Đồ án Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ khoáng đa lượng đến sự hình thành và phát triển chồi lan phalaenopsis yubidan và lan dendrobium sonia trong hệ thống nuôi cấy ngập tạm thời (TIS)

ï phát triển của phôi có thể được điều khiển thông qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí. Việc tạo ra các cây con thông qua con đường tạo phôi soma cho thấy thích hợp nhất đối với quá trình nhân sinh khối bằng cách sử dụng bioreactor màng lọc xoay. 1.2.3.2. Bioreactor có khuấy và không khuấy bằng nén khí (Pneumatically agitated and non-agitated bioreactor) Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có nhiệm vụ khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột). Trong một số trường hợp, bình nuôi cấy có thể gắn thêm các ống thông (đối với bioreactor air-lift). Bioreactor air-lift Kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dòng xoáy-STRs (nhưng ở đây thì không có cánh khuấy). Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đó là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào nhờ những dòng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên. Sự hòa trộn dòng khí vào trong pha lỏng trở nên có hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường. Để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn, dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao. Bioreactor sục khí dạng đơn giản và bioreactor sủi bọt khí dạng hình cột (Simple aeration bioreactor and bubble column bioreactor) Giống bioreactor air-lift, bioreactor sủi bọt hình cột cũng tạo ra ít sự cọ sát. Điểm khác biệt chủ yếu giữa bioreactor air-lift và bioreactor sủi bọt hình cột là hệ thống tuần hoàn và chế độ thủy động lực học. Loại bioreactor này thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau thông qua quá trình nuôi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành nhiều phần và cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khối. Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột: a) có bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào có khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuôi cấy (trong bọt). Số lượng tế bào bên trong bình biểu thị tổng sinh khối của tế bào. Hiện tượng nổi bọt và tăng trưởng trên thành bình do đường kính của bình và nắp bình có cùng kích thước. Vấn đề này đã được giải quyết bằng cách cải tiến bình nuôi cấy như miệng bình có đường kính lớn hơn, hay bình có kiểu dạng cầu. Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này có hình cầu và có nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình có một khóa hình chữ Y hoặc chữ T có nhiệm vụ châm thêm môi trường và là cổng thu sản phẩm. Bằng việc sử dụng một thiết bị sủi bọt với các lỗ đồng tâm đặt đáy bình, điều này đã làm cho lượng bọt được giảm. Ngoài ra, trên nắp bình còn có gắn thêm các thiết bị đo pH và oxy hòa tan. Những bioreactor dạng này được sử dụng trong vi nhân giống tạo phôi soma (Kim, 1999; Paek et al., 2000). 1.2.3.3. Bioreactor thổi khí trên bề mặt (Overlay aeration bioreactor) Dạng bioreactor này thổi khí từ trên bề mặt xuống dung dịch lỏng và đôi khi kết hợp với sục khí nhẹ nhưng hệ số oxy hòa tan khá thấp (nhỏ hơn 1). Kiểu bioreactor này được báo cáo là chưa thành công lắm trong nuôi cấy mô. 1.2.3.4. Bioreactor ngập gián đoạn tự động (Automated temporary immmersion bioreactor) Hệ thống ngập tự động này đã được thương mại dưới tên gọi là “RITA” do Teisson và Alvard thiết kế (1995). Hệ thống bioreactor này gồm hai bình chứa, một bình dùng cho sự tăng trưởng của thực vật, một bình dùng để chứa môi trường lỏng. Hai bình này được nối với nhau bằng ống silicon và thủy tinh. Không khí nén từ một thiết bị bơm khí sẽ đẩy môi trường lỏng từ bình chứa thứ nhất sang bình chứa thứ hai, làm ngập hoàn toàn mẫu thực vật. Sau đó, khí sẽ rút khỏi bình chứa môi trường, làm cho môi trường ở bình nuôi cấy hạ xuống. Trong mỗi trường hợp như vậy, không khí được thổi qua một màng lọc vô trùng với kích thước lỗ 0,2 mm. Một thiết bị điều khiển hẹn giờ được dùng để ấn định khoảng thời gian cho một chu trình dâng lên và hạ xuống. Có một hệ thống van 3 cổng dạng so-le được dùng trong trường hợp điều khiển đóng mở này. Hệ thống bioreactor này đã được báo cáo là nuôi cấy thành công trên một số cây như: cây lê (Damiano và cộng sự, 2000), cây dứa (Esscalo và cộng sự, 1999), cây mía (José Carlos Lorenzo và cộng sự, 1998) và cây Coffea arabica (Etienne và cộng sự, 1999). Như vậy, để nhân giống với số lượng lớn đồng thời cả phôi soma và mô thực vật phát sinh cơ quan một cách có hiệu quả thì cấu trúc bioreactor và thể tích môi trường phải được thiết lập sao cho phù hợp với các yêu cầu về sự khuấy trộn và hiếu khí của từng loại mô thực vật được nuôi cấy, cũng như phải làm sao giảm được tối thiểu cường độ cọ sát giữa các mẫu. 1.2.4. Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng bioreactor Qui trình nhân sinh khối thực vật bằng bioreactor gồm các bước sau: a) Bước I: Thiết lập môi trường nuôi cấy vô trùng. b) Bước II: Gồm 2 bước nhỏ. - Cảm ứng việc tạo nhiều chồi trên một diện tích bề mặt mẫu mô cấy (nuôi cấy trên môi trường agar). - Tăng cường sự phát triển của các chồi bằng kỹ thuật sử dụng bioreactor. c) Bước III: Giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con trước khi đem ra vườn ươm. Trong đó: Bước I: là bước cơ bản cho mọi quá trình nuôi cấy nhằm hạn chế việc nhiễm khuẩn cho mẫu. Bước II: là bước cảm ứng tạo nhiều chồi bên và chồi bất định trên mẫu mô nuôi cấy bằng cách cho thêm cytokinin vào môi trường. Kích thước của các chồi tạo ra quá nhỏ nên không thể chuyển sang nuôi cấy bằng bioreactor. Mục đích của bước II là giúp cho các chồi phát triển, tăng trưởng nhanh hơn để tạo thành cây con. Bước III: là bước giúp tạo rễ và làm cứng cáp cây con, đây là bước cần thiết, tuy nhiên không phải áp dụng cho tất cả các loài, ở một số loài có thể bỏ qua bước này. Đây là con đường nhân sinh khối lí tưởng trong nuôi cấy mô thực vật (Takayama, 1991). Quá trình nhân giống cho hệ thống nuôi cấy bioreactor như sau: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng cho mẫu mô hay đỉnh sinh trưởng, sau đó chuyển vào môi trường có nồng độ cytokinin cao để kích thích hình thành cụm chồi. Mẫu mô mang cụm chồi sau đó được nhân nhanh bằng cách cấy chuyền vào môi trường tương tự. Các cụm chồi này được sử dụng như những hạt nuôi cấy trong bioreactor nhỏ để tạo ra cây con. Điều kiện nuôi cấy tối ưu được khảo sát trong những bước này. Một khi môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy đã được thiết lập thì các cụm chồi này sẽ được nhân nhiều để tiến hành nuôi cấy trong các bioreactor lớn. Cây con tạo ra sau đó được chuyển ra đất. 1.2.5. Sự phát triển của thực vật trong bioreactor 1.2.5.1. Quá trình phát sinh phôi soma Việc sử dụng môi trường lỏng nuôi cấy tế bào soma để tạo phôi đã được đề cập từ những năm 1958 trên cây cà rốt do Steward và cộng sự tiến hành. Tính toàn thế của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng, đặc biệt giúp kích thích tạo phôi đơn bội. Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường sử dụng 2,4-D) và nước dừa ban đầu. Sau đó dùng nhiều cytokinin, myo-inositol và giảm lượng nitrogen. Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì phải hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường. Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra. Quá trình phát sinh phôi soma được quan sát lần đầu tiên ở một chi của họ Umbelliferae được nuôi cấy trong môi trường lỏng (Steward và cộng sự, 1970). Kể từ đó, quá trình này còn được công bố ở nhiều cây hạt trần và cây hạt kín, bao gồm loài cây cảnh, cây rau và cây lương thực cũng như cây thân gỗ. Con đường phát sinh phôi đối lập với con đường phát sinh cơ quan. Đây có thể là một hệ thống sản xuất hiệu quả hơn trong việc nhân giống tạo số lượng lớn. Sự phát sinh phôi soma có thể ít bị biến dị. Tuy nhiên, hiện tượng biến dị soma đơn dòng có thể ít xảy ra ở mô tái sinh trực tiếp nhưng lại thường xảy ra ở các phôi soma phát triển từ mô sẹo nuôi cấy liên tục. Các phôi đã chứa đầy đủ đỉnh sinh trưởng chồi và rễ sẽ được chuyển sang giai đoạn ra rễ giống như kỹ thuật nhân giống chồi in vitro truyền thống. Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các qui trình nhân sinh khối, chúng có thể được phân tách, đưa vào và khuấy trộn bằng một hệ thống tự động, sau đó có thể được cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp với sự hỗ trợ của các hệ thống máy móc. Sự phát sinh phôi soma trong nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã được công bố ở cây cà rốt, cây carum (họ hoa tán), cây trạng nguyên, cây cỏ linh lăng, cây cần tây, cây Eschcholtzia californica, cây Octea catharinensis, cây khoai lang, cây cao su và cây vân sam (spruce). Tuy nhiên, để đạt được mục đích cuối cùng là tạo hạt nhân tạo thì trong số những giống cây trên, quá trình tạo phôi soma trong nuôi cấy lỏng lắc, bioreactor chỉ mới thành công trên một số loài như ở cây cà rốt, cây cỏ linh lăng, cây cần tây, và cây vân sam trắng và hiện nay đang khảo sát trên một số loài cây khác (Ziv, 1999). 1.2.5.2. Quá trình phát sinh cơ quan Hiện nay, hầu hết các thực vật được nhân giống thương mại trên môi trường bán rắn đều thông qua con đường phát sinh cơ quan. Đây là một quy trình tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Vì vậy nếu chuyển sang tự động hóa bằng máy sẽ giảm bớt được các thao tác bằng tay và giảm được giá thành lao động. Một giải pháp đã được sử dụng để tự động hóa là dùng môi trường nuôi cấy lỏng trong bioreactor. Thông tin về việc sử dụng bioreactor cho các cấu trúc đơn tiềm năng như: protocorm, chồi hay đỉnh sinh trưởng bị hạn chế, nguyên nhân chính là do hiện tượng thủy tinh thể ở lá và chồi. Một trong các nỗ lực đầu tiên về việc sử dụng môi trường nuôi cấy lỏng để vi nhân giống chồi đã được báo cáo ở cây hoa lan, nó được tạo thành từ căn hành với sự kéo dài chồi rất bé trong giai đoạn nuôi cấy lỏng (Morel, 1974). Căn hành có thể được phân tách và cảm ứng tạo cây con mới sau khi đã được nhân giống thông qua con đường phát sinh cơ quan trong nuối cấy lỏng lắc và trong bioreactor. Việc kiểm soát sự tăng trưởng của chồi và cung cấp các điều kiện nuôi cấy thích hợp đã giảm được sự tăng trưởng bất thường của lá và kích thích sự tạo chồi hay các cụm đỉnh sinh trưởng như đã tiến hành ở cây khoai tây và hoa lay-ơn. Chúng có tốc độ kéo dài nhanh và không có hiện tượng thủy tinh thể (Ziv, 1999). 1.2.6. Một số vấn đề thường gặp trong nuôi cấy lỏng Quá trình nhân nhanh trong bioreactor đều sử dụng môi trường lỏng thay cho môi trường bán rắn kể từ giai đoạn tái sinh đến giai đoạn tăng sinh khối. Môi trường nuôi cấy lỏng thường dẫn đến sự phát sinh hình thái bất thường, chẳng hạn như hiện tượng thủy tinh thể (hyperhydricity hay vitrification) (Debergh và cộng sự, 1992). Cho đến nay, định nghĩa về hiện tượng thủy tinh thể vẫn chưa được rõ ràng. Nói chung, đây là một hiện tượng liên quan đến sự rối loạn trong hình thái và sinh lý của thực vật trong quá trình tăng trưởng in vitro, kết quả làm mất đi khă năng phát triển bình thường, và sau đó kéo theo hàng loạt các vấn đề trong suốt quá trình thích nghi của thực vật khi ra vườn ươm (Paques và Boxus, 1987). Biểu hiện của thực vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng là thường yếu ớt, xuất hiện các tinh thể nước giống như thủy tinh, mọng nước ở lá và ở chồi, hệ rễ phát triển kém. Lá là cơ quan chịu ảnh hưởng nhiều nhất trong môi trường lỏng. Chúng phát triển một loại nhu mô vô tổ chức, loại này được tạo ra từ các lớp nhu mô xốp có không gian liên bào rộng, một loại mô mạch không định hình, một lớp biểu bì bất thường. Lớp mô biểu bì của các lá thừa nước thường phát triển không tốt và quá trình đóng mở khí khẩu không còn ổn định như trước. Hậu quả của hiện tượng thủy tinh thể là lá ít phát triển trong điều kiện in vitro cũng như ex vitro và có thể cả cây cũng vậy, thường yếu và chết. Do vậy, khi hiện tượng thủy tinh thể xảy ra thì chức năng quang hợp cũng như hô hấp của lá có thể không còn thực hiện được tốt như trước nữa, nên cây sau khi chuyển ra đất thường ít khả năng sống sót và kém phát triển. Sau khi nhân giống in vitro, các cây xuất hiện hiện tượng bất thường về kiểu hình và cấu trúc giải phẫu, ở giai đoạn ex vitro thường có hiện tượng bất thường về kiểu hình. Các biểu hiện sai hỏng, chẳng hạn như thừa nước, lá và chồi kém phát triển, phôi bất thường, rối loạn quá trình phát sinh phôi đều là kết quả của sự gián đoạn hay mất tín hiệu trong trình tự của quá trình tái tạo cơ quan ở thực vật. Các vấn đề nêu trên biểu hiện nghiêm trọng hơn đối với nuôi cấy lỏng và cần phải có những nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ cũng như có thể kiểm soát được sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy bioreactor - một mô hình lớn của nuôi cấy lỏng. Có nhiều nghiên cứu đã được báo cáo trong việc khắc phục hiện tượng thủy tinh thể và cũng thu được nhiều kết quả. Chẳng hạn như giảm độ ẩm tương đối bằng cách tạo sự trao đổi khí bên trong và bên ngoài của bình nuôi cấy, tăng nồng độ agar trong môi trường nuôi cấy, sử dụng các chất hấp thụ ethylen như bột than, KMnO4, hoặc alginate STS, sử dụng các loại bình nuôi cấy lớn hơn tạo một sự thoáng khí cưỡng bức hay bổ sung các chất chống thủy tinh thể (anti-hyperhydricity) có bán trên thị trường, tên thương mại là EM2 (A0807, Sigma-Aldrich, Pool, Dorset, UK), M-Gel (Migros, Immensee, Switzerland), iota-type carrageenan (C1006, batch no 29225, Duchefa Biochemie BV, Haarlem, the Netherlands). 1.2.7. Các thông số vật lý ảnh hưởng đến mô thực vật nuôi cấy trong hệ thống bioreactor. Nguyên tắc của việc thiết kế và vận hành bioreactor là dựa trên nhu cầu sinh học của đối tượng nuôi cấy cũng như những đòi hỏi về kỹ thuật, trong đó những yếu tố kỹ thuật cần quan tâm gồm: sự vận chuyển khí oxy và khả năng hòa tan oxy vào môi trường, áp lực tạo ra nhỏ, giảm thiểu những lực va đập và lực xé trong bình nuôi cấy, thuận tiện trong việc điều khiển những thông số hóa lý và cuối cùng là có tính khả thi khi mở rộng sang trong quy mô sản xuất lớn. 1.2.7.1. Không khí Không khí trong bình nuôi cấy có thành phần gồm nitrogen (78%), oxy (21%) và carbon dioxide (0.036%). Lượng không khí trong bình nuôi cấy được quyết định bởi hai yếu tố: thể tích của bình và độ thoáng khí. Thực vật thải CO2 và tiêu thụ O2 trong quá trình hô hấp, còn trong quang hợp thì thực vật tiêu thụ CO2 và thải ra khí O2. Trong pha tối, nồng độ CO2 tăng lên trong nuôi cấy, còn khi điều kiện quang tự dưỡng chiếm ưu thế thì nồng độ đó giảm đi trong pha sáng. Trong quá trình nuôi cấy, thực vật in vitro còn thải thêm nhiều loại khí thải như ethylene, ethanol, acetaldehyde và hydrocarbon vào bầu không khí trong bình nuôi cấy. Hầu hết ảnh hưởng của CO2, O2 và C2H4 đối với sự tăng trưởng của thực vật in vitro chỉ được nghiên cứu trong điều kiện nuôi cấy bán rắn hay nuôi cấy huyền phù tế bào. Đối với các bioreactor, pha khí phụ thuộc vào dòng không khí đi vào và do đó có thể dễ dàng được kiểm soát để cung cấp đúng lượng CO2, O2 và C2H4 cần thiết. Đối với loại bioreactor air-lift và bioreactor sục khí hình trụ, khí được cung cấp vào hệ thống theo hai hình thức là khuấy trộn và sục khí. Tầm quan trọng của pha khí và việc sục khí đã được tìm hiểu khi nuôi cấy khoai tây bằng bioreactor air-lift. Trong điều kiện nuôi cấy chìm liên tục, quá trình tạo củ bị ức chế. Các củ bi chỉ phát triển sau khi các chồi được kéo dài ra và được tiếp xúc pha khí ở phần trên bioreactor. Các biện tăng cường thêm lượng O2, điều khiển lượng hormone và các điều kiện thẩm thấu đều không có hiệu quả và đều không giải thích được cho hiện tượng trên. Nhưng nếu thay bằng hình thức nuôi cấy 2 pha, môi trường có bổ sung 9% sucrose để cảm ứng tạo củ thì sự tạo củ từ chồi sẽ phát triển, vượt lên cả môi trường, tiếp xúc với pha khí ở phía trên. Các kết quả đó đã cho thấy tầm quan trọng của pha khí trong bioreactor đối với sự phát triển đặc biệt của thực vật. 1.2.7.2. Oxy hòa tan Một trong những chức năng của bioreactor là khả năng tăng cường khả năng vận chuyển oxy từ pha khí sang pha lỏng. Do oxy chỉ hòa tan một phần trong nước (0.25 mmol.l-1 ở 25oC, 1 atm, oxy chiếm 21% thể tích không khí) nên để đáp ứng nhu cầu oxy cho sự phát triển của mô thực vật, một lượng lớn oxy cần được khếch tán vào môi trường nuôi cấy (Leathers và cộng sự, 1995). Những yếu tố liên quan đến vấn đề này gồm có độ thoáng khí, tốc độ khuấy đảo, hình dạng cánh khuấy, độ hòa trộn không khí và kết cấu của bioreactor. Ngoài ra, mức độ đảo trộn của mẫu cấy cũng là yếu tố cần quan tâm do oxy hòa tan trong môi trường cần nhanh chóng được mô và tế bào hấp thu. Tóm lại, để đáp ứng tốt nhất nhu cầu oxy cho sự phát triển của mô và tế bào thực vật, lượng oxy hòa tan trong dung dịch nuôi cấy luôn phải lớn hơn ngưỡng oxy hòa tan cực đại mà tế bào mô hấp thu (DO2 htcđ). Trong tình huống lượng oxy hòa tan trong môi trường nhỏ hơn DO2 htcđ, năng lượng ATP của tế bào giảm sút, từ đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát sinh hình thái và sự trao đổi chất của tế bào (Leathers và cộng sự, 1995). Trong thực tế, người ta căn cứ vào giá trị DO2 htcđ để thiết kế bioreactor và giá trị này cũng là yếu tố cần được quan tâm hàng đầu khi tiến hành phóng đại hệ thống lên quy mô lớn hơn. 1.2.7.3. Sự đảo trộn Thông số về sự đảo trộn là một yếu tố quan trọng khác vì nó phản ánh mức độ đồng đều trong phân phối chất dinh dưỡng và mẫu cấy trong toàn bộ không gian nuôi cấy (Leathers và cộng sự, 1995). Việc đảo trộn được thực hiện dưới những hình thức như sục khí, khuấy trộn cơ học hoặc kết hợp cả hai hình thức trên. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng thủy động lực của các quá trình khuấy trộn chỉ được ở mức vừa đủ để kích thích mô, thực vật chứ không được quá lớn đến mức làm tổn thương mô, tế bào nuôi cấy. Cho đến nay, việc nghiên cứu một cách chi tiết ảnh hưởng của thủy động lực lên cấu trúc, thành phần mô, tế bào vẫn còn nhiều hạn chế. Những nghiên cứu đã công bố chủ yếu chỉ đề cập đến động lực của sự tăng trưởng tế bào và sự hình thành các sản phẩm thứ cấp. 1.2.7.4. pH Theo một số tác giả, sự thay đổi độ pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy liên quan đến sự cân bằng các muối ammonium trong môi trường (Escalona và cộng sự, 1999). Khi pH hạ xuống dưới 5.0, mô thực vật sẽ bị ức chế một cách rõ rệt. 1.2.7.5. Chất dinh dưỡng Trong nuôi quy mô lớn, thành phần dinh dưỡng là yếu tố hóa học quan trọng. Những kết quả thu nhận định kỳ trong suốt quá trình nuôi cấy cung cấp thông tin về sự hấp thu chất dinh dưỡng, lượng sinh khối được tạo thành và những sản phẩm bậc hai được sản xuất trong hệ thống bioreactor. Chẳng hạn như dựa trên những phân tích chi tiết về thành phần dinh dưỡng khi nuôi cấy củ Lilium trong hệ thống bioreactor sục khí dạng hình cầu, tác giả nhận thấy rằng sau 16 tuần nuôi cấy, các muối ammonium, nitrate, phosphate hầu như cạn kiệt, trong khi các ion K+, Mg2+, Ca2+, Na+ và Cl- vẫn còn một lượng trong môi trường. Điều đặc biệt là lúc này, surose trở thành một yếu tố gây ức chế sự tăng trưởng thay vì là một nguồn dinh dưỡng chính. Những thí nghiệm tương tự cũng được tiến hành trên nhiều đối tượng khác như Begonia, huyền phù tế bào lúa, phôi soma cây cà rốt, rễ bất định nhân sâm và củ khoai tây bi được nuôi cấy trong bioreactor. Tuy nhiên, vẫn còn có những nghiên cứu chi tiết hơn về sự tương tác giữa các chất điều hòa và chức năng của những hợp chất dinh dưỡng khi nuôi cấy trong hệ thống bioreactor. Những kết quả phân tích này sẽ mở ra khả năng điều khiển tốt hơn những quá trình phát sinh phôi và phát sinh cơ quan của thực vật. Qua nhiều nghiên cứu khác nhau về sử dụng bioreactor trong nuôi cấy thực vật, người ta kết luận rằng không có một mô hình nào thích hợp cho tất cả các đối tượng, mà các giải pháp sẽ được lựa chọn dựa trên các loại mô, đối tượng thực vật nuôi cấy cũng như quy mô và tính kinh tế của việc sản xuất. Tóm lại, sử dụng bioreactor trong nuôi cấy mô là một phương pháp đầy triển vọng trong nhân số lượng lớn tế bào, phôi và cơ quan thực vật (chồi, thân hành, củ, giả hành,…). Đã có nhiều nghiên cứu về ứng dụng của bioreactor trong nhân giống lớn các cây cảnh, cây dược liệu được công bố. Tuy nhiên, người ta cũng khuyến cáo rằng rất khó để có một hệ thống bioreactor tối ưu cho tất cả các loại đối tượng và mục đích nuôi cấy do những đặc tính khác biệt giữa các loài thực vật. Mặc dù vậy, ưu điểm vượt trộn của bioreactor là một khi đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho hệ thống nhỏ, ta hoàn toàn có thể áp dụng trong nhân giống ở quy mô lớn hơn (từ 500 – 1000 lít). 1.2.8. Một số thành tựu trong ứng dụng hệ thống bioreactor Môi trường lỏng là môi trường đã được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, phôi soma hay cơ quan thực vật kể cả trong nuôi cấy tĩnh hay các kiểu bioreactor khác nhau. Mặc dù trước đây bioreactor chủ yếu được sử dụng trực tiếp cho nuôi cấy huyền phù tế bào và sản xuất sản phẩm thứ cấp, nhưng gần đây cũng có nhiều bioreactor được cải tiến để tạo phôi soma mà đã được công bố trên một số giống cây (xem bảng 1.2). Bảng 1.2. Các nghiên cứu tạo phôi soma bằng bioreactor Loài thực vật Kiểu bioreactor Tác giả Aralia cordata Air-lift, dạng trống quay, dạng cột sủi bọt Nishihira et al., 1998 Capsicum annum Air-lift Marvituna và Buyukalaca, 1996 Air-lift, khuấy bằng thanh từ Marvituna và Buyukalaca, 1995 Coffea arabica Ngập gián đoạn Etienne-Barry et al., 1999 Camellia sinensis Ngập gián đoạn Akula et al., 2000 Eleutherococcus senticosus Air-lift Kim và Kim, 2001 Santalum album Air-lift Bapat et al., 1990 Air-lift Das et