Đồ án Khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nuôi cấy mô sẹo cây kim ngân (lonicera japonica thunb.)

t công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng. Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng). Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng củatế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs, 1999). Hình 2.13: sơ đồ tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong thực vật Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao. Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal và Tsay, 2004). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Lee và Shuler, 2000; Wang và cs, 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs, 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs, 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff, 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ mô sẹo có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1980) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine cao của loài (1981) C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu xuất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/l (Misawa 1994). Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô mô sẹo P. ginseng để phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa mô sẹo vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy mô sẹo cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Mô sẹo sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Mô sẹo sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong mô sẹo tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs, 2003). Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) Loài thực vật Hợp chất thứ cấp Dạng nuôi cấy Tham khảo Agave amaniensis Saponins Mô sẹo Andrijany và cs 1999 Ailanthus altissima Alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1987 Ailanthus altissima Canthinone alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1986 Allium sativum Alliin Mô sẹo Malpathak và David 1986 Aloe saponaria Tetrahydroanthracene Huyền phù Yagi và cs 1983 Ambrosia tenuifolia Altamisine Mô sẹo Goleniowski và Trippi 1999 Anchusa officinalis Rosmarinic alkaloids Huyền phù De-Eknamkul và Ellis 1985 Brucea javanica Canthinone alkaloids Huyền phù Liu và cs 1990 Bupleurum falcatum Saikosaponins Mô sẹo Wang và Huang 1982 Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của γ-glutamyl Huyền phù Orihara và Furuya 1990 Canavalia ensiformis L-Canavanine Mô sẹo Ramirez và cs 1992 Capsicum annuum Capsaicin Huyền phù Johnson và cs 1990 Cassia acutifolia Anthraquinones Huyền phù Nazif và cs 2000 Catharanthus roseus Indole alkaloids Huyền phù Moreno và cs 1993 Catharanthus roseus Catharanthine Huyền phù Zhao và cs 2001 Choisya ternata Furoquinoline alkaloids Huyền phù Sejourne và cs 1981 Chrysanthemum cinerariaefolium Pyrethrins Mô sẹo Rajasekaran và cs 1991 Chrysanthemum cinerariaefolium Chrysanthemic acid và pyrethrins Huyền phù Kuel và cs 1985 Cinchona L. Alkaloids Huyền phù Koblitz và cs 1983 Cinchona robusta Robustaquinones Huyền phù Schripsema và cs 1999 Cinchona sp. Anthraquinones Huyền phù Wijnsma và cs 1985 Cinchona succirubra Anthraquinones Huyền phù Barthe và cs 1987 Citrus sp. Naringin, Limonin Mô sẹo Barthe và cs 1987 Coffea arabica Caffeine Mô sẹo Waller và cs 1983 Cornus kousa Polyphenols Huyền phù Ishimaru và cs 1993 Corydalis ophiocarpa Isoquinoline alkaloids Mô sẹo Iwasa và Takao 1982 Croton sublyratus Plaunotol Mô sẹo Morimoto và Murai 1989 Cruciata glabra Anthraquinones Huyền phù Dornenburg và Knorr 1996 Cryptolepis buchanani Cryptosin Mô sẹo Venkateswara và cs 1987 Digitalis purpurea Cardenolides Huyền phù Hagimori và cs 1982 Dioscorea deltoidea Diosgenin Huyền phù Heble và Staba 1980 Dioscorea doryophora Diosgenin Huyền phù Huang và cs 1993 Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Endo 1984 Ephedra spp. L-Ephedrine, D-pseudoephedrin Huyền phù O’Dowd và cs 1993 Eriobotrya japonica Triterpenes Mô sẹo Taniguchi và cs 2002 Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất phenolic Mô sẹo Venkateswara và cs 1986 Eucommia ulmoides Chlorogenic acid Huyền phù Wang và cs 2003 Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985 Gentiana sp. Secoiridoid glycosides Mô sẹo Skrzypczak và cs 1993 Ginkgo biloba Ginkogolide A Huyền phù Carrier và cs 1991 Glehnia littoralis Furanocoumarin Huyền phù Kitamura và cs 1998 Glycyrrhiza echinata Flavonoids Mô sẹo Ayabe và cs 1986 Glycyrrhiza glabra var. glandulifera Triterpenes Mô sẹo Ayabe và cs 1990 Hyoscyamus niger Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Hashimoto 1982 Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và cs 1999 Linum flavum 5-Methoxypodophyllo-toxin Huyền phù Uden và cs 1990 Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990 Lycium chinense Cerebroside Huyền phù Jang và cs 1998 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliacea Chi: Lonicera L Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.14: hoa Kim ngân Mô tả cây Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn dài tới 10m hay hơn. Cành lúc còn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyển màu nâu đỏ nhạt, nhẵn. Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn, cuống ngắn 2 – 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn. Vào các tháng 5 – 8, hoa mọc từng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 1 cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lá bắc giống lá nhưng nhỏ hơn. Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4 thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở một thời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc, lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng, ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đông nghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài cao hơn nhị, mùi thơm dễ chịu. Quả hình trứng dài chừng 5mm. Phân bố, thu hái và chế biến Kim ngân là một cây loại mọc hoang dại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta, nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ. Một số nơi người ta bắt đầu trồng lấy hoa và cành lá làm thuốc. Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đến tháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát. Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng. Đất đai và khí hậu Hà Nội cũng rất thích hợp. Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻ dài chừng 20–60 cm, khoanh thành khoanh, chôn xuống dưới đất, để chừa đoạn sau cùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều. Có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất vào tháng 9–10 hoặc tháng 2 -3. Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâu năm, càng về những năm sau càng nhiều hoa. Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nở hay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyển vàng. Có thể hái hoa riêng, cành lá riêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá riêng, hoa riêng. Hoa hay cành lá hái về phơi hay sấy khô là dùng được. Không phải chế biến gì khác. Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối dễ vì ít bị mốc, mọt. Thành phần hóa học Hoa và lá chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid (lonicerin=scolymosid). Một số chất carotenoid: ξ-caroten, β-cryptoxanthin, auroxanthin. Acid chlorogenic và các đồng phân của nó. Lá có loganin và secologanin. (2) (1) Hình 2.15: (1) scolymosid, (2) β-cryptoxanthin (3) (5) (4) Hình 2.16: (3) acid chlorogenic, (4) loganin, (5) secologanin Tác dụng dược lý Tác dụng kháng sinh – tác dụng kháng sinh được nhiều nhà nghiên cứu chú ý và chứng minh trong thực nghiệm. Người ta thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ cầu khuẩn vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga. Nước sắc có tác ụng mạnh hơn các dạng bào chế khác. Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đối với vi trùng thương hàn, tả, liên cầu khuẩn tiêu máu (vòng vô khuẩn tới 11–20 mm), vi trùng lỵ, trực khuẩn E.coli, tụ cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, đối với bạch hầu cũng có tác dụng nhưng kém hơn (2-10mm). Bảng 2.3: nồng độ loãng nhất có tác dụng ức chế đối với sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn Nồng độ pha loãng Vi khuẩn lỵ Shiga 1/640 Vi khuẩn lỵ Flexner 1/1280 Sonnei 1/320 Thương hàn (Samonella) 1/300 Vi khuẩn phó thương hàn A 1/300 Phó thương hàn B 1/300 Tả (Vibrio cholerae) 1/160 Trực khuẩn E.coli 1/160 Dịch hạch (Yersinia pestis) 1/1280 Tụ cẩu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) 1/40 Liên cầu khuẩn tiêu máu A 1/320 Liên cầu khuẩn tiêu máu B 1/160 Bạch hầu (Corynebacterium diphtheriae) 1/80 Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) 1/60 Năm 1960, Sở nghiên cứu Trung y dược tỉnh Giang Tây Trung Quốc có nghiên cứu so sánh tác dụng kháng sinh của nước sắc hoa Kim ngân là nước sắc lá Kim ngân thì đã đi tới kết luận là nước sắc lá Kim ngân với nồng độ 20 – 1.2% có tác dụng ức chế vi trùng lỵ Shiga, nước sắc lá Kim ngân với nồng độ 20 – 5% có tác dụng ức chế đối với vi trùng phó thương hàn A, nồng độ 100% có tác dụng đối với tụ cầu khuẩn, nhưng đặc biệt các tác giả nhận thấy nước sắc hoa Kim ngân lại hoàn toàn không có tác dụng kháng sinh. Các tác giả cho rằng tác dụng kháng sinh còn lệ thuộc vào thời kỳ thu hái hoa, và còn tiếp tục nghiên cứu. Tác dụng trên đường huyết – năm 1930, Mẫn Bính Kỳ (Dược lý đích sinh dược học, 1993) đã thông báo sau khi cho thỏ uống nước sắc hoa Kim ngân thì lượng đường huyết tăng; hiện tượng này kéo dài 5 – 6 giờ mới trở lại bình thường. Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ - năm 1996, Đỗ Tất Lợi, Nguyễn Năng An và Bùi Chí Hiếu (Hội nghị thuốc nam lần thứ 4, Hà Nội) đã báo cáo nước sắc Kim ngân có khả năng chặn choáng phản vệ trên chuột lang được uống Kim ngân, CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2010 tại phòng thí nghiệm CNSH thực vật trường Đại học Kỹ thuật công nghệ TP. HCM, khoa môi trường và công nghệ sinh học. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu bao gồm: Đối tượng nuôi cấy: lá cây Kim ngân Đối tượng nghiên cứu kháo sát hợp chất thứ cấp: lá, cành tự nhiên, mô sẹo trên hai môi trường, hoa khô. Là và cành tự nhiên của cây Kim ngân (Lonicera japonica) được trồng tại thành phố HCM, phải khỏe, có sức sống tốt, không bị sâu hại và đang trong giai đoạn ra hoa. Mô sẹo được phát sinh từ lá Kim ngân của cây Kim ngân trên và nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.1 mg/l 2,4–D kết hợp với 1mg/l BA và môi trường MS có bổ sung 0.5 mg/l TDZ kết hợp với 0.05 mg/l IBA. Hoa sấy khô được cung cấp bởi khoa đông y thuộc bệnh viện Gò Vấp Tp. HCM, là loại tốt, không bị mọt và nấm mốc. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: máy nghiền mẫu, cân phân tích, tủ hút, giá ống nghiệm, bộ TLC, tủ sấy, tủ ủ,… Dụng cụ: ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, đĩa petri, đèn cồn,… Các loại hóa chất sử dụng CHCl3 Hexan Cồn 70o FeCl3 H2SO4 Vanilin Bột Mg kim loại HCl Acid tricloaroacetic Anhydrid acetic Metanol n-butanol Acid acetic NaCl TSA Pepton water Agar, … Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm 1:cảm ứng tạo mô sẹo Khử trùng mẫu lá Lá Kim ngân được khử trùng theo các bước sau: Khử trùng sơ bộ: Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bỏ bớt sự nhiễm bẩn bề mặt. Rửa kỹ từng mẫu lá trong nước rửa chén được pha loãng. Rửa lại bằng nước máy từ 4 -5 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy: Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. Tiến hành lắc khử trùng mẫu lá bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sung thêm vài giọt Tween 20 trong các khoảng 5 phút. Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm tạo mô sẹo. Cảm ứng tạo mô sẹo Mẫu cấy lá Kim ngân Hoa sau khi khử trùng được cắt bỏ rìa lá bị trắng hoặc nâu do do tác động của chất khử trùng và cắt phiến lá dài 1 – 2 cm sẽ được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật có nồng độ như sau: 0.1 mg/l 2,4-D, 1 mg/l BA 0.5 mg/l TDZ, 0.05 mg/l IBA Sau 2 tháng, ghi nhận sự phát sinh hình thái mô sẹo của mẫu cấy. Dùng mẫu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo Chuẩn bị mẫu Các mẫu: lá và cành tự nhiên, hoa khô, mô sẹo, được sấy khô ở nhiệt độ 50 – 60oC trong vòng từ 3 – 4 tiếng, mục đích là khử bớt nước trong vật liệu. Sau đó nghiền mẫu bằng máy nghiền, mục đích làm vật liệu trở nên nhuyễn, nhỏ để dễ dàng tiến hành quá trình chiết. Chiết lấy dịch bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm với cồn 70o: lấy bình erlen 250ml, cho mẫu khoảng 10g vào bình rồi rót cồn 70o cho đến khi xâp xấp bề mặt của lớp bột mẫu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình chiết thêm lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xốc đều lớp bột cây hoặc có thể gắn bình v