Đồ án Khảo sát sự ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên daphnia magna

cơ như trên một mặt gây chết hàng loạt các nhóm động vật bậc cao, mặt khác cũng góp phần làm giảm mức độ đa dạng sinh học, làm thay đổi cấu trúc thành phần cũng như tỉ lệ số lượng các nhóm thủy sinh vật. Sự ô nhiễm môi trường bên cạnh ảnh hưởng đến cấu trúc thành phần, mức độ đa dạng, mật độ và sinh khối các nhóm thủy sinh vật mà còn gây tác động tiêu cực tiềm tàng khác là biến đổi chất lượng của những cá thể trên cơ sở tích tụ các chất gây độc như một số kim loại nặng, các hóa chất bảo vệ thực vật trong các cơ quan nội tạng của một số loài cá, thân mềm, giáp xác. Các tia phóng xạ ngoài tác hại gây chết, chúng còn ảnh hưởng đến sự phát triển của sinh vật ở giai đoạn đầu như đẻ sớm, không phát triển hết các giai đoạn của thai,… 2.3. Daphnia magna [1],[10],[13],[30] 2.3.1. Đặc điểm hình thái, sinh lý Daphnia magna là loài giáp xác nước ngọt thuộc họ Cladocera. Nó phân bố ở khắp các nơi với rất nhiều loài. Có khoảng 150 loài được tìm thấy ở Bắc Mỹ, và ở Châu Âu Daphnia cũng tồn tại với số lượng tương tự. Bên cạnh đó, ở Châu Á và Châu Phi cũng có rất nhiều loài Daphnia, ví dụ như: Daphnia lumholtzi được tìm thấy rất nhiều ở Châu Phi. Trong các loại Daphnia thì Daphnia magna tuy không phân bố rộng rãi nhưng được biết đến nhiều nhất, do nó là nguồn thức ăn lý tưởng cho các loài ấu trùng cá, và được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu về độc học và xử lý nước thải hữu cơ. 2.3.1.1. Hình thái Hình 2.1 – Daphnia magna D.magna có cơ thể hình bầu dục, có vỏ giáp bọc ngoài, phân đốt cơ thể không rõ ở bề ngoài. Nó có hai râu gấp đôi gồm hai nhánh phát triển lớn, có kích thước dài gần bằng một nửa cơ thể. Con đực có kích thước nhỏ hơn con cái, râu lớn hơn, đuôi bụng dài hơn và hình dạng của chân trước như cái càng dùng để gắp thức ăn. D.magna cái trưởng thành có kích thước bề rộng khoảng 3 – 5mm, D.magna đực là 2mm. Cơ thể của D.magna có thể chia thành 3 phần: đầu, ngực và bụng, cả ba phần đều không phân đốt rõ rệt. Toàn cơ thể được bọc trong vỏ giáp trơn và trong suốt, gồm hai mảnh trái, phải dính nhau về phía lưng và về phía bụng. Phần đầu vỏ giáp kéo dài về phía trước thành chùy nhọn, phần sau của vỏ giáp đầu, phía lưng thường có các lỗ đầu, gồm lỗ chính và lỗ bên. Ở gốc râu, hai bên đầu có nếp gấp của vỏ giáp tạo thành gở bên đầu. Phần thân vỏ giáp có thể phân biệt: cạnh lưng, cạnh bụng, cạnh sau. Cạnh bụng vỏ giáp có viền gai hay tơ. Cạnh sau vỏ giáp liên tục với cạnh bụng, đuôi vỏ giáp thường kéo dài thành núm. Phần ngực nằm trong vỏ giáp, không phân đốt rõ, có 4 – 6 đôi chân ngực. Phần bụng kéo dài thành đuôi bụng, không có phần phụ, lỗ hậu môn đổ ra cạnh trên ở gốc đuôi bụng. Ở phần gốc đuôi bụng trước hậu môn, thường có núm lồi nhỏ, có hai tơ dài, ngay phía trên có các phần lồi đuôi bụng hình dải lớn. Ngay trước hậu môn còn có núm trước hậu môn. Cạnh trên đuôi bụng (thường dễ lầm là cạnh dưới khi đặt con vật theo tư thế thẳng đứng) thường có hang gai đuôi bụng. Mặt bên đuôi bụng có khi có hàng gai hay tơ bên mọc thành từng đám hay thành dãy song song với cạnh trên. Đầu ngọn đuôi bụng có vuốt ngọn. Phần đầu có râu I, đôi râu II, đôi hàm trên đôi hàm dưới I và II. Râu I thường nhỏ, hình que không phân đốt, mọc ở gần ngọn chùy, đầu ngọn có túm tơ cảm giác. Râu II lớn, gồm phần gốc và 2 nhánh ngọn phân đốt, nhánh lưng hay nhánh trên và nhánh bụng hay nhánh dưới. Hình 2.2 – Cấu tạo của Daphnia magna 1. Râu 8. Postabdominal claw 2. Mắt 9. Hậu môn 3. Miệng 10. Postabdomen 4. Râu nhỏ 11. Túi ấp trứng 5. Môi trên 12. Vỏ giáp 6. Shell gland 13. Tim 7. Thoracic appendage 14. Thực quản Hình 2.3 – Phần đầu và đuôi của D.magna 2.3.1.2. Đặc điểm sinh lý D.magna có thể sống ở dãy nhiệt độ 18 – 250C, nhưng nó phát triển nhất ở nhiệt độ tối thích là 21 ± 10C và pH = 7.2 – 8.5 với hàm lượng oxy trong nước 7 – 8 mg/l. Chúng chỉ có thể sống trong môi trường nước ngọt với hàm lượng muối không được phép vượt quá 4.0 ppt, và nồng độ muối trong khoảng 1.5 – 3.0 ppt là thích hợp nhất. D.magna rất nhạy cảm với môi trường nước nghèo dinh dưỡng hoặc bị nhiễm độc. Khi môi trường có sự thay đổi bất thường thì có sự xuất hiện của trứng đen trong túi ấp, những trứng này nở ra con đực hay con cái sẽ chuyển thành con đực, và các con đực này sẽ chết. Môi trường chứa halogen như clo hay flo rất độc đối với D.magna, thậm chí nó bị ảnh hưởng nhiều hơn rất nhiều so với loài cá. Chúng cũng rất nhạy cảm trong môi trường có chứa các ion kim loại như natri, kali, magie, canxi, đồng và chì, nếu hàm lượng các chất này trong nước quá cao có thể làm cho chúng tê liệt và chết. Do vậy chúng thường được nuôi trong môi trường nước đã được kiểm tra và đạt tiêu chuẩn an toàn. D.magna có thể ăn rất nhiều các loại thức ăn khác nhau nhưng nguồn thức ăn chính của nó là các loại tảo đơn bào tươi, vi khuẩn, nấm men,… Nguồn thức ăn của D.magna ảnh hưởng rất nhiều đến màu sắc của nó. Nếu thức ăn của nó là tảo nó sẽ có màu xanh trong suốt, nếu nó ăn vi khuẩn thì sẽ có màu hồng cam… Bên cạnh đó màu sắc của cơ thể nó cũng phụ thuộc rất nhiều vào môi trường. Trong môi trường có hàm lượng oxy thấp, D.magna có xu hướng tạo ra nhiều hemoglobulin để nâng cao sự hấp thụ oxy trong nước và làm cho cơ thể nó có màu đỏ, trong môi trường có hàm lượng oxy cao nó có xu hướng có màu vàng. D.magna chủ yếu sinh sản theo kiểu trinh sản (con mẹ chỉ đẻ ra con cái) hơn là sinh sản hữu tính. Điều này đảm bảo cho việc đồng nhất giới tính. Tuy nhiên, D.magna chỉ có thể sinh sản theo kiểu này khi trong môi trường đạt những điều kiện thuận lợi về nguồn thức ăn, nhiệt độ,… Những con D.magna con trưởng thành sau 7 – 8 ngày. Sau khoảng 2 tuần thì D.magna con có thể sinh sản, trung bình mỗi con đẻ khoảng 10 con con, sự phát triển của trứng có thể quan sát trực tiếp qua cơ thể mẹ. Con cái tiếp tục sinh sản thường trong khoảng 3 ngày và chậm nhất là sau 4 ngày, nó sinh sản khoảng 20 lần trong suốt cuộc đời của nó (thông thường con cái thường đẻ ít hơn 100 con trong suốt cuộc đời của nó), con cái có thể sinh sản trong 2 tháng. Khi lượng thức ăn hiếm hay có độc tố thì trong túi ấp sẽ xuất hiện các trứng đen. Những trứng này sẽ phát triển thành con con đực với kích thước nhỏ, và chia ra các mảnh giáp xác nhỏ có hình dạng khớp lưng màu nâu tối hoặc màu đen. Khi đó, con cái sẽ không còn hình thức sinh sản vô tính nữa mà sẽ chuyển sang hình thức sinh sản hữu tính, nghĩa là có sự giao phối giữa con đực và con cái, và sự đồng nhất giới tính sẽ mất đi. Nếu điều kiện quá khắc nghiệt, con cái sẽ không đẻ ra con con và sẽ đẻ ra các trứng đen này, những trứng này có thể tồn tại trong điều kiện khắc nghiệt và khả năng chống chịu với ảnh hưởng môi trường khá tốt nếu các ao nước nuôi chúng bị khô cạn và thậm chí chúng vẫn có thể tồn tại trong băng. Khi điều kiện sống được cải thiện, các trứng bắt đầu nở ra con con (tất cả đều là cái) và các con đực chết hoàn toàn. Hình 2.4 – Vòng sinh sản của D.magna 2.3.2. Ứng dụng Thức ăn cho ấu trùng cá và một vài loài thủy sinh D.magna được biết đến nhiều từ khi thú chơi cá cảnh bắt đầu phát triển ở các nước châu Âu, do D.magna là một loại thức ăn cho cá rất có giá trị dinh dưỡng. D.magna có hàm lượng protein chiếm 50% tổng chất khô của cơ thể, ở con trưởng thành lượng chất béo chiếm 20 – 27%, ở con non 4 – 6% do vậy nó cung cấp cho cá và các loài thủy sinh khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Hơn nữa, ở các nước ôn đới, điều kiện nuôi chúng khá dễ dàng và khả năng sinh sản, phát triển của nó tương đối nhanh. Hiện nay, tại một số nước ở châu Âu và Singapore, D.magna đang được kinh doanh rất nhiều để làm thức ăn cho cá cảnh, chúng được bán dưới dạng sống, dạng đông lạnh và cả loại đã sấy khô thành viên. Thử nghiệm độc tính Do đặc điểm sinh sản của nó là sinh sản vô tính, khi gặp điều kiện bất lợi thì sẽ xuất hiện trứng đen trong túi ấp và sẽ nở ra thành con đực, D.magna cũng có những thay đổi rõ rệt để phản ứng lại với độc tố của môi trường nên D.magna được sử dụng rất nhiều để đánh giá thử nghiệm độc tính của môi trường nước. Bên cạnh đó, nó có cấu tạo khá đơn giản, thời gian phát triển tương đối nhanh chỉ từ 7 – 8 ngày, sau khoảng 2 tuần thì nó có thể sinh sản với một số lượng lớn khoảng 10 – 30 con trong một lần sinh sản nên có thể đáp ứng được các yêu cầu về số lượng sinh vật để bố trí thí nghiệm. Các ứng dụng khác D.magna được sử dụng để lau sạch các loài tảo đơn bào trong các bể cá lớn, nó cũng có khả năng ăn vi khuẩn và nấm men nên làm cho nước của bể được trong hơn và sạch hơn. Nó cũng có khả năng lọc một số chất thải hữu cơ, chính vì vậy hiện nay nó cũng đang được nghiên cứu để sử dụng trong các ao hồ sinh học của các hệ thống xử lý nước thải của các nhà máy nhằm tăng khả năng xử lý nước thải và giảm bớt chi phí cho nhà máy. Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thiết bị và dụng cụ 3.1.1. Thiết bị Thiết bị do pH, nồi hấp, tử sấy, cân phân tích Máy khuấy từ, máy cất nước, máy sục khí, kính hiển vi, kính soi nổi Đèn ống philip TLD-80 nối với đồng hồ hẹn giờ… 3.1.2. Dụng cụ Cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức Erlen, beaker thủy tinh 2L, 4L, chai sạch 250ml, 500ml Đĩa thủy tinh đường kính 150mm Lưới lọc có kích thước lỗ lọc là 1300µm, 850µm, 375µm Lọ thủy tinh 100ml dùng để bảo quản dung dịch mẹ Micropipette và pipette Pasteur… 3.2. Vật liệu Daphnia magna được nuôi tại phòng Công nghệ biến đổi sinh học, Viện sinh học Nhiệt đới trong môi trường COMBO. Chất gây rối loạn nội tiết (Endocrine Disruptors) : 17α-Ethynylestradiol ;17β-Estradiol. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy Daphnia magna trên môi trường COMBO 3.3.1.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy là môi trường COMBO [xem phụ lục 2] Dung dịch mẹ được bảo quản ở nhiệt độ 40C tối đa là 3 tháng phải thay mới. Chú ý dung dịch số 5 (Fe), 6 (EDTA) và 10 (Vitamin) nên thay mới mỗi tháng. Dung dịch mẹ được chứa trong lọ nâu 100ml đã được rửa sạch và vô trùng trước khi sử dụng. Số lượng các chất được hướng dẫn chính xác trong bảng thành phần môi trường với nước cất thành 4L môi trường nuôi cấy. Chú ý trộn dung dịch số 5 (Fe) với dung dịch số 6 (EDTA) trước khi cho vào nước cất, vì đây là một phức của Fe Môi trường được sục khí trong 4 giờ để bão hòa O2 Bảo quản môi trường M4 ở nhiệt độ 200C không được hơn 1 tuần để tránh sự phát triển của vi sinh vật. Các thông số lý hóa của môi trường M4 pH: 8.2 ± 0.2 O2: 7 – 8 mg/l Độ dẫn điện: 610 µS/cm Độ kiềm: 0.9 mmol/l Tổng cứng: 2.5 mmol/l 3.3.1.2. Nuôi cấy 3.3.1.2.1. Điều kiện môi trường bên ngoài Nhiệt độ phòng thí nghiệm : 21 ± 10C Ánh sáng : Ánh sáng trắng mát dịu Độ chiếu sáng khoảng 500 ÷ 800 Lux Không được vượt quá 1000 lux để tránh sự phát triển của tảo Chu kỳ chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối 3.3.1.2.2. Quần thể sinh vật Loài Daphnia chủ yếu sinh sản theo kiểu trinh sản (con mẹ chỉ đẻ con cái) hơn là sinh sản hữu tính, điều này đảm bảo cho việc đồng nhất giới tính, thuận lợi cho việc thí nghiệm độc học. Sự xuất hiện của trứng đen trong túi ấp trứng (những trứng này nở ra con đực), là có sự thay đổi bất thường trong điều kiện sống. Và việc xuất hiện con đực sẽ hình thành kiểu sinh sản hữu tính, làm cho thí nghiệm độc học không còn chính xác. Do vậy, nếu có sự xuất hiện con đực nên loại bỏ beaker nuôi cấy này. Daphnia magna con trưởng thành sau 7 – 8 ngày. Sau khoảng 2 tuần thì Daphnia magna con có thể đẻ trứng, trứng nở được khoảng 10 – 30 con sau 2 – 3 ngày (thậm chí nở được 50 – 60 con), và con cái có thể sinh sản trong 2 tháng. 3.3.1.2.3. Dinh dưỡng Tảo đơn bào (Pseudokirchneriella subcapitata, Selenastrum capricornutum, Chlorella vulgaris). Thời gian bảo quản tảo tối đa là 1.5 – 2 tháng. Tảo được nuôi cấy trong môi trường EPA (EPA, 1978) trong beaker 2 lít, sau một tuần ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, trong 20 phút, thu sinh khối thêm vào 50ml môi trường M4, bảo quản trong lọ vô trùng ở 40C không hơn 4 tuần. Tảo này dùng cho Daphnia magna ăn theo định kỳ 2 lần một tuần với khoảng 2ml/4l môi trường nuôi cấy. Số lượng tế bào tảo được tính dựa trên thành phần Carbon. Đối với Daphnia magna, thành phần carbon khoảng 48%, số lượng tảo cho mỗi Daphnia magna ăn là 2.28 x 107 tế bào/ Daphnia magna/ ngày (tương đương 0.2 mgC/ Daphnia/ ngày). Sinh khối tảo thường lắng xuống đáy của beaker nuôi cấy, cần phải khuấy lên lớp tảo lắng này mỗi ngày bằng một pipette gắn với chóp nhựa, để tránh va chạm vào Daphnia magna làm ảnh hưởng đến chúng. Đặt beaker nuôi cấy lên một nền đen, Daphnia sẽ di chuyển lên trên nên chúng ta sẽ dễ dàng làm sạch đáy beaker. 3.3.1.2.4. Thay môi trường nuôi cấy Bắt đầu nuôi cấy với khoảng 150 con Daphnia con cùng lứa (ít hơn 24 giờ tuổi) trong 1.5 lít môi trường M4 Beaker được đậy bằng một dĩa thủy tinh, ghi ngày theo ngày tháng sinh của Daphnia con Ngày Daphnia sinh sản lần đầu được ghi lại. Mỗi khi Daphnia bắt đầu sinh sản (thông thường sau 1 tuần). Chúng tôi lọc 2 – 3 lần/tuần với lưới lọc có kích cỡ lỗ 850µm để tránh có nhiều lứa trong một beaker. Hơn nữa trong suốt thời gian này Daphnia lớn lên, nên kích thước cơ thể tăng lên, do đó cần thay lưới lọc có kích thước lỗ phù hợp (1200, 1400, 1600 µm). Trong thời gian thí nghiệm việc thay mới môi trường bắt đầu mỗi tuần. 3.3.1.2.5. Duy trì nuôi cấy Duy trì thường xuyên 2 beaker là đủ Daphnia được lọc 2 lần/tuần bằng lưới lọc 850µm và 3750µm. Daphnia trưởng thành thu được ở lưới lọc phía trên và Daphnia con thu được ở lưới lọc phía dưới. Lưới lọc được làm ẩm lưới lọc trước khi lọc Daphnia Môi trường M4 được thay mới hàng tuần để tránh nhiễm bẩn cho Daphnia. Beaker được rửa sạch và tráng cồn trước khi sử dụng và nên vô trùng beaker bằng nồi hấp vô trùng 1 lần/1 tuần. Những con Daphnia trên lưới lọc được rửa sạch bằng môi trường M4, sau đó cho chúng vào beaker đựng môi trường mới. Lưu ý: Daphnia phải được rửa một cách nhẹ nhàng để tránh tổn thương chúng. Quá trình lọc phải được thực hiện một cách cẩn thận, nhẹ nhàng, nhanh chóng. Phải dành riêng thiết bị dụng cụ cho việc nuôi cấy Daphnia Daphnia con được sử dụng để làm thí nghiệm . . . . . . . . . . . . * * * * * * * Hình 3.1 – Lọc Daphnia 3.3.1.2.6. Duy trì sinh vật trong thời gian thí nghiệm Số lượng beaker nuôi sinh vật có thể tăng. Thí nghiệm được thực hiện trên sinh vật ít hơn 24 giờ tuổi. Do vậy, phải lọc sinh vật trước khi thí nghiệm 24 giờ. Sinh vật thí nghiệm được đặt vào đĩa petri vô trùng chứa môi trường M4 trước khi chuyển vào bình làm thí nghiệm. Daphnia phải được thay mới sau 4 tuần nuôi cấy. 3.3.1.2.7. Điều kiện bất lợi Trong trường hợp có sự bất lợi của môi trường nuôi cấy đối với Daphnia magna như tỷ lệ tử vong cao, không có hoặc khả năng sinh sản của Daphnia magna kém cần chú ý những điểm sau: Chu kỳ chiếu sáng (xem xét tình trạng làm việc của đồng hồ hẹn giờ) Ánh sáng (đèn chiếu sáng bị cũ hay bị hư hỏng) Nồng độ của dung dịch mẹ (đo lại pH) Chất lượng tảo (tảo bị kém chất lượng khi có màu khác thường). Cần chuẩn bị tảo với số lượng vừa đủ và thường xuyên. Mật độ dày đặc của Daphnia magna (không được hơn 150 sinh vật trưởng thành/1 lít môi trường). Môi trường nuôi. Dụng cụ cần được rửa sạch và khử trùng trước khi dùng để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. 3.3.2. Kỹ thuật nuôi cấy tảo 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy tảo là môi trường EPA (EPA, 1978) THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG EPA Mã số dd mẹ Hóa chất Số lượng (mg) Thể tích (ml) Thể tích (ml) của dd mẹ/1L Nồng độ (mg/l) 1 NaNO3 12.75 500 H2O 1 25.5 2 MgCl2.6H2O CaCl2.2H2O H3BO3 MnCl2.4H2O ZnCl2 CoCl2.6H2O CuCl2.2H2O Na2MoO4.2H2O 5000 2210 92.76 207.81 Trong dd. a Trong dd. b Trong dd. c Trong dd. d 496 H2O + 1ml dd. a 1ml dd. b 1ml dd. c 1ml dd. d 1 10 4.42 0.185 0.415 0.003 0.001 0.012 0.007 3 FeCl3.6H2O Na2EDTA.2H2O 80 150 500 H2O 1 0.16 0.3 4 MgSO4.7H2O 7350 500 H2O 1 14.7 5 K2HPO4 522 500 H2O 1 1.04 6 NaHCO3 7500 500 H2O 1 15 DUNG DỊCH MẸ Mã số dd Hóa chất Số lượng (mg) Thể tích (ml) a ZnCl2 164 100 b CoCl2.6H2O 71.4 100 c’ CuCl2.6H2O 60 1000 c Dùng dd c’ 1ml dd. c’ trong 10ml d Na2MoO4.2H2O 36.6 100 3.3.2.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 3.3.2.2.1. Nuôi tảo với mục đích làm thức ăn cho sinh vật thử nghiệm a) Cách pha dung dịch mẹ và bảo quản Dung dịch stock được pha và bảo quản trong lọ thủy tinh 100ml. Các lọ này phải được rửa sạch và khử trùng trước mỗi lần sử dụng. Dán nhãn tên dung dịch và phương thức pha vào từng lọ. Bảo quản dung dịch mẹ trong tủ lạnh ở 40C. Các dung dịch này kể cả dung dịch phụ phải được bỏ đi nếu quá 6 tháng kể từ lúc pha. b) Môi trường EPA Chuẩn bị 1 beaker 3L chứa 2500ml nước cất. Lần lượt cho dd mẹ từ dd có mã số từ 1 đến 6 vào beaker trên và cho thêm nước cất để vừa đủ 3000ml. Cho 0.2ml tảo giống vào trong bình môi trường đã được pha sẵn. Ghi ngày bắt đầu nuôi. Khuấy trộn bình bằng con cá từ với tốc độ khuấy 100rpm trên máy khuấy từ. 3.3.2.2.2. Nuôi cấy tảo mới mục đích giữ giống Để giữ giống tảo, tảo phải được nuôi trên môi trường thạch a) Chuẩn bị môi trường thạch EPA Chuẩn bị lọ thủy tinh đã khử trùng thể tích 1000ml chứa 800ml nước cất Lần lượt cho dung dịch mẹ có mã số từ 1 đến 6 vào beaker 1L có thể vô trùng được. Chuẩn độ pH: 7.5 – 8 Thêm 1% thạch tinh khiết. Hấp vô trùng ở 1210C trong 30 phút. Rót môi trường còn nóng (khoảng 450C) vào đĩa petri đã được vô trùng với độ dày khoảng 0.2 – 0.3 cm. Để các đĩa petri trên mặt phẳng bằng cho đến khi nguội hoàn toàn. Gói kín các đĩa petri bằng giấy và bảo quản. b) Nuôi cấy tảo Dùng que cấy khử trùng lấy tảo và cấy vào trong đĩa petri có môi trường thạch nuôi tảo đã được chuẩn bị sẵn. Cách cấy zic zac được mô tả như trong hình vẽ. Dán kín petri bằng parafin. Ghi ngày bắt đầu cấy. Lưu trữ tảo trong tủ lạnh ở 40C và dung để nhân giống sau này. 3.3.2.3. Nuôi cấy 3.3.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy: 22 ± 20C Ánh sáng: ánh sáng trắng mát dịu. Cường độ chiếu sáng tối ưu là 4000 lux. Sục khí môi trường nuôi cấy liên tục. 3.3.2.3.2. Thay mới môi trường nuôi cấy Rót vào bình tam giác đã vô trùng 150ml môi trường nuôi cấy. Chuyển 1 – 2µl tế bào tảo trên mặt đĩa petri bằng một ống tiêm vào một ống tiêm vào bình tam giác trên và lắc đều. Đặt hỗn hợp dung dịch tảo vào tủ ủ. Khuấy hỗn hợp dung dịch tảo mỗi trước mỗi ngày 2 lần. Sau 7 ngày, tảo sẽ phát triển ở pha log. 3.3.2.3.3. Duy trì nuôi cấy Mật độ tảo được chọn để bắt đầu quá trình nuôi cấy trong quy trình này là 10000 tế bào/ml. Mỗi đợt nuôi cấy khoảng 7 ngày. Trong đó 3 ngày đầu là pha phương trình tuyến tính và pha log kéo dài tối đa là 3 ngày sau. Mật độ tảo có thể tăng nhanh và như vậy thời gian đạt đến pha log sẽ ngắn hơn. Để nuôi cấy liên tiếp chúng ta cần xác định thể tích giống như sau: Xác định mật độ tế bào tảo trong quá trình nuôi cấy (x – 1) Thể tích giống vix được tính như sau: vix = Dix : mật độ tảo giống đem nuôi cấy x (ở đây là 10000 tb/ml) V : thể tích môi trường nuôi cấy (ở đây là 150ml) Dx-1 : mật độ tế bào nuôi cấy (x – 1) Sau khi cho giống vào môi trường mới rồi nuôi chúng trong điều kiện nuôi cấy tảo. Quá trình nuôi được kết thúc sau 7 ngày. Bình tam giác được rửa bằng xà phòng, tráng lại bằng nước máy, sau đó bằng nước cất, rồi đem chúng đi vô trùng. 3.3.2.3.4. Duy trì quá trình nuôi cấy để giữ giống Quá trình nuôi cấy để giữ giống được thực hiện trên môi trường thạch. Chúng tôi thường xuyên chuyển tảo lên môi trường thạch để chọn ra những đĩa giống tảo thuần và sạch. Nếu có đĩa giống nào bị nhiễm khuẩn chúng tôi loại bỏ ngay. Tảo được nuôi trên đĩa petri. Tảo từ đĩa petri được cấy nhanh vào mỗi đĩa petri khoảng 10µl tảo ở pha log. Cấy tảo theo đường zic zac. Bảo quản đĩa ở 40C. 3.3.2.3.5. Những sự cố trong quá trình nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ tằn giảm ngoài ngưỡng sẽ làm ảnh hưởng đến sự phát triển của tảo. Ánh sáng: nếu đèn neon quá cũ cũng có thể làm thay đổi cường độ ánh sáng. Nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy (kiểm tra bằng cách đo pH) Chất lượng tảo giống được kiểm tra bằng cách soi kính hiển vi, tránh sự xuất hiện của các loại vi khuẩn. Các dụng cụ nuôi cấy cần được khử trùng và rửa sạch sẽ ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. 3.3.3. Bố trí thí nghiệm Pha môi trường COMBO Pha loãng nồng độ của 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol trong môi trường Combo với các nồng độ sau : Bảng 3.1: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17α-Ethynylestradiol Ký hiệu α1 α2 α3 α4 α5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bảng 3.2: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17β-Estradiol Ký hiệu β1 β2 β3 β4 β5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bố trí mỗi nồng độ lặp lại 3 lần, với thể tích là 300ml Mẫu đối chứng cũng lặp lại 3 lần chỉ với môi trường COMBO Mỗi nồng độ bố trí 20 con Daphnia magna 1 ngày tuổi Thí nghiệm được bố trí ở nhiệt độ phòng là 220C. Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Những Daphnia magna con 24 giờ tuổi được nuôi đồng nhất từ D. magna mẹ, được để nghỉ ít nhất 1 giờ trước khi bắt đầu thí nghiệm. Những D.magna này được chia vào cốc thủy tinh chứa 300ml môi trường COMBO với các nồng độ 17α-Ethynylestradiol và 17β-Estradiol với các nồng độ như sau: Bảng 4.1: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17α-Ethynylestradiol Ký hiệu α1 α2 α3 α4 α5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l Bảng 4.2: Nồng độ bố trí thí nghiệm của 17β-Estradiol Ký hiệu β1 β2 β3 β4 β5 Nồng độ 1µg/l 10µg/l 50µg/l 100µg/l 200µg/l D. magna con được cho ăn hàng ngày, cho ăn gấp đôi vào những ngày thứ sáu. Không thay môi trường trong suốt quá trình làm thí nghiệm, chỉ thêm môi trường khi thấy môi trường vơi đi, duy trì chính xác điều kiện nuôi D. magna. Theo sự hướng dẫn của ISO và OECD cho thí nghiệm sự sinh sản của D. magna, yêu cầu điểm dừng chính là tổng số D. magna con được tạo ra trên D. magna mẹ (24h tuổi bắt đầu thí nghiệm) đến sau 21 ngày tiếp xúc với chất thử nghiệm (ISO 2000, OECD 1998). Ghi lại những điểm tiêu biểu về dòng đời (chu kỳ sống) của sinh vật như sự sống sót, tuổi trưởng thành (lần đầu tiên có trứng), tuổi bắt đầu sinh sản và những bất bình thường về hành vi trong quá trình phát triển (theo hướng dẫn của ISO, OECD). Vì khó để xác định mối liên hệ đầy đủ giữa nồng độ và sự đáp ứng cho tỷ lệ sinh sản những D. magna con được tạo ra từ một D. magna mẹ mà sống đến lúc kết thúc thí nghiệm. Vì có những nồng độ gây chết cao cho D. magna trưởng thành trong bố trí thí nghiệm, chúng tôi quyết định gom những D. magna con của tất cả những con D. magna mẹ mà đã đạt đến trưởng thành (tạo ra được ít nhất 1 D. magna con). Dưới đây là những kết quả ghi nhận được trong bố trí thí nghiệm. 4.1. Ảnh hưởng của chất gây rối loạn nội tiết lên Daphnia magna 4.1.1. Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.3: Tỷ lệ % D. magna sống sót sau 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 α5 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 % D. magna sống sót 63,3 58,3 38,3 16,6 18,3 0 90 83,3 80 10 6,6 10 Vì sau 24 h bố trí thí nghiệm ở nồng độ thứ 5 (200µg/l) của 17α-Ethynylestradiol gây chết toàn bộ sinh vật thí nghiệm nên trong các phần sau chúng tôi không đề cập đến nồng độ này. Sau 21 ngày bố trí chúng tôi thu được kết quả ở bảng 4.3, nhận thấy tỷ lệ D. magna mẹ sống sót trong môi trường COMBO là cao nhất 63,3% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol và 90% đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol. Như vậy, 2 chất dùng làm thí nghiệm trên có ảnh hưởng đến sự tồn tại của D. magna. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17α-Ethynylestradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) và thứ 4 (100 µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 16,6% và 18,3%. Ở nồng độ thứ 1 (1µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 58,3%. Như vậy chứng tỏ ở nồng độ 17α-Ethynylestradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. Đối với đợt bố trí thí nghiệm 17β-Estradiol tôi nhận thấy ở nồng độ thứ 3 (50µg/l), thứ 4 (100 µg/l) và thứ 5 (200µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót thấp nhất là 10%, 6,6% và 10%. Ở nồng độ 1 (1µg/l) và 2 (10µg/l) có tỷ lệ D. magna sống sót cao nhất là 83,3% và 80%. Như vậy, chứng tỏ ở nồng độ 17β-Estradiol càng thấp lượng D. magna tồn tại tương đương với mẫu đối chứng. 4.1.2. Số lượng D. magna được sinh ra trên 1 D. magna mẹ sau 21 ngày bố trí thí nghiệm Bảng 4.4: Số lượng D. magna con được sinh ra trên 1 D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí 17α-Ethynylestradiol 17β-Estradiol Nồng độ COMBO α1 α2 α3 α4 COMBO β1 β2 β3 β4 β5 Số lượng D.magna con 25,4 31 49,6 17,6 54,4 32,7 28,3 27,9 64,7 60,8 31,3 Kết quả thử nghiệm ở bảng 4.4 cho thấy: Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí nghiệm với 17α-Ethynylestradiol có sự khác biệt rất lớn từ 54,4 – 17,6 D. magna con trên D. magna mẹ so với môi trường COMBO là 25,4 D. magna con trên D. magna mẹ. Với nồng độ thứ 1 (1µg/l), thứ 2 (10µg/l), thứ 4 (100µg/l) có sự kích thích sinh sản, số lượng D. magna con cao hơn mẫu đối chứng và ở nồng độ thứ 3 (50µg/l) có sự ức chế sinh sản, số lượng D. magna con thấp hơn mẫu đối chứng. Số lượng trung bình của D. magna con trên D. magna mẹ trong 21 ngày bố trí thí ngh