏ. Trên thạch Gelatin không tan chảy. Trên môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron Agar: E.coli tạo acid/acid màu vàng/vàng. Trên môi trường Kliger Iron Agar (KIA) lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng), sinh gas, không sinh H2S. Trên môi trường Brilliant Green Agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ. Trên môi trường canh dinh dưỡng: sau 4 – 5giờ E.coli làm đục nhẹ môi trường, để càng lâu càng đục, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt hay xám, sinh H2S có mùi hôi thối, sau vài ngày có thể có váng mỏng nổi trên mặt môi trường. 2.2.2.4. Kháng nguyên E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Năm 1947 Kauffmann đưa ra hệ thống phân nhóm huyết thanh (serotype) dựa vào việc xác định kháng nguyên bề mặt O, H, K. a. Kháng nguyên thân O (somatic antigen): có bản chất là lipopolysaccharide của màng ngoài tế bào, bền với nhiệt và cồn. Khi đung nóng ở 1000C trong 2 giờ vẫn giữ được tính kháng nguyên, kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%, bị hủy bởi formol 5%, rất độc chỉ cần 0,05mg đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ. Kháng nguyên O có thể phát hiện được bằng phản ứng ngưng kết. Kháng nguyên O giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của dòng vi khuẩn và có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Kháng nguyên O tạo nền tảng cho việc phân loại serogroup của E.coli. Có hơn 170 serogroup kháng nguyên O và được chia làm 4 nhóm chính OI, OII, OIII, OIV. Trong mỗi serogroup có một hay nhiều serotype, kháng nguyên O bám vào nhung mao ruột làm giảm sự hấp thụ. b. Kháng nguyên lông H (flagellar antigen): có bản chất là protein, tạo nên khả năng di động của E.coli, kém chịu nhiệt, bị hủy bởi cồn 50% và các proteinase, không bị hủy bởi formol 5% , có khoảng 50 type kháng nguyên H. c. Kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen): kháng nguyên K lúc đầu được xác định bằng phản ứng ngưng kết. Người ta xác định có sự hiện diện của kháng nguyên K ở vi khuẩn nếu vi khuẩn chỉ ngưng kết với kháng nguyên huyết thanh O khi bị đun nóng. Dựa vào khả năng chịu nhiệt người ta chia kháng nguyên K thành 3 type là A, L và B. Về sau người ta phân loại kháng nguyên K dựa vào thành phần hóa học của chúng và đã có hơn 80 loại kháng nguyên K được xác định. Hình 2.2: Vị trí các loại kháng nguyên trên E.coli 2.2.2.5. Độc tố a. Khả năng gây bệnh của STEC STEC sản xuất độc tố Shiga toxin (Stx). Họ độc tố Stx gồm 2 nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, Stx1 có tính bảo tồn cao, trong khi đó Stx2 rất thay đổi về trình tự. Một dòng STEC có thể sản sinh Stx1 hay Stx2 hoặc cả Stx1 và Stx2, thậm chí nhiều dạng của Stx2. Cả hai độc tố Stx1 và Stx2 đều được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B 7,7kDa và 1 tiểu đơn vị A 32kDa. Tiểu đơn vị A gồm peptide A1 28kDa và peptide A2 4kDa nối với nhau bằng cầu disulfur. Peptide A1 có hoạt tính enzyme và peptide A2 có nhiệm vụ gắn tiểu đơn vị A vào những tiểu đơn vị B. Những tiểu đơn vị B giúp độc tố kết hợp với receptor đặc hiệu Gb3 (globotriaosylceramide) hiện diện trên bề mặt của những tế bào eukaryote (Stx2e có receptor là Gb4). Sau khi được chuyển vào bên trong tế bào tiểu đơn vị A đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của ribosome. Peptide A1 có hoạt tính enzyme hoạt động như một N – glycosidase cắt một gốc adenine khỏi rRNA 28S của ribosome, do đó gây trở ngại cho tổng hợp ribosome. Do không tổng hợp được protein, những tế bào bị Stx tác động (tế bào nội mô của thận, tế bào biểu mô ruột, tế bào Vero, tế bào Hela hay bất cứ tế bào nào có receptor là Gb3, receptor Gb4 đối với Stx2e) sẽ chết. Hậu quả gây độc cho tế bào ruột do Stx và các yếu tố độc lực khác của STEC là gây sự hư hại những tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy và viêm kết màng xuất huyết (haemorrhagic colits – HC). Sự hư hại những tế bào thành mạch máu do Stx2 gây ra sẽ dấn đến hiện tượng phù thủng. Những tổn thương ở tế bào nội mô thận gây nên hội chứng huyết niệu (haemolytic uraemic syndrome) – HUS) ở người. b. Khả năng gây bệnh của EPEC EPEC là nhóm E.coli gây tiêu chảy quan trọng có liên quan đến tiêu chảy ở trẻ sơ sinh tại những nước đang phát triển. Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay những thú nhiễm bệnh và trong nuôi cấy tế bào. Kiểu hình riêng biệt này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự dính kết chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô. Moon và ctv (1983) báo cáo rằng kiểu tổn thương này liên quan rộng rãi đến EPEC thì thuật ngữ “ngắn kết và gây hư hại” (“attaching và effacing” – A/E) mới được đưa ra. Gen cần thiết cho việc tạo ra tổn thương A/E là gen eae mã hóa protein intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC. Đáp ứng viêm tại chỗ và sự tăng tính thấm của ruột trong đáp ứng với EPEC góp phần vào tiêu chảy. Điểm đáng lưu ý nhất về mặt dịch tễ học của bệnh do EPEC về sự phân bố về lứa tuổi của người bệnh. Bệnh chủ yếu xảy ra tên trẻ em dưới 2 tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng. Lý do liên quan đến khả năng đề kháng được với người trưởng thành và trẻ em lớn còn chưa được biết rõ nhưng có lẽ là do mất các receptor đặc hiệu. Tuy nhiên EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ lớn. c. Khả năng gây bệnh của Enterotoxigenic E.coli (ETEC) Nhóm ETEC gồm có hai nhóm quyết định độc lực chính là độc tố ruột (Enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization facter – CF). Độc tố ruột Enterotoxin Nhóm ETEC gồm những E.coli tạo ra ít nhất một trong hai loại độc tố đường ruột ST và LT. ETEC gây bệnh bằng cách vi khuẩn bám vào bề mặt màng nhày ruột non và tiết ra độc tố ruột, làm gia tăng tình trạng tiết dịch. Nhóm ETEC gây tiêu chảy thông qua việc tiết độc tố đường ruột ST và LT. E.coli, nhóm này có thể chỉ tiết độc tố ST hay LT hoặc cả hai. Độc tố không chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): độc tố LT của E.coli là oligopeptide gồm có hai serogroup chính là LT – I và LT – II, chúng không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch. LT – I được tiết bởi những dòng E.coli gây bệnh trên người và thú, còn LT – II được tìm thấy chủ yếu ở E.coli trên thú và hiếm khi ở người. LT – I là một oligopeptide khoảng 86kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm trong hoạt tính enzyme của độc tố gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kiết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột – chúng là các receptor của LT. Gen mã hóa cho LT là elt hay LT – I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và hoặc cả gen mã hóa kháng nguyên chứa yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA). Sau khi độc tố đi vào nội bào, chúng di chuyển trong tế bào nhờ hệ thống vận chuyển Golgi. Đích của LT trong tế bào là enzyme andenylate cyclase nằm ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột. Peptide A có hoạt tính ADP – ribosyltransferase chuyển phần ADP – rybosyl từ NAD đến của protein liên kết GTP là Gs, gây hoạt hóa enzyme adenylate cyclase, làm tăng AMP vòng (cAMP) trong tế bào. Vì vậy, enzyme cAMP – dependent protein kinase (A kinase) được hoạt hóa dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thu NaCl bởi những tế bào có lông nhung. Hàm lượng ion trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột gây tiêu chảy. LT – II: nhóm LT – II giống với LT – I khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị A nhưng không giống ở tiểu đơn vị B, LT – II không liên quan đến bệnh trên người và thú. Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST): ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả 2 nhóm chủ yếu được tìm thấy trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. STa và STb đều được tạo bởi ETEC. STa là một peptide gồm 18 – 19 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 2kDa. Receptor chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cylase C (GC – C). Sự kết hợp của STa vào GC – C kích thích hoạt tính GC dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự kích thích tiết Cl- và hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl, gây sự tiết chất lỏng trong ruột. STb không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Receptor của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố có thể kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào trong tế bào. Không tạo ra sự tiết Cl- như STa, nhưng kích thích tế bào ruột tiết bicarbonate (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng canxi nội bào từ ngoại bào. Yếu tố định vị (colonization factor – CF) Để gây tiêu chảy ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ lông trên bề mặt của vi khuẩn gọi là yếu tố định vị (CF). d. Enteroaggregative E.coli (EAEC hay EAggEC) EAEC hay EAggEC là nhóm E.coli không sinh enterotoxin và bám dính vào tế bào Hep – 2 theo kiểu bám dính kết tập (aggregative adhetion – A/A). Nhóm EAEC gồm cả dòng E.coli gây bệnh và không gây bệnh. Tất cả các EAEC đều có 60MDa chứa gen tạo tổn thương dạng A/A và mã hóa A/A trên plasmid cần thiết cho quá trình gây bệnh. EAEC gây tiêu chảy kéo dài (trên 14 ngày). Trong hầu hết các báo cáo đều mô tả EAEC ở các ca tiêu chảy lẻ tẻ nhưng cũng có thể là tác nhân gây thành ổ dịch. e. Khả năng gây bệnh của Enteroinvasive E.coli (EIEC) Triệu chứng lâm sàng của bệnh do những E.coli dòng EIEC bao gồm sốt, đau bụng quặn, khó chịu, nhiễm trùng máu và tiêu chảy nước hay bệnh lỵ điển hình với máu, dịch nhày và nhiều bạch cầu trong phân. EIEC có khả năng xâm nhập vào tế bào biểu mô kết tràng và chúng điều tiết một hay nhiều độc tố ruột liên quan đến tiêu chảy. EIEC cũng có thể gây tiêu chảy ở khách du lịch và liên quan đến những vụ ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm. Tóm lại, một số gen độc lực quan trọng của những nhóm E.coli bao gồm: Bảng 2.2: Các gen độc lực quan trọng của E.coli STT Gen độc lực Nhóm E.coli 1 2 3 4 5 6 7 8 Eae Hly Stx1 Stx2 Stx2e Sta Stb LT - I EPEC, STEC STEC STEC STEC STEC ETEC ETEC ETEC 2.2.2.6. Tình hình nhiễm Coliforms và E.coli là vi khuẩn thường thấy trong ruột người và động vật máu nóng. Coliforms là vi sinh vật chỉ thị an toàn thực phẩm, trong khi đó hầu hết các chủng E.coli vô hại. tuy nhiên, một số chủng có thể gây bệnh nghiêm trọng. Nó xâm nhiễm vào con người chủ yếu thông qua tiêu thụ thức ăn, thức uống bị ô nhiễm, chẳng hạn như sản phẩm thịt chưa nấu chín dính bụi bẩn hay các loại nước giải khát nhiễm khuẩn hoặc các loại rau củ quả chưa được ngâm và rửa sạch. E.coli O157: H7 là EHEC serotype quan trọng nhất liên quan đến các dịch bệnh. Các triệu chứng của bệnh gây ra bởi EHEC bao gồm đau bụng và tiêu chảy có thể có trong một số trường hợp tiến triển thành bệnh tiêu chảy máu (xuất huyết viêm đại tràng), sốt và ói mửa cũng có thể xảy ra. Ngoài ra, tiêu chảy là một nguyên nhân chính của suy dinh dưỡng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn EHEC thay đổi theo nhóm tuổi nhưng tỷ lệ mắc cao nhất thường xảy ra ở trẻ em độ tuổi dưới 15 với khoảng 100000 trường hợp tại tại Hoa Kỳ năm 1982. Năm 1996, một ổ dịch của E.coli O157: H7 liên quan đế thức ăn và đồ uống đường phố tại Nhật Bản làm hơn 6300 học sinh bị ảnh hưởng và kết quả là 2 ca tử vong. Ngày 15/5/2000, tại Ontario, Canada. Các đơn vị y tế công cộng cho biết tại thị trấn Walkerton với dân số 5000 đã có một ổ dịch của E.coli O157: H7 làm 5 người thiệt mạng và 27 ca nằm viện. Số lượng ca mắc ngộ độc thực phẩm và đồ uống là khó xác định chính xác, nhưng một được báo cáo của WHO nói rằng trong năm 2005 đã làm 1.800.000 người chết vì bệnh tiêu chảy. Ở các nước công nghiệp hóa, tỷ lệ phần trăm của dân số bị bệnh từ thực phẩm mỗi năm đã được báo cáo để được lên đến 30%. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm này ở các nước đang phát triển chắc chắn sẽ còn cao hơn nhiều so với các nước phát triển và điều này đã gây thiệt hại nặng về người và tổn hại nền kinh tế. Sự xuất hiện lại của dịch tả tại Peru vào năm 1991 có trong xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản và cá dẫn đến sự mất mát của Mỹ 500000000 USD năm đó. Tại Mỹ, các dịch bệnh liên quan ước tính chi phí lên đến 35 tỷ USD hàng năm. (Theo Tổ chức Y tế thế giới) Trong khi đó, tháng 7/2007 tại Đà Nẵng, Việt Nam 53% mẫu thức ăn và đồ uống đường phố nhiễm Coliforms và 25,3% thức ăn nhiễm E.coli, đó là con số thống kê của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng qua đợt kiểm tra gần 400 cơ sở thức ăn và đồ uống đường phố trong thời gian vừa qua. (Trung tâm Y tế dự phòng thành phố Đà Nẵng (2007), Báo cáo vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố). 2.3. Một số phương pháp định lượng vi sinh vật trong nước 2.3.1. Phương pháp đổ đĩa 2.3.1.1. Khái niệm Phương pháp đổ đĩa hay còn gọi là phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống, hiện diện trong mẫu. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Phương pháp này cho phép định lượng chọn lọc vi sinh vật tùy môi trường và điều kiện nuôi cấy. Phương pháp đếm khuẩn lạc có thể thực hiện bằng kỹ thuật hộp đổ hay hộp trải với các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả. Số lượng khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa phụ thuộc vào lượng mẫu sử dụng, môi trường và điều kiện ủ. Các tế bào trên đĩa không tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc với tốc độ như nhau, do vậy nhiều tế bào chưa kịp hình thành khuẩn lạc nếu thời gian ủ chưa đủ dài. Thông thường trong điều kiện nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ, thời gian) cần đảm bảo sao cho số lượng khuẩn lạc xuất hiện tối đa. Phương pháp đếm khuẩn lạc dễ cho sai số lớn nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất hai đĩa. Phương pháp đếm khuẩn lạc được cho là tốt nhất để xác định mật độ tế bào sống. Ngoài ra, phương pháp này còn có ưu điểm là độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu. Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nước, thực phẩm, bệnh phẩm. 2.3.1.2. Quy trình thực hiện a. Pha loãng mẫu theo dãy thập phân Mẫu được pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 10-1, 10-2,…. Mỗi bậc pha loãng là 1/10 được thực hiện bằng cách dùng 1ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trước đó) thêm vào 9ml nước hoặc môi trường trong ống nghiệm. Hình 2.3: Hệ thống pha loãng mẫu b. Kỹ thuật đổ đĩa Dùng pipetman và đầu tip vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri. Đổ khoảng 15 – 20ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 – 550C vào đĩa petri đã cấy mẫu. Xoay nhẹ đĩa petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch giống được trộn đều trong môi trường cấy. Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên, lật ngược đĩa lại mang ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. 2.3.1.3. Cách tính kết quả Công thức tính số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu nước như sau: A = N / (n1v1f1 + n2v2f2 + n3v3f3 + … + nivifi) Trong đó: A: tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong 1ml (g) mẫu N: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1: số đĩa ở độ pha loãng f1 ni: số đĩa ở độ pha loãng fi vi: thể tích mẫu lấy ở mỗi độ pha loãng fi: độ pha loãng 2.3.2. Phương pháp màng lọc Phương pháp này thường được dùng để định lượng vi sinh vật chỉ thị trong mẫu nước khi tiến hành các thử nghiệm môi trường nơi có mật độ vi sinh tương đối thấp. Phương pháp này bao gồm bước lọc để tập trung vi sinh vật trong một mẫu nước trên màng lọc và xác định số tế bào vi sinh vật dựa vào số khuẩn lạc đếm được sau khi đặt màng lọc lên trên môi trường thạch có thành phần môi trường dinh dưỡng thích hợp cho loại vi sinh cần kiểm tra. Dựa trên khối lượng mẫu nước ban đầu và quy ước là mỗi khuẩn lạc được hình thành từ một tế bào vi sinh vật, người ta quy ra số lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích. Như vậy, phương pháp này là sự kết hợp của phương pháp lọc vô trùng và phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa petri. Màng lọc có kích thước lỗ là 0,45µm hoặc 0,2µm được chế tạo từ các nguyên liệu là các sợi thủy tinh siêu mảnh, sợi polypropylene, thường được cung cấp trong trạng thái vô trùng. Ngoài màng lọc bình thường hiện nay, người ta còn sử dụng màng lọc kỵ nước trên đó có in các ô vuông bằng vật liệu kỵ nước. Các vạch chia ô bằng vật liệu này ngăn càn sự mọc lan của các khuẩn lạc. Khác với trường hợp màng lọc bình thường, từ số các ô vuông có khuẩn lạc mọc, mật độ vi sinh vật trong mẫu được tính và trình bày dưới dạng số có xác suất lớn nhất (MPN) của lượng vi sinh vật có trong một đơn vị thể tích theo mẫu công thức: MPN = Nln(N/N – x) Trong đó: N: tổng số các ô vuông x: ô có số khuẩn lạc mọc 2.3.3. Phương pháp MPN (Most Probable Number) 2.3.3.1. Khái niệm Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu. Đây là phương định lượng dựa trên kết quả tính của một loạt thí nghiệm lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm. 2.3.3.2. Quy trình thực hiện Cho vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp (ví dụ 1/10, 1/100, 1/1000). Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng sinh hơi, đổi màu, đục...), ghi nhận số ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng. Sử dụng số liệu này nà dựa vào bảng Mac Cardy suy ra mật độ vi sinh vật được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. 2.3.3.3. Cách lập chỉ số MPN Trường hợp 1: có ít nhất ba ống dương tính cho một độ pha loãng. Chọn độ pha loãng cao nhất (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất) cho ba ống dương tính, cùng với hai độ pha loãng cao hơn kế tiếp (tức là độ pha loãng này có nồng độ mẫu là 1/10 và 1/100 của độ pha loãng thứ nhất đã được chọn). Nếu các dịch pha loãng tiếp theo ngoài dịch pha loãng cao nhất cũng cho ba ống dương tính thì chọn tiếp ba độ pha loãng cao nhất trong cả dãy (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất). Trường hợp 2: không có độ pha loãng nào cho ba ống dương tính. Chọn ba độ pha loãng cao nhất trong dãy pha loãng (tức là những độ pha loãng có nồng độ mẫu nhỏ nhất), trong số đó ít nhất thu được một kết quả dương tính. Các trường hợp đặc biệt: trong tất cả các trường hợp khi có nhiều hơn một trong ba độ pha loãng được chọn theo trường hợp 1 và 2 không cho ống dương tính, thì hãy chọn từ các độ pha loãng này độ pha loãng thấp nhất không cho các ống dương tính (tức là độ pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất) và hai độ pha loãng thấp hơn kế tiếp trong dãy pha loãng (tức là có nồng độ mẫu gấp 10 lần và 100 lần độ pha loãng thứ nhất đã chọn), trừ khi các ống dương tính chỉ tìm thấy ở mức pha loãng đầu tiên được chuẩn bị từ mẫu thử trong trường hợp cuối cùng này cần chọn ra ba độ pha loãng đầu tiên để tính MPN thậm chí loạt ống này bao gồm hai độ pha loãng không cho các ống dương tính nào. 2.3.3.4. Cách tính kết quả Số vi sinh vật trên ml hoặc trên gam của sản phẩm được tính bằng cách nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn (tức là dịch pha loãng có nồng độ mẫu cao nhất). Khi độ pha loãng thấp nhất được chọn tương ứng với các ống được chuẩn bị với môi trường nồng độ kép (tức là cấy với 10ml), thì trước hết hãy chia chỉ số MPN cho 10. Hình 2.4: Hệ thống định lượng vi sinh vật bằng MPN Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm và thời gian 3.1.1. Địa điểm Đề tài được thực hiện tại phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Thời gian Thời gian thực hiện đề tài từ 05/04/2010 đến 05/07/2010. Vật liệu Mẫu Mẫu được lấy tại các quán nước giải khát trên địa bàn quận Bình Thạnh. Các mẫu gồm: Mẫu nước không đóng chai: nước mía, sâm và rau má. Mẫu nước đóng chai có gas: nước khoáng Vĩnh Hảo, Pepsi, và 7up Revive. Mẫu nước đóng chai không có gas: trà xanh không độ O0, trà xanh C2, nước khoáng Joy và Sapuwa. Hóa chất và môi trường 3.2.2.1. Hóa chất Thuốc thử Kovac’s, Methyl Red, dung dịch α – naphthol, KOH 40%, cồn 960, 700 và nước cất. 3.2.2.2. Môi trường a. Môi trường lỏng Lactose Broth (LB) b. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (canh BGBL) c. Môi trường EB Broth (canh EC) d. Môi trường Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB) e. Môi trường canh Trypton (Tryptophane) Borth 1% f. Môi trường MR – VP Broth g. Môi trường Simmon Citrate Agar Dụng cụ và thiết bị 3.2.3.1. Dụng cụ Bình các loại 500ml, 250ml, 100ml… Cốc thủy tinh loại 200ml, 100ml Ống nghiệm, ống durham Đĩa petri Pipet các loại 10ml, 1ml, 0,1ml Pipetman Đầu týp Đèn cồn Que cấy vòng, thẳng Giá ống nghiệm Quẹt gas Bông gòn (loại thấm và không thấm nước) Bao PE vô trùng Giấy dầu Đũa khuấy 3.2.3.2. Thiết bị Tủ ấm 370C Tủ ủ Tủ lạnh Nồi hấp Autoclave Cân phân tích Bể điều nhiệt Tủ cấy 3.3. Bố trí thí nghiệm 3.3.1. Thu mẫu Mẫu được lấy vào buổi sáng tại các quán nước giải khát trên địa bàn quận Bình Thạnh. 3.3.2. Thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên. Các mẫu nước được lấy tại những nơi khác nhau và mỗi mẫu lặp lại 3 lần tại cùng một nơi đã chọn ban đầu trên địa bàn quận Bình Thạnh. 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Định lượng Coliforms và E.coli bằng phương pháp MPN (Most Probable Number) 3.4.1.1. Thử nghiệm giả định Đối với mẫu nước không đóng chai: chọn dãy nồng độ pha loãng kế tiếp nhau (10-2, 10-3, 10-4). Xếp 9 ống nghiệm chứa 10ml môi trường Lactose Broth vô trùng có ống durham lên giá ống nghiệm làm 3 dãy. Dùng 1 pipet 1ml khử trùng hút 1ml mẫu nước tại nồng độ 10-2 vào 3 ống dãy 1, tiếp tục lấy pipet 1ml vô trùng hút 1ml mẫu 10-3 vào 3 ống dãy 2. Tương tự, dùng pipet 1ml đã vô trùng hút 1ml mẫu 10-4 vào 3 ống dãy 3. Lắc nhẹ mỗi ống để trộn đều mẫu nước với