Đồ án Kĩ thuật nuôi cấy và bảo quản nấm men công nghiệp

cả vi sinh vật đó. Quá trình tăng sinh phải qua giai đoạn ủ ở nhiệt độ thích hợp để tế bào vi sinh vật có thể phát triển đến số lượng cần thiết,sau đo mới tiến hành pha loãng và cấy mẫu lên môi trường thạch để tạo các khuẩn lạc phát triển riêng lẻ. Dung dich đem chọn pha loãng có thể là nước cất,nước muối sinh lí hay một loại dung dịch đệm nào đó sao cho khi pha loãng tế bào vi sinh vật vẫn có thể thực hiện các qúa trình trao đổi chất bình thường. Mẫu nên được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau (thường 1:10,1:100…) nằm tránh hiện tượng không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít lên nhau trên măt thạch và như thế sẽ không phân lập được. Hình 3.1. Sơ đồ pha loãng dung dịch huyền phù nấm men và cấy lên môi trường thạch ở hộp pectri III.4.3)KĨ THUẬT CẤY MẪU VÀ Ủ MẪU Môi trường phân lập thường không giống nhau đối với việt phân lập các vi sinh vật khác nhau.hơn nữa các vi sinh vật khác nhau nhưng có quan hệ gần nhau thì có thể phat triển thành khuẩn lạc có đặc diểm tương tự nhau. Chính vì vậy,việc chọn môi trường phân lập đóng vai trò rất quyết định hiệu quả phân lập. Thông thường các môi trường chuyên biệt cho sự của một vi sinh vật nào đó được sử dụng để phân lập vi sinh vật này. Tuy nhiên việc nuôi cấy vi sinh vật đòi hỏi các kĩ thuật vô trùng. Bằng các kĩ thuật vô trùng, người thao tác thí nghiệm có thể ngăn ngừa giống vi sinh vật và các dung dịch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật không mong muốn. Thao tác các kĩ thuật vô trùng phải chính xác cũng giúp người thí nghiệm tránh các vi sinh vật gây bệnh. 1 -Vệ sinh sạch các khu vực thí nghiệm bằng các hoá chất sát trùng để giảm tối đa lượng vi sinh vật gây nhiễm 2-Các dụng cụ cấy chuyền phải được tiệt trùng 3- Các thao tác phải được thực hiện nhanh chính xác có hiệu quả để rút ngắn thời gian, qua đó giống vi sinh vật có thể bị nhiễm Các bước cấy chuyền nấm men từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác phải được thực hiện như sau 1-Đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn 2-Mở nút bông hay nắp và hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trên ngọn lửa đèn cồn 3-Thu một ít vi sinh vật bằng que cấy và chuyển qua môi trường tinh khiết 4-Hơ lại miệng ống nghiệm hay lọ trên ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông hay nắp lại 5-Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Các kĩ thuật vô trùng đối với hộp pectri cũng được thực hiện tương tự Như vậy người làm thí nghiệm phải 1-Luôn luôn tiệt trùng que cấy bằng cách đốt trước khi đưa nó vào bất kì một ống nghiệm nào chứa giống vi sinh vật 2-Luôn hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trước khi đưa que cấy tiệt trùng vào ống nghiệm để lấy hoặc cấy giống vi sinh vật 3-Luôn luôn đậy kĩ các ống nghiệm hay lọ… đựng giống vi sinh vật với các nắp tương ứng khi không thực hiện cấy chuyền.tuyệt đối tránh nhầm lẫn các ống nghiệm này nới nắp ống nghiệm kia. Không đặt các nắp ống nghiệm hay nắp dĩa pectri lên mặt bàn hay tiếp xúc với bất cứ vật gì khac ngoài ống ngiệm hay dĩa pectri đựng gống vi sinh vật tương ứng để tránh lây nhiễm.khi chuyển các khuẩn lạc,vào đĩa Perti,sử dụng nắp đĩa như là vật che chắn,bảo vệ giống khỏi bị nhiễm bằng cách nâng nghiên nắp đĩa lên một góc đủ để đưa que cấy vào. 4-Thao tác chính xác khi mở nút hay nắp ống nghiệm/lọ. 1-Đối với vi sinh vật hiếu khí Cấy mẫu Tuỳ theo yêu cầu từng loại môi trường mà cách gieo cấy khác nhau. Sau đây là những cách hay dùng: Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác Gieo cấy trên thạch nghiêng Cấy đâm sâu trên thạch đứng Cấy trên thạch hộp. FCách 1:Trộn vật gieo cấy lỏng vào thạch trước khi đổ ra hộp. Trình tự tiến hành như sau: Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch Đun chảy ống thạch, để nguội 50-550C Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy cho vào ống thạch đậy nút bông lại. Khẽ lắc ống thạchhoặc lăn nó giữa hai bàn tay để trộn đều vật gieo cấy với thạch, thạch dàn đều ra trên đáy hộp. Để yên cho thạch hoàn toàn đặc lại, lật ngược hộp và cho vào tủ ấm để nuôi. FCách 2:Trộn vật gieo cấy vào hộp thạch, tiến hành như trình tự sau: Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch Đun chảy ống thạch để nguội 50-550C Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy lỏng ,hé mở hộp, nghiêng qua nghiêng lại hoặc xoay nhẹ hộp để chúng dàn đèu trên đáy hộp. Hé mở nắp hộp, nhanh tay đổ thạch vào, đậy nắp và xoay nhẹ vài vòng trên bàn cho thạch và vật gieo cấy trộn đều đồng thời dàn thành một lớp trên đáy hộp. Để thạch đặc lại, lật ngược hộp, cho vào tủ ấm. FCách 3: Dàn đều vật gieo cấy trên bề mặt thạch. Tiến hành trình tự như sau: Dùng hộp thạch vô khuẩn Dùng pipet lấy một ít vật gieo cấy lỏng Hé mở nắp hộp và cho vật gieo cấy lên mặt thạch Dùng que trang( bằng thuỷ tinh) dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch (que trang phải chuẩn bị trước, sạch, khô, bọc giấy, vô khuẩn) Đậy nắp hộp, để yên một lúc cho mặt thạch ráo nước, quay ngược hộp, cho vào tủ ấm. Thể tích các mẫu (kể cả pha loãng và không pha loãng) được cấy lên thạch đĩa thường là 0.1ml. Tránh cấy mẫu với thể tích lớn,vì như thế thạch sẽ không hấp thụ hết mẫu và chất lỏng còn lại trên mặt thạch sẽ làm cho các khuẩn lạc phát triển dính liền như sau khi ủ. -Lấy que gạt vô trùng (nhúng vào cồn 90o,rồi đốt cháy với ngọn lửa đèn cồn,để nguội trong vài dây,phân bố đều mẫu lên mặt thạch đậy nắp dĩa lại,để thạch thấm hút hết mẫu trong vòng vài phút. -Úp ngược đĩa thạch rồi đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.tuỳ theo từng loại vi sinh vật mà thời gian ủ khác nhau. 2) Đối với vi sinh vật kị khí Chưng cách thuỷ môi trường trong ống nghiệm để đuổi hết oxi trong môi trường Để môi trường nguội đến 45-500C. Cấy 0.1ml dung dịch các mẫu (pha loãng và không pha loãng) vào môi trường đậy kín lại và lắc ống nghiệm quanh trục của nó để phân bố đều mẫu trong môi trường -Rót thật nhanh môi trường trong ống nghiệm này ra đĩa pectri rồi đậy nhanh nắp đĩa lại -Dùng paraphin dán kín kẻ hở giữa đáy đĩa và nắp đĩa rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp . Thời gian ủ phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật cần phân lập. Thông thường các vi sinh vật khác nhau có khuẩn lạc mang những đặc điểm khác nhau trên môi trường phân lập. Sử dụng que cấy khối môi trường có khuẩn lạc đặc trưng phát triển riêng lẻ rồi cấy vào môi trường dịch thể .để ủ môi trường lỏng nhiệt độ và thời gian thích hợp để kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật. Ủ mẫu: Trong trường hợp nuôi tĩnh được thực hiện trong tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ. Với từng loài ta cần giữ nhiệt độ tối thích cho nó phát triển hoặc những khoảng nhiệt độ cần nghiên cứu. Máy lắc có những tốc độ khác nhau được đặt trong các phòng có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ. Nếu nuôi giống nhiều thể tích lớn phải cung cấp đủ khí oxi, sục khí và dùng các loại cánh khuấy thích hợp Các giống hiếu khí thường nuôi trên máy lắc trong bình tam giác hoặc bình cầu có nút bông. Sau khi cấy xong, ta nuôi ở 25-280C trong vòng 4-5 ngày Trên môi trường lỏng vi sinh vật phát triển khắp môi trường, có thể tạo thành váng, làm đục môi trường, có trường hợp lắng xuống đáy các dạng kết tủa hình bông, sợi lơ lửng lắc khó tan hoặc dễ tan…, sinh ra mùi hoặc màu đặc trưng. Trên môi trường đặc mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Khi quan sát ta nên chú ý các khuẩn lạc phát triển đứng riêng rẽ, xem hình dạng kích thước, rìa mép, nhìn bề mặt xem bóng, mịn ướt, khô, gợn sóng, nhăn heo, nhìn xem toàn bộ đục mờ hay trong suốt, xem màu sắt và ngửi mùi… III.4.4)Phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trưng Sau khi nuôi trong một thời gian ngắn,vi sinh vật đã mọc giống tốt, chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ, mọc tốt đều và đẹp hoặc những điểm giống mọc tốt trên đường ziczac chuyển vào môi trường lỏng ( dịch malt, dịch quả) đã vô khuẩn trong ống nghiệm hoặc trong bình tam giác. Nuôi 2-3 ngày ở 280C để giống phát triển. Từ đây ta tiến hành phân lập lại một lần nữa (có thể qua quá trình pha loãng) để chọn các khuẩn sạch từ các khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt trên bề mặt môi trường đặt trong đĩa pectri. Chú ý: Sau 2 ngày , vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn Phải chọn khuẩn lạc thật riêng biệt. Phương pháp phân lập trên môi trường đặc là phương pháp thông dụng, dễ làm và kết quả tương đối đảm bảo nhưng có thể có những nhược điểm sau: Khuẩn lạc có thể không phát sinh từ một tế bào mà từ nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng biệt, nhưng qua một thời gian ngắn chúng lài dính liền với nhau. Để khắc phục những nhược điểm đó và đảm bảo canh trường hoàn toàn thuần khiết ta có thể tiếp tục phân lập như trên vài lần, đồng thời làm tiêu bản quan sát để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách. I:Phương pháp cấy ria Phương pháp cấy ria góc Tạo các góc phần tư bằng cách vẽ hai đường vuông góc bên ngoài đáy đĩa thạch chia dĩa thạch làm 4 phẩn bằng nhau Đốt nóng que cấy vòng ,để nguội trong vòng vài giây rồi đưa que cấy vào trong ống nghiệm chứa vi sinh vật và lấy một ít vi sinh vật này Chạm nhẹ que cấy lên bề mặt thạch rồi trược nhẹ que cấy theo đường ziczac liên tục trên ¼ dĩa thạch đã được chia.sử dụng nắp đĩa để bảo vệ bề mặt thạch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật rơi từ không khí vào.tránh thọc sâu que cấy vào trong thạch Đốt nóng que cấy để nguội chạm đầu que cấy vào thùng thạch thuộc góc phần tư thứ nhất (đã được cấy ria) ,trượt que cấy từ vùng này qua vùng thạch thuộc góc phần tư thứ hai,rồi tạo đường ziczac liên tục trên góc phần tư này. Luôn luôn đốt nóng que cấy sau mỗi lần tạo vạch trên mỗi góc phần tư của thạch,làm như vậy sẽ tiêu diệt bất cứ tế bào bám vào đầu que cấy và tránh cho lần cấy ria tiếp theo bị nhiễm . Lặp lại các ước cấy ria như thế trên vùng thạch thuộc góc phần trên thuộc góc phần tư thứ ba và thứ tư. Đốt nóng đầu que cấy lần nữa sau khi đã ria xong trên một đĩa thạch Phương pháp cấy ria liên tục Lấy một ít giống vi sinh vật lên que cấy và trược đều đầu que cấy lên một nữa bề mặt thạch theo một đường ziczac liên tục Không đốt nóng que cấy và không đưa que cấy ra khỏi đĩa,không quay bề mặt đầu que cấy, quay đĩa thạch 900và tiếp tục tạo đường ziczac liên tục như đã làm như trên vùng thạch trước đó Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng trong đó người tiến hành cấy ria chỉ sử dụng que cấy đã tiệt trùng không có vi sinh vật sống bám vào.chỉ cần sử dụng một trong hai phương pháp cấy ria trên. Đây là những đĩa chỉ thị cho kĩ thuật vô trùng. Nếu các kĩ thuật vô trùng được thực hiện chính xác,sẽ không có bất cứ vi sinh vật nào phát triển trên những đĩa này. III.4.5) Kiểm tra tính thuần khiết của nấm men: Kĩ thuật vô trùng trong sản xuất là phương pháp hết sức quan trọng để khắc phục tình trạng tạp nhiễm, thông thường người ta kiểm tra nhằm phát hiện những vi sinh vật tạp niễm và phát hiện sự có mặt các thực thể của giống vi sinh vật dùng cho sản xuất. Để phát hiện vi sinh vật tạp nhiễm, người ta thường dùng 2 phương pháp: Phương pháp soi kính hiển vi Phương pháp soi kính hiển vi tiện lợi và nhanh nhưng không phải bao giờ cũng cho kết quả mong muốn. Khi bị nhiễm tạp trùng có kích thước hình dáng tế bào không khác xa giống nuôi cấy dưới các trường. nhìn kíng hiển vi ta khó phát hiện được. Vì vậy cần có những phương pháp đặc biệt để xác định những tế bào sống và tế bào chết của tạp khuẩn. Phương pháp nuôi cấy trên một vài môi trường. Người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy một vài giọt mẫu của môi trường nhân giống hoặc lên men trên các môi trường dinh dưỡng. Quan sát bằng mắt thường hoặc dùn kính hiển vi các tế bào sống, cũng như các tế bào chết kết hợp với nhuộm gram. Phương pháp này cho kết quả tốt, song hơi chậm vì phải sau ít ngày mới biết kết quả được. Những môi trường dinh dưỡng thường dùng trong phòng thí nghiệm để kiểm tra vi sinh vật thường là môi trường nước thịt-pepton gọi là “canh thang”. Có glucoza , môi trường thạch-thịt-pepton. Môi trường nước thịt –pepton gồm 1% pepton, 0,5% NaCl trong nước thịt bò. Khi cho môi trường này vào các ống nghiệm có thêm 1% glucoza , pH môi trường là+7-7,2. Môi trường thạch-thịt-pepton được chế từ môi trường nước thịt pepton thêm 2% thạch. Phương pháp phát hiện tạp khuẩn trên hộp pectri. Trong kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm, phương pháp đơn giản nhất là dùng hộp thạch có phân vùng để cấy các mẫy kiểm tra. Dùng bút viết thuỷ tinh chia hộp pectri ra làm nhiều vùng, ở mỗi vùng là một khâu sản xuất trong dây chuyền bằng 1 đường cấy mẫu kiểm tra lên mặt thạch. Vùng 1,2,3 dùng để kỉêm tra giống cấp I,II,III.. Sau khi nuối ở nhiệt độ và thời gian nhất định, giống phải phát triển tốt, yêu cầu ở đâylà dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, nghĩa là giống thuần khiết. Vùng 4,5,6,7 dùng kiểm tra các mẫu môi trường lên men sau khi đã thanh trùng và một số thành phần của môi trường vì yêu cầu kĩ thuật phải thanh trùng riêng. Yêu cầu ở trường hợp này là hoàn toàn không có vi sinh vật phát triển, tức là các mẫu kiểm tra này phải hoàn toàn vô trùng. Vùng 8,9,10 dùng kiểm tra các mẫu dịch lên men sau khi đã lên men một thờigian(vd:3h-12h). Yêu cầu giống phải phát triển dày dần từ mẫu 3h đến mẫu 12h, và dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, hoàn toàn là dạng của giống sản xuất chứ không phải là một giống lạ nào khác. Một số vùng trên hộp pectri dành kiểm tra một số mẫu nữa theo yêu cầu của thực tế sản xuất. Như vậy nếu kết quả kiểm tra vô trùng đạt đươc như đã trình bày ở trên thì vấn đề tạp nhiễm không xảy ra, ngược lại nếu đợt sản xuất bị nhiễm những vi sinh vật lạ thì ta có thể chủ động biết được là nhiễm ở khâu nào, từ đó có những phương pháp khắc phục. 3 4 5 10 1 2 6 7 8 9 1 1,2,3: giống phát triển tốt,thuần khiết. 4,5,6,7: vô trùng, không có vi sinh vật phát triển. 8,9,10: Giống phát triển dày dần, thuần khiết. III.4.6)Nhân giống nấm men trong công nghiệp: Nếu đi từ một chủng nấm men mà những điều kịên tối ưu để nuôi cấy và sản xuất hoạt chất đã được xác định bằng thực nghiệm và đồng thời đã biết cách bảo vệ những đặc tính của nó qua thời gian thì tốt hơn hết nên dự trữ chủng đó ở một lượng lớn.. Từ một ống cấy lại trên môi trường đặc và nuôi trong 12-36h. Người ta pha chế một thể tích thích hợp dung treo nấm men trong nước vô khuẩn, dung treo đó dùng để gieo vào bình nón chứa môi trường có công thức và số lượng nhất định, đến giai đoạn này người ta thường sử dụng một thể tích của môi trường nhân giống bằng 5-10% thể tích môi trường cần gieo cấy. Sau một thời gian phát triển tối ưu trên máy lắc, các bình nón sẽ được dùng để gieo cấy vào một nồi lên men nhỏ, nó dùng để nhân giống cho một hay nhiều nồi lên men có dung tích từ 50-1000lít và gọi là nồi nhân giống cấp 2 (cũng gọi là nồi ủ). Sau cùng, nồi nhân giống cấp 2 đó có thể để gieo cấy vào những nồi lên men công nghiệp có dung tích từ 50-100 m3. Số lượng và thể tích của nổi nhân giống cấp 2 này có thể tăng hay giảm tuỳ theo đặc điểm của vi sinh vật tuỳ theo kết quả cần đạt được hoặc tuỳ theo thể tích mà ta có. Ngoài ta trong quá trình các thao tác liên tiếp đó còn có rất lớn một số các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả, ta cần phải xác định tầm quan trọng của những yếu tố đó bằng những thực nghiệm có hệ thống. trình bày cách nghiên cứu, quan sát hình thái nấm men IV)NGHIÊN CỨU TẾ BÀO NẤM MEN DƯỚI KÍNH HIỂN VI IV.1) Hình thái sinh sản Nghiên cứu hình thái, kích thước tế bào nấm men…người ta hay dùng tiêu bản giọt ép hoặc giọt treo. Cách là như sau: Tiêu bản giọt ép: Ta nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính khô, dùng que cấy lấy một ít tế bào nấm men ở khuẩn lạc hoặc từ ống thạch nghiêng cho vào giọt nước, rồi di nhiều lần cho tế bào men rải đều trong giọt nước, đậy một lam kính lên giọt nước. Chú ý khi đậy lam kính sao cho phần ép giữa lam kính và vật kính không có một bong bóng khí nào, chỉ là nước với tế bào nấm men. Đem soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600 lần ( vật kính 40x và thị kính 50x). Tiêu bản giọt treo Ngoài hình thái tế bào còn có thể quan sát sự nảy chồi của nấm men. Lấy một giọt dịch có chứa nấm men bằng vòng que cấy vô khuẩn rồi chấm lên lam kính đã vô khuẩn, quay ngược lam kính xuống phía dưới rồi úp lam kính lên một phiến kính chuyên dùng đã vô khuẩn có một vết lõm hình tròn ở giữa. Giọt giống huyền phù chấm trên lam kính phải đúng vào giữa vết lõm (hình 10.3). Mép của lam kính được bôi bằng parafin nóng chảy hoặc vazơlin để không khí không ra vào được vết lõm. Như vậy, ta có thể quan sát sự sinh sản của tế bào nấm men hàng ngày. Mỗi tiêu bản giọt treo ta có thể theo dõi, quan sát hình thái và sinh sản nấm men hàng ngày. Thời gian lưu giữ có thể 8-10 ngày. Nhuộm tế bào và đánh giá chất lượng nấm men Trong nghiên cứu, cũng như trong sản xuất không chỉ theo dõi quan sát hình thái tế bào mà còn phải thường xuyên đánh giá tình trạng sinh lí của tế bào nhờ các tiêu bản nhuộm tế bào. Giống nấm men được coi là trẻ khoẻ có hình thái tế bào đặc trưng, số tế bào trẻ và nảy chồi nhiều, số tế bào chết ít (<=5%). Tốc độ sinh sản nhanh, số tế bào chứa chất dinh dưỡng dự trữ (hạt glycogen) nhiều. IV.2) Đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy để xác định tốc độ sinh sản và sinh trưởng của nấm men Đếm số lượng tế bào thường áp dụng phương phápbuồng đếm Goriaev-Thom. Buồng đếm (hình 10.4) là phiến kính dầy được chia thành phần đều nhau bằng các vạch thẳng.. Phần giữa của phiến kính lõm xuống mỗi cạnh thấp 1/10 mm, trên đó có vạch một mạng lưới. Diện tích của ô vuông lớn của lưới là 1/25 mm2, diện tích của ô vuông nhỏ là 1/400mm2. Cho dịch huyền phù (một giọt) lên lưới và phủ bằng một lam kính. Miết vài lần sao cho lam kính với hệ trạng lưới phiến kính không còn bọt kh, không còn khoảng trông không chứa dịch. Trừ các ô vuông. Như vậy, khoảng không gian giữa lam kính và phần giữa của phiến kính đủ chia thành ô lưới sẽ tạo thành buồng đếm. Các tế bào nấm men được đếm trên các ô lớn của lưới (bằng số lượng của mỗi ô nhỏ cộng lại). Thể tích của mỗi ô này là 1/250mm3. Ta phải đếm số lượng tế bào nằm trong các ô của lưới cũng như trên các cạnh phía trên và phái bên phải ủa môi ô. Vì độ chính xác của việc xác định phụ thuộc vào chỗ lam kính có áp suất vào bề mặt của buồng đếm hay không, cho nên tốt nhất là đếm lặp lại số lần, mỗi lần đếm 150-200 tế bào. Nếu bắt đầu đếm sau khi đã cho giống vào buồng đếm khoảng 3-5 phút, để cho tế bào lắng xuống, để cho tế bào lắng xuống, khi soi kính ta thấy chúng trên cùng một mặt phẳng. Số lượng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù được tính theo công thức: M = ở đây: M- số lượng tế bào (triệu)/ml; a-số lượng tế bào trung bình; h- chiều sâu của buồng đếm, 1/10 mm; S- diện tích ô vuông lớn,1/25mm2. Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp pha loãng rồi cấy trên hộp Pectri có môi trường thạch, nuôi vài ngày rồi đếm khuẩn lạc rồi suy ra số lượng tế bào theo hệ pha loãng. Phương pháp này chỉ đếm được tế bào sống và mất nhiều thời gian. Sơ đồpha loãng xem hình 10.1. Xác định mức độ sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục trên máy so màu với bước sóng 580-650nm (nanomet), thường dùng lọc màu đỏ 620nm. Nếu phương pháp này lọc đường cong chuẩn với mối tương quan OD và số lượng tế bào (qua đếm tế bào) thì ta có thể suy ra sô lượng tế bào nấm men 1ml dịch huyền phù. PHương pháp này chỉ thích hợp cho các môi trưởng lỏng đồng nhất, có thể không chính xác, nhưng cho phép ta xác định được sự sinh trưởng và phát triển của giống nghiên cứu. IV.3) Nghiên cứu hình thái bào tử của nấm men Khả năng tạo thành bào tử và nẩy mầm của bào tử cũng như hình dạng của bào tử là dấu hiệu của loài nấm men. Vì vậy, cần xác định một cách có hệ thống vị trí, trạng thái của chủng nấm men được phân lập khi cấy chúng vào môi trường đặc bịêt để tạo thành bào tử. Để nấm men sinh bào tử người ta có thể cấy chúng trên nhiều ôi trường khác nhau. Hiện nay người ta hay cấy chuyền giống nấm men 1-2 ngày trên môi trường đặc vào môi trường axetat. Thành phần môi trường đặc như sau: Pepton 10 Nước cho đủ cho đủ 1l Nước chiết men 5 Hấp thah trùng ở 0,8atm trong 30 phút Glucoza 20 Thạch 20 Thành phần môi trường axetat như sau(g/l): Natri axetat 10 Nước cho đủ 1 lit Kali clorua 5 môi trường được hấp thanh trùng ở 1atm trong vòng 30 phút Thạch 20 Hoặc cấy trên môi trường Gorotkova được Kregơvan-Rip cải tiến có thành phần(g/l): Glucoza 1 Nước đủ 1l Pepton 10 hấp thanh trùng ở 1200C trong 15 phút NACl 5 Thạch 30 Chú ý: Những bào tư nấm men được hình thành trong nang. Nang bào tử hình trong, hình trứng hoặc hình nón. Bào tử nang thường sinh ra ở môi trường nghèo. Nhuộm bào tử theo phương pháp Vieczơ(Wirtz) được Sap-fe và Fulton (Schaefier-Fulton) cải tiến. Cách làm như sau: Làm tiêu bản trên phiến kính và cố định bằng nhiệt: Nhỏ lên tiêu bản dung dịch malastit xanh lục đã pha loãng, để 30-60 giây, hơ nóng 3 lần đến khi bốc hơi. Rửa bằng nước thường 30 giây; Nhỏ lên tiêu bản dung dịch saframin 0,5%, để yên trong 30 giây. Rửa, sấy khô và soi vật kính dầu. Sau khi nhuộm bào tử bắt màu xanh lục, tế bào còn lại còn màu đỏ. Soi tìm bào tử cũng có cách làm hơi khác, như sau: Nấm men bình thường khó sinh bào tử, muốn chúng sinh bào tử phải nuôi chúng ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Một trong cách nuôi đó là phương pháp dùng khối thạch cao: Trộn 2 phần thạch cao (CaSO4) khan với 1 phần nước. Từ thạch cao nhão này ta nặn thành khối có đường kính d=2-3cm và chiều cao h=1-1,5 cm. Bề mặt của khối thạch cao được làm sạch. Khối này được đặt vào hộp đĩa Pectri và thanh trùng khô (trong tủ sấy 1600C/1h). Đáy hộp vào bề mặt khối thạch cao được làm ẩm bằng nước máy vô trùng. Cặn men được nuôi 2 ngày ở môi trường Gorotkova được dùng que cấy vô trùng bôi lên bề mặt khối thạch cao và để ở tủ ấm 25-30C trong 1-2 ngày. Sau 30h các tế bào nấm men đã có thể sinh bào tử Môi trường Gorotkova có thành phần (g/l) như sau: Pepton 10 Nước có đủ 1l Cao thịt 10 hấp 0,8atm trong 20-30 phút. NaCl 5,0 Glucoza 2,5 Lấy nấm men từ bề mặt khối thạch cao, làm tiêu bản, nhuộm bào tử rồi soi kính. Bào tử thường khó bắt màu hơn tế bào chất, vì vậy cần phải dùng thuốc nhuộm mạnh và gia nhiệt. Tất cả các phương pháp nhuộm đều dựa trên nguyên tắc: đầu tiên là nhuộm tiêu bản chung, sau tẩy phần màu của tế bào chất rồi nhuộm bổ sung cho các tế bào chất bắt màu riêng biệt. Nhuộm bào tử người ta thường dùng Fuxin carbolic (Fuxin có thêm phenol) cho ngập vết bôi, hơ qua ngọn lửa cùng với thuốc nhuộm trong ài phút tới khi bốc hơi ( nhưng không được sôi dịch trên vết bôI). Chất màu bay hơ dần, ta lại thêm thuốc nhuộm lên tiêu bản để tránh vết bôi bị khô. Để tẩy màu, người ta dùng dung dich H2SO4, HCl hoặc axit axetic.1-5%, dung dịch cồn 33%...Thời gian tẩy màu phụ thuộc vào đặc tính của từng tiêu bản, có thể là từ vài giây đến vài phút. Sau tẩy nàu là rửa bằng nước. Sau khi rửa bằng nướctiêu bản được nhuộm bổ sung bừng xanh metylen trong 1-2 phút. Soi kính thấy tế bào chất bắt màu xanh và bào tử màu V)BẢO QUẢN bảo quản giống vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật.Bảo quản nhằm mcj đích làm chậm qá trình hô hấp và trao đổi chất cả tế bào vi sinh vật,ngăn cản sự sinh sả của chúng,đồng thời không làm thay đổi bản chất ban đầu của chúng ,có nghĩa là nếu giống được bảo quản tốt thì các quá trình sinh lí,hoá y như ban đàu nếu gặo được điều kiện sinh trưởng như ban đầu.Giống đi đem bảo quản phải thuần khiết và và phải ở trạng thái sinh lý tốt có nhiều cách để bảo quản giống vi sinh vật,như phương pháp cấy chuyền định kì lên môi trường mới ,phương pháp giữ giống tren môi trường thạch có lớp dầu khoáng,phương pháp giữ giống trên cát hay hạt,hay phương pháp đông khô V.1) Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh trên môi trường thạch nghiêng PHương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các vi sinh vật và bảo quản ở nhiệt độ thấp( koảng 40C. Tuy nhiên tuỳ thuộc vào loại nấm men mà thời gian cấy chuyền định kì khác nhau. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng thời gian bảo quản không lâu. Hơn nữa phẩm chất ban đầu của giống dễ bị thay đổi. Giống vi sinh vật được cấy chuyền định kì trong môi trường thạch đặc hiệu và được giữ trong điều kiện nhiệt độ nói trên. Nên cấy chuyền thường xuyên (thường vài tuần hoặc vài tháng tuỳ theo loài nấm men) và có sổ ghi chép để tiện theo dõi. Phương pháp tiến hành: Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên môi trường agar ở đĩa pectri,chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy trên môi trường thạch nghiêng thích hợp,sau đó nuôi trong tủ ấm để nấm men phát triển bình thường,lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 40C. Hàng tháng cấy chuyền lại vào môi trường mới. Để khắc phục hiện tượng bị mất nước,môi trường giữ giống bị khô làm cáêt nấm men người ta có thể thêm vào môi trường 1% dầu thực vật như dầu dừa,dầu lạc… khi làm môi trường. Nhược điểm của phương pháp này là Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản. Tốn nhiều công sức để cấy truyền. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp. Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền. V.2) Phương pháp bảo quản giống trên lớp dầu khoáng Dầu khoáng được sử dụng ở đây có đây có thể là paraph