Đồ án Nghiên cứu các phương pháp phân tích đánh giá rutin trong nu hòe

h phương pháp quang phổ, đo độ hấp thụ ở 362,5nm. Đường chuẩn thu được do máy tính tự động vẽ, lấy độ hấp thụ làm tung độ, nồng độ làm hoành độ. *Tiến hành: Cân 5g bột nụ hoè đã dược sấy khô ở 600C trong 6 giờ, cho và dụng cụ chiết sohxlet. Thêm 250ml methanol và chiết tới khi dịch chiết không màu. Dịch chiết được cất quay chân không thu hồi dung môi, còn lại kết tủa sấy khô 600C đến khối lượng không đổi và cân. Cân 50mg kết tủa đã sấy ở trên và riến hành pha như ở phần “dung dịch rutin chuẩn”. Sau đó lấy 1ml dung dịch vừa pha vào bình định mức 10ml, thêm methanol đến đủ thể tích và lắc đều. Tiến hành phương pháp quang phổ như ở phần “xây dựng đường chuẩn”, máy tính sẽ tự động hiển thị kết quả nồng độ, khối lượng rutin trong dung dịch mẫu thử. Từ kết quả thu được tính toán ra hàm lượng rutin trong nụ hoè: (5) Trong đó: m: khối lượng rutin trong 10ml dung dịch mẫu thử (mg) n: khối lượng kết tủa thu được (g) b. Định lượng rutin dùng dung môi ethanol [3] Cân 75mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100ml, hoà tan với ethanol tuyệt đối bằng đun nóng. Sau đó thêm ethanol cho đủ thể tích và lắc đều. Lấy 2ml dung dịch này cho vào một bình định mức 100ml, thêm 1ml dung dịch axít acetic 0,02N, sau thêm ethanol cho đến vạch và lắc đều. Xác định độ hấp thụ của dung dịch thu được ở các bước sóng 362,5nm và 375nm, dùng mẫu trắng là dung dịch ethanol tuyệt đối có 1% axít acetic 0,02N. Nếu tỷ số độ hấp thụ A375/A362,5 ở trong khoảng 0,875 ± 0,004 thì quang phổ kế thích hợp để đo độ hấp thụ của mẫu định lượng. Nếu tỷ số A375/A362,5 nằm ngoài khoảng trên thì ta phải tìm bước sóng x sao cho: x là vùng lân cận của bước sóng 375nm và tỷ số Ax/A362,5 ở trong khoảng trên. Bước sóng x tìm được sẽ thay thế cho bước sóng 375nm. * Đo mẫu thử: Cân 75mg mẫu thử đã sấy khô và tiến hành pha như với rutin chuẩn ở trên. Xác định độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử ở các bước sóng 362,5nm và 375nm (hoặc xnm), mẫu trắng dùng như với rutin chuẩn ở trên. Gọi độ hấp thụ đo được của mẫu thử ở 362,5nm là và ở 375nm (hay xnm) là . Nếu tỷ số ở trong khoảng 0,875 ± 0,004, hàm lượng phần trăm C27H30O16 trong mẫu thử được tính theo công thức sau: (6) Trong đó: 325,5 là A(1%,1cm) của rutin ở 362,5nm p: khối lượng mẫu thử tính bằng g. Nếu tỷ số > 0,879, hàm lượng phần trăm C27H30O16 trong mẫu thử được tính theo công thức: (7) Trong đó: p: Khối lượng mẫu thử tính bằng g. II.3. Phương pháp phân tích sắc ký Sắc ký là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh. Sắc ký là quá trình tách từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh [9,10]. Nguyên tắc chung của phương pháp phân tích sắc ký như sau: Hỗn hợp chứa chất phân tích thường ở pha động, các chất khác nhau trong hỗn hợp sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động của hỗn hợp phân tích qua các lớp pha tĩnh, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ – phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với các chất tương tác yếu hơn với pha tĩnh. Nhờ đặc điểm này, người ta có thể tách các chất bằng quá trình sắc ký [9]. II.3.1. Phân loại sắc ký Tuỳ thuộc vào trạng thái tập hợp của các pha, loại tương tác và sự hình thành sắc ký mà người ta phân biệt các loại sắc ký như trình bày ở bảng 1. Bảng 1 - Các dạng sắc ký cơ bản Dạng sắc ký Pha động Pha tĩnh Cách phân bố pha tĩnh Cơ chế trao đổi chất Khí Khí – hấp phụ Khí - lỏng Lỏng Lỏng – rắn Lỏng – lỏng Lỏng – nhựa trao đổi Lớp mỏng Giấy Rây ( sắc ký gel ) khí khí lỏng lỏng lỏng lỏng lỏng lỏng lỏng rắn lỏng rắn lỏng rắn rắn lỏng lỏng lỏng cột cột cột cột cột lớp mỏng lớp mỏng giấy sắc ký cột hấp phụ phân bố hấp phụ phân bố trao đổi ion hấp phụ phân bố phân bố theo kích thước phân tử II.3.2. Sắc ký khí Trong sắc ký khí (gas chromatography, viết tắt GC) thì tuỳ thuộc vào trạng thái pha tĩnh mà người ta phân biệt: sắc ký khí-hấp phụ khi pha tĩnh là chất hấp phụ rắn, sắc ký khí-lỏng khi pha tĩnh là chất lỏng (hay chính xác hơn là màng chất lỏng trên bề mặt chất mang rắn). Cột sắc ký được chế tạo bằng ống thủy tinh, thép, đồng hoặc bằng chất dẻo đặc biệt, đường kính cột có thể từ 3 - 6mm, có thể dài từ vài chục centimet đến hàng chục mét. Cột có thể dạng thẳng, hình chữ U hoặc hình xoắn. Tuỳ theo loại sắc ký khí mà bên trong cột thường nhồi các chất hấp phụ rắn hoặc chất mang có phủ màng mỏng (pha tĩnh lỏng). Trong sắc ký khí-hấp phụ, chất rắn hấp phụ có thể dùng: than hoạt tính không phân cực, silicagel, zeolit... Trong sắc ký khí-lỏng, thường dùng các dung môi sau làm pha tĩnh: dầu vazơlin, dầu silicon, dimetylformamit, tricresyl photphat, các alkyl phtalat..., đặc biệt là các tinh thể lỏng như các este azocxy. Chất mang rắn thường là các chất trơ, thường dùng kizengua, diatomit, teflon... Pha động là một dòng chất khí chọn trước để tải chất nghiên cứu ở thể khí qua cột, chất khí này gọi là khí mang. Việc chọn khí mang dựa vào loại detectơ dùng trong hệ sắc ký. Detectơ là bộ phận ghi nhận sự thay đổi liên tục của nồng độ hay các tham số khác trong dòng khí thoát ra khỏi cột sắc ký. Ví dụ: Khi dùng catoromet hoặc detectơ ngọn lửa ion hoá người ta hay dùng khí heli, nitơ làm khí mang và khi dùng detectơ kiểu bắt điện tử (ví dụ detectơ argon) người ta dùng nitơ làm khí mang... Trên hình 3 trình bày sơ đồ khối của một máy sắc ký khí, bộ phận quan trọng của máy là hệ thống cột tách và detectơ. Nhờ khí mang chứa trong bình (1), mẫu nghiên cứu từ buồng hơi (2) được dẫn vào cột tách sắc ký (3), cột sắc ký được ổn nhiệt theo yêu cầu của phép phân tích nhờ thiết bị ổn nhiệt (8). Quá trình tách sẽ xảy ra trên cột sắc ký. Sau khi các cấu tử rời khỏi cột tại các thời điểm khác nhau, sẽ đi vào detectơ (4), tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. Các tín hiệu sẽ được khuếch đại ở bộ khuếch đại (5) và được xử lý nhờ các bộ vi xử lý dưa ra các số liệu trên bộ ghi (6). 9 8 7 Mẫu 2 4 1 3 5 6 Hình 3 – Sơ đồ khối của máy sắc ký khí 1 – bình khí mang; 2 – bộ nạp khí; 3 – cột sắc ký; 4 – detectơ; 5 – bộ khuếch đại; 6 – bộ ghi; 7, 8, 9 – ổn nhiệt. II.3.2.1. Phân tích định tính bằng sắc ký khí H C D B A tA tB tC tD tr Hình 4- Sắc ký đồ hỗn hợp A, B, C, D. Trong quá trình sắc ký người ta sẽ ghi được sắc ký đồ. Từ sắc ký đồ ta sẽ nhận được các pic sắc ký tương ứng của từng cấu tử. Thời gian lưu (tr) của pic là đặc trưng định tính cho các chất. Để phân tích định tính, ta so sánh kết quả thu được với bảng số liệu hoặc kết quả của mẫu chuẩn được tiến hành cùng điều kiện. Để có được kết quả chính xác hơn, người ta thường tiến hành sắc ký theo nhiều cấp, nghĩa là thành phần tách ở cột sắc ký trước được đưa sang cột sắc ký tiếp theo, ở đây việc tách sẽ thực hiện sâu xa hơn. Hiện nay, người ta đã chế tạo được thiết bị sắc ký khí kết hợp khối phổ (Gas chromatography mass spectrum, viết tắt là GCMS) và được kết nối với máy tính nhờ đó nâng cao được độ nhạy, độ chính xác cũng như có thể tự động hoá quá trình phân tích sắc ký. II.3.2.2. Phân tích định lượng bằng sắc ký khí Phân tích định lượng dựa vào việc đo các tham số khác nhau của pic sắc ký như chiều cao, diện tích, thời gian lưu (hoặc thể tích lưu) hoặc tỷ số giữa nó và chiều cao pic. Các đại lượng này về nguyên tắc là tỷ lệ với nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp. Các phương pháp sắc ký khí định lượng chủ yếu là: phương pháp chuẩn hoá, phương pháp chuẩn hoá theo số hiệu chỉnh, phương pháp đường chuẩn tuyệt đối, phương pháp nội chuẩn. Việc áp dụng sắc ký khí vào phân tích định lượng rutin trong nụ hoè nói chung còn khó khăn, nên không đi sâu vào các phương pháp này. II.3.2.3. Nghiên cứu rutin bằng phương pháp sắc ký khí Phương pháp sắc ký khí được áp dụng chủ yếu để phân tích thành phần hỗn hợp. Vì vậy, phương pháp này có thể áp dụng vào phân tích thành phần nụ hoè hoặc là định tính rutin sản phẩm. Các phương pháp định lượng bằng sắc ký khí nói chung đều là các phương pháp gần đúng, hơn nữa rutin lại là chất rắn nên khó áp dụng. b b lH xl xf a a a Hình 5- Xác định Rf a-a: tuyến xuất phát. b-b: tuyến dung môi ở cuối thí nghiệm. ln II.3.3. Sắc ký lớp mỏng Về bản chất, đây là hệ sắc ký lỏng-rắn mà pha tĩnh (pha rắn) được trải thành lớp mỏng trên bảng kính, nhựa hay kim loại. II.3.3.1 Cơ sở phương pháp Tính chất hấp phụ của hệ sắc ký lớp mỏng được đặc trưng bằng độ linh động Rf Rf = xl/xf (8) Trong đó: xl: khoảng cách từ đường xuất phát đến tâm vết sắc ký. xf: khoảng cách từ đường xuất phát đến mức dung môi sau cùng so với đường xuất phát. Đúng ra Rf phải được tính bằng tỷ số giữa vận tốc chuyển động của tâm vết sắc ký với vận tốc của dung môi. Tuy nhiên việc xác định vận tốc rất khó khăn nên Rf được xác định theo hình 5. Trên lý thuyết thì Rf không phụ thuộc vào nồng độ và các yếu tố khác. Tuy nhiên, thực nghiệm chứng minh Rf không ổn định, nó phụ thuộc vào một số yếu tố như: chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ, độ ẩm của chất hấp phụ, chất lượng của dung môi Do đó trong thực tế người ta thường dùng đại lượng tương đối Rftd: Rftd = Rf/Rfc = xl/xlc (9) Trong đó: Rfc: độ linh động của chất chuẩn, tính theo công thức (8). xlc: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết sắc ký chất chuẩn. Chất chuẩn được hoà tan trong cùng dung môi với chất nghiên cứu và được nhỏ trên đường xuất phát bên cạnh mẫu nghiên cứu. Như vậy, trong quá trình sắc ký coi như chất chuẩn và chất nghiên cứu được thực hiện trong cùng điều kiện. II.3.3.2. Đặc điểm của sắc ký lớp mỏng 1 – Lớp mỏng Để trải lớp mỏng thường dùng các bảng thủy tinh lá nhôm hoặc màng polyete. Có loại màng trong suốt với tử ngoại, có ưu điểm có thể đo quang trực tiếp nhiều hợp chất trong lớp mỏng. Chất hấp phụ để trải lớp mỏng thường là bột silicagel, alumin (Al2O3), kizengua, bột xelulozơ 2 – Pha động Việc chọn dung môi làm pha động phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu. Người ta có thể dùng các dung môi đơn hoặc các hệ dung môi gồm hai hay ba thành phần với tỷ lệ thích hợp. Các dung môi đơn thường dùng có thể là: parafin có nhiệt độ bay hơi cao, xyclohexan, benzen, clorofom, ete, axetat etyl, rượu etylic, dimetylformanit, dimetylsulnfoxit, nước. Các hỗn hợp dung môi hay dùng và tỷ lệ thể tích là: benzen: axetat etyl (95: 5); clorofom: axeton (9: 1); benzen: methanol (95: 5); xyclohexan: axetat etyl (1: 1; 1: 4); benzen: axton (1: 1); hệ ba cấu tử: n-butanol: axit axetic: nước (4: 1: 5)... 3 – Một số đặc điểm khác Thông thường trong sắc ký lớp mỏng, người ta cho dung môi thấm trong lớp mỏng có chiều dài 10 - 12cm, vì nếu lớp mỏng dài hơn vận tốc chuyển động của dung môi rất chậm, vết bị khuếch tán rộng và giá trị Rf bị dao động nhiều. Sau khi kết thúc quá trình sắc ký thường ta phải tiến hành việc hiện hình vết sắc ký bằng phương pháp hoá học hoặc hoá lý. Khi hiện hình bằng phương pháp hoá học, người ta phun lên bảng mỏng một dung dịch thuốc thử có thể tác dụng với các cấu tử của hỗn hợp thành hợp chất màu có thể nhì rõ bằng mắt thường, ví dụ hơi iot có thể hiện hình các hợp chất không no. Trong phương pháp hoá lý, người ta có thể lợi dụng hiện tượng phát quang với các tia tử ngoại, có thể dùng một chất chỉ thị phát quang tác dụng được với các cấu tử trong hỗn hợp. Ngoài ra, người ta có thể nhận dạng các vết sắc ký bằng phương pháp phóng xạ II.3.3.3. Phân tích định tính bằng sắc ký lớp mỏng Phân tích định tính bằng sắc ký lớp mỏng ta so sánh giá trị Rf hay giá trị Rftd thu đựoc khi tiến hành sắc ký đồng thời mẫu thử và mẫu chuẩn trong cùng điều kiện và trên cùng một bản mỏng sắc ký. Hai chất (chất thử và chất chuẩn) đồng nhất với nhau khi Rf (hay Rftd) của chúng bằng nhau, hoặc khi trộn lẫn với nhau, rồi tiến hành sắc ký, chúng triển khai như chỉ có một chất duy nhất. Các tạp chất được phát hiện khi xuất hiện trên sắc ký đồ các vết phụ có Rf (hay Rftd) khác Rf của các vết tương ứng với chất thử. Cách thử này đôi khi có trở ngại vì vết phụ có thể không hiện vết với cùng thuốc thử hiện vết dùng cho mẫu thử. Vì vậy mà với những tạp chất đã biết được chỉ định cụ thể những điều kiện sắc ký xác định. Trong thực tế thường dùng giá trị Rftd vì nó ổn định hơn Rf. Để có kết quả định tính chắc chắn, nên tiến hành sắc ký song song mẫu thử và mẫu chuẩn trên cùng một bản mỏng và dùng ít nhất ba hệ dung môi khác nhau để triển khai. II.3.3.4. Phân tích định lượng bằng sắc ký lớp mỏng Người ta có thể tiến hành phân tích định lượng các chất bằng sắc ký lớp mỏng theo phương pháp đo trực tiếp trên bảng hoặc xử lý bằng các biện pháp thích hợp để lấy cấu tử nghiên cứu ra khỏi bảng. Khi xác định trực tiếp các cấu tử theo vết sắc ký trên bảng, người ta đo diện tích vết sắc ký và tìm lượng chất nghiên cứu theo đồ thị chuẩn đã lập sẵn. Nhưng phép phân tích cho kết quả chính xác nhất vẫn là phương pháp tách các chất phân tích ra khỏi bảng, việc tách các chất ra khỏi bảng có thể thực hiện bằng cơ học hoặc bằng cách rửa với dung môi thích hợp. Sau đó tiến hành xác định nồng độ các chất trong dung dịch rửa bằng các biện pháp thích hợp. II.3.3.5. Nghiên cứu rutin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Phương pháp sắc ký lớp mỏng có ưu điểm tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, có độ chọn lọc cao vì các chất chỉ cần khác nhau rất ít về cấu trúc và cấu hình cũng có thể tách ra bằng sắc ký lớp mỏng. Vì vậy, phương pháp này được áp dụng vào phân tích hầu hết các hợp chất hữu cơ, rutin không nằm ngoài số đó. Đặc biệt, trong phân tích định tính thì ta dễ dàng hiện màu vết sắc ký của rutin bằng hơi amoniăc đậm đặc. Tuy vậy, việc định lượng rutin nói riêng và các hợp chất hữu cơ nói chung bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng gặp đôi chút khó khăn vì ta phải tìm dung dịch phản hấp phụ thích hợp, sau đó là tìm phương pháp xác định nồng độ thích hợp với từng hợp chất. * Cách tiến hành phân tích định tính rutin trong nụ hoè: Cân 0,5g bột nụ hoè, thêm 10ml ethanol, đun sôi trong 3 phút, để nguội, lọc. -Bản mỏng: chất hấp phụ Silicagel G. -Dung dịch rutin chuẩn: Cân 0,010g rutin hoà tan trong 10 ml etanol 900, chấm lên bản mỏng. -Dịch chấm sắc ký: Lấy dung dịch lọc ở trên và chấm lên bản mỏng. -Hệ dung môi triển khai: n-butanol: axít acetic: nước (tỷ lệ thể tích: 4: 1: 5). Sau khi đã bay hơi hết dung môi, đặt tấm sắc ký dưới đèn tử ngoại sẽ thấy dịch chiết có vết phát quang màu nâu giống vết rutin chuẩn, đem hiện màu bằng hơi amoniăc đậm đặc sẽ thấy có vết màu vàng cùng Rf chuẩn (Rf: 0,50 - 0,54). II.3.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao hay sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, viết tắt là: HPLC) là một cải tiến của sắc ký lỏng dạng cột. Trong phương pháp sắc ký cổ điển, cột sắc ký thường là những ống thủy tinh đường kính 0,5 - 5cm và có độ dài 20 - 100cm nạp đầy chất hấp phụ và pha động. Pha động chuyển động dưới tác dụng của trọng lực. Mẫu phân tích thường được đưa vào ở phần trên của cột. Người ta thu thập dung dịch thoát ra khỏi cột, trong từng khoảng thời gian xác định, tiến hành phân tích nồng độ các cấu tử bằng phương pháp thích hợp. Nhờ các cải tiến về thiết bị như: dạng cột, cách nạp mẫu, chất hấp phụ... ở “sắc ký lỏng hiệu năng cao” ta có thể nhận được kết quả phân tích có độ nhạy, độ chọn lọc cao hơn. 11 3 1 13 5 8 12 9 7 6 10 4 2 Hình 6- Sơ đồ khối thiết bị phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 1,2: Bình dung dịch rửa; 3,4: Bơm; 5: Bộ điều khiển; 6: Buồng hộp; 7: ống phun; 8: Cột sắc ký; 9: Detectơ; 10: Bộ ghi; 11: Khối xử lý kết quả phân tích; 12: Bộ thu sản phẩm; 13: ổn nhiệt. Trên hình 6 là sơ đồ mô tả thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao [9]: hai máy bơm (3,4) được điều khiển bằng bộ vi xử lý (5) theo một chương trình chọn trước. Thành phần và tốc độ nạp dung dịch vào hệ thống sắc ký được điều khiển theo chế độ chọn trước theo chương trình (tuyến tính, luỹ thừa hay bất kỳ mối quan hệ nào khác), tuỳ thuộc vào điều kiện phân tích. Để tăng nhanh tốc độ phân tích mẫu, người ta thường sử dụng các bơm có áp suất cao (đến 400 MPa). Mẫu được đưa trực tiếp vào dòng dung dịch rửa nhờ cấu trúc phun đăc biệt (7). Sau khi qua cột sắc ký (8), các chất phân tích được dò tìm bằng một detectơ có độ nhạy cao (9). Tín hiệu sắc ký được ghi lại nhờ một cấu trúc ghi thường là một máy tính cá nhân (11). Khi cần thiết người ta có thể thu thập từng phần dung dịch thoát một cách tự động theo yêu cầu. II.3.4.1. Đặc điểm của sắc ký lỏng hiệu năng cao 1- Cột sắc ký Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, cột sắc ký thường được chế tạo bằng thép không gỉ có đường kính trong 2 - 6mm và dài 10 - 25cm, mặt trong đánh bóng. Cột được nạp các chất hấp phụ có kích thước hạt khoảng 3 - 10àm và thường ở dạng hình cầu. Cột loại này có khả năng tách rất cao, gấp hàng trăm lần loại cột mở bình thường. 2- Detectơ Người ta thường dùng các quang phổ kế đo quang có độ nhạy cao, nhờ đó có thể nhận dạng các hợp chất có nồng độ cực nhỏ ~10-10M trong miền ánh sáng tử ngoại đến nhìn thấy (190 - 800nm). 3- Pha tĩnh Pha tĩnh được dùng thường không hoà tan với pha động, phải bền cơ học và hoá học trong điều kiện phân tích và phải có độ chọn lọc đủ cao. Pha tĩnh có thể ở dạng rắn hoặc lỏng. Nếu pha tĩnh ở dạng rắn, ta có sắc ký lỏng-rắn còn, nếu pha tĩnh ở dạng lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng. Pha tĩnh rắn thường dùng là silicagel, nhôm oxyt hay một số chất hấp phụ biến tính Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao,người ta thường dùng các chất hấp phụ biến tính dựa trên cơ sở silicagel như: đây là những chất hấp phụ có tính chọn lọc cao. Với các chất hấp phụ dựa trên silicagel biến tính, cân bằng hấp phụ – giải hấp phụ thiết lập nhanh hơn silicagel thường. Các chất hấp phụ này thường là hạt hình cầu, có kích thước dao động trong khoảng hẹp (3 ± 0,5; 5 ± 1; 10 ± 1àm) và diện tích bề mặt từ 200 - 600m2/g. Trong các chất hấp phụ biến tính kể trên thì các chất hấp phụ biến tính bằng hydrocacbon mạch thẳng (I), (II) và hydrocacbon mạch vòng (III) thuộc nhóm chất hấp phụ không phân cực. Các chất loại này có ái lực mạnh với các hợp chất kỵ nước. II.3.4.2. ứng dụng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp sắc ký lỏng dạng cột nói chung thường được dùng để phân tích và phân tách các hợp chất hữu cơ, ví dụ: xác định các thành phần trong dầu mỏ, các hydrocacbon, tách các đồng phân cis-trans, phân tích các hợp chất khó bay hơi, các hợp chất ít bền... Sự ra đời của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép tăng hiệu quả phân tách lên hằng trăm lần, đặc biệt với các hợp chất không phân cực hoặc ít phân cực. II.3.4.3. Nghiên cứu rutin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có độ chọn lọc và chính xác cao hơn nhiều phương pháp phân tích khác, do đó đã có rất nhiều tác giả trên thế giới và trong nước áp dụng để nghiên cứu rutin. Khi phân tích định tính tiến hành so sánh mẫu nghiên cứu với mẫu chuẩn trong cùng điều kiện, còn khi phân tích định lượng thì thường tiến hành theo phương pháp đường chuẩn với việc đo chiều cao hoặc diện tích của pic sắc ký. Để nghiên cứu rutin trong nụ hoè ta cần tiến hành những công việc sau: - Bột nụ hoè, sau khi đã được sấy khô, được chiết soxhlet với methanol tuyệt đối (hoặc ethanol). Dịch chiết được đem đi loại dung môi bằng cất quay chân không, kết tủa được sấy khô, sau đó hoà tan trong methanol. - Xây dựng đường chuẩn: Pha các dung dịch chứa hàm lượng rutin chuẩn thay đổi (nếu thay đổi đều thì càng tốt, thông thường nồng độ rutin chuẩn dao động trong khoảng 0,05 - 0,5àg/àl). Tiến hành phân tích HPLC nhiều lần và tính toán diện tích pic (hoặc chiều cao pic), các giá trị trung bình của chúng được biểu diễn bằng đồ thị: diện tích pic (chiều cao pic)/nồng độ rutin. - Pha dung dịch nghiên cứu (sao cho nồng độ nằm trong khoảng thay đổi của nồng độ rutin chuẩn) với dung môi và cách pha với rutin chuẩn. Tiến hành phân tích HPLC nhiều lần để lấy giá trị trung bình. Từ giá trị trung bình này, ta xác định nồng độ rutin dựa vào đồ thị đã lập ở trên, sau đó tính toán ra hàm lượng rutin trong nụ hoè. II.3.4.4. Một số thí nghiệm phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao Như đã biết có rất nhiều tác giả đã thực hiện nghiên cứu rutin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sau đây là một số trong những thí nghiệm đó: Trên thế giới, có nhiều tác giả đã tiến hành xác định hàm lượng rutin được tách từ mạch nha như sau [12]: Detector: UV detector HPLC (Breeze 1525 Work station , Waters). Bước sóng: 350nm. Cột: X- Terra (cột xoắn X). Pha động: dung môi (axit axetic 2,4%/etanol/axetol/axetonitrit = 35/5/10 (v /v/v)): metanol = 70: 30. Tốc độ dòng: 1,0ml/phút. Thể tích mẫu: 5ml. Đầu tiên, một dung dịch rutin chuẩn (rutin chuẩn 100ppm +100% metanol) được cho vào HPLC thu được đường cong chuẩn. Dựa trên những kết quả phân tích HPLC thu được từ rutin chuẩn bằng cách sử dụng đường cong chuẩn theo nồng độ, hàm lượng của rutin chứa trong mẫu thử sẽ được xác định. ở Việt Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứu áp dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích rutin trong nụ hoè, sau đây là một ví dụ tham khảo [8]: Thiết bị HPLC: Merk & HITACHI với bơm: L – 600 Pump. Detectơ: L – 4000 UV Detectơ. Bước sóng: 254nm. Pha động: hỗn hợp methanol/ axít acetic 0,4% (tỷ lệ thể tích 60: 40). Thể tích bơm mẫu: 20àl. Tốc độ dòng: 1,0ml/phút. Nhiệt độ: 20 - 230C. Dung dịch chuẩn được pha chứa hàm lượng rutin từ 1,0 đến 10,0àg/20àl. Đường chuẩn thu được có dạng: y = 3,669x – 1,336. Trong đó: y- là nồng độ rutin (àg/20àl); x- là 1/2 diện tích pic tương ứng. 5g nụ hoè chiết soxhlet với ethanol 960 cho đến khi nhạt màu. Loại ethanol dưới áp suất giảm và hoà tan kết tủa trong 5,0ml methanol. Lọc dung dịch lấy phần dịch lọc, đem đi phân tích HPLC nhiều lần lấy giá trị trung bình. Kết quả tác giả thu được khi phân tích định lượng rutin trong nụ hoè là: 26,7%. III. Các phương pháp nghiên cứu rutin III.1. Các tiêu chuẩn đánh giá [3] III.1.1 – Mất khối lượng do làm khô Mất khối lượng do làm khô là sự mất khối lượng được biểu thị bằng phần trăm khối lượng, khi làm khô mẫu thử trong những điều kiện xác định của mỗi thành phẩm. Việc xác định mất khối lượng do làm khô nhằm biết rõ lượng nước, nước kết tinh và các chất dễ bay hơi khác trong mẫu thử. Có thể xác định mất khối lượng do làm khô bằng những cách sau đây: Sấy trong tủ sấy ở áp suất thường. Sấy ở áp suất giảm. Làm khô trong bình hút ẩm với những chất hút nước mạnh như axít sulfuric đậm đặc, phosphor pentoxyd, calci clorid khan... * Cách tiến hành: Lấy một chén có nắp mài đem sấy khô, cân xác định khối lượng của chén (trước khi cân phải để nguội trong bình hút ẩm có silicagel). Cân 0,2g mẫu thử cho vào chén, dàn mỏng thành một lớp dày không quá 5mm, sấy ở nhiệt độ 1250 ± 20C. Nếu mẫu thử bị chảy ở nhiệt độ thấp hơn 1250C thì trước khi đưa lên nhiệt độ đó, cần duy trì 1 - 2 giờ ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mẫu thử 5 - 100C. III.1.2. Độ trong và màu sắc của dung dịch 1- Mẫu thử rutin Hoà tan 0,10g mẫu thử trong 5ml ethanol tuyệt đối bằng cách đun nóng dung dịch thu được phải trong và có màu vàng. Hòa tan 0,10g mẫu thử trong 5ml dung dịch natri hydroxyd 2%, dung dịch thu được phải trong và có màu vàng da cam. 2- Độ trong của dung dịch Độ trong và độ đục của các dung dịch được xác định bằng cách so sánh các dung dịch đó với các dung dịch mẫu chuẩn. *Cách đánh giá các kết quả độ trong: Một dung dịch được coi như trong nếu như nó tương ứng với độ trong của nước hay của dung môi đã dùng trong những điều kiện thư nghiệm ở trên, hoặc nếu dung dịch đó hơi đục rất nhẹ thì cũng không được đục quá mẫu S1 đã pha loãng gấp 2 lần với nước. Cách pha dung dịch mẫu S1 như sau: NaCl 4.10-4M NaCl 2.10-6M HNO3 10% Nước AgNO3 0,1N 0ml 0,25ml 5,00ml 3,75ml 1,00ml 3- Màu sắc của dung dịch Màu sắc của các dung dịch được xác định bằng cách so sánh các dung dịch đó với các dung dịch màu mẫu, việc so sánh được tiến hành trong nhữn ống thủy tinh đáy bằng, không màu, trong suốt, giống hệt nhau và có đường kính khoảng 15 - 25mm. Chiều dày của dung dịch đem thử và dung dịch màu mẫu lấy để so sánh là 40mm. Khi có màu, quan sát dung dịch theo chiều dài của trục ống, trong ánh sáng khuếch tán, trên nền trắng. Dung dịch đem thử phải không được thẫm mầu hơn dung dịch màu mẫu quy định. Các dung dịch màu mẫu được pha chế từ dung dịch đầu và dung dịch gốc màu theo 4 ánh màu khác nhau là vàng, nâu, lục và đỏ. Cách pha chế dung dịch gốc màu vàng khá phức tạp, vả lại dung dịch mẫu rutin cho màu vàng mà mắt thường cũng nhận biết được. Do đó, khi nghiên cứu màu sắc của dung dịch rutin không cần thiết phải pha dung dịch màu mẫu. III.1.3. Diệp lục và sắc tố đỏ Tiến hành theo phương pháp quang phổ tử ngoại, cách tiến hành như sau: Hoà tan 0,20g chế phẩm trong 50ml isopropanol bằng cách đun nóng. Lọc nếu cần. III.1.4. Tro Sulfat Cân chính xác một lượng chế phẩm cho vào một chén nung bằng sứ hay bạch kim đã được nung đến khối lượng không đổi (ở cùng nhiệt độ mà chất thử có tro). Nhỏ vào chén 0,5 – 1ml axít sulfuric đậm đặc, đun nóng cẩn thận trên lưới amiăng cho đến khi không còn hơi axít bay lên, chú ý theo và