Đồ án Nghiên cứu chế biến Glucosamin từ vỏ tôm

ượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm. Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước. Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau : • Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin - chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu2+. Như vậy vi sinh vật sẽ bị chết do sự mất cân bằng liên quan đến các ion thiết yếu. • Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào. • Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 15 Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của nó. 1.5. Cấu trúc hóa học, tính chất lý hóa của glucosamin Khi thủy phân chitin trong môi trường axit HCl đậm đặc, các mối nối amid và osid đều bị phá hủy do đó thu được glucosamin 3 (là monome của chitosan). Yếu tố nồng độ axit và nhiệt độ thủy phân rất quan trọng, nếu nồng độ của axit không thích hợp thì quá trình deacetyl hóa và deosid chỉ dừng lại giới hạn nhất định, nếu nhiệt độ không thích hợp thì sản phẩm cuối cùng là glucosamin có thể bị giáng hóa thành những phân tử đơn giản hơn. Công thúc cấu tạo của glucosamin: C C C C C CH2OH O O OH OH NH2 OH CH2OHH OH NH2H HHO OHH H O HO HO NH2 OH OH 3 OHC OH NH2 OH OH OH Tên UIPAC: (3R,4R,5S,6R)-3-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,4,5-triol Tên gọi khác: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose; 2-amino-2-deoxy-β-D- glucopyranose; chitosamine; D-glucosamine; D-(+)- glucosamine. Công thức phân tử: C6H13O5N Phân tử lượng: Mglucosamin = 179,17 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 16 Hình 4 : Cấu trúc không gian của glucosamin Glucosamin là chất rắn dạng tinh thể, không màu, không mùi, điểm nóng chảy 880C, điểm phân hủy 1100C, tan được trong nước và trong methanol sôi, hơi tan trong methanol hoặc ethanol, không tan trong ether và chloroform. Một số phản ứng của glucosamin [14]: • Phản ứng tráng bạc: Giống như glucose, glucosamin cho phản ứng tráng bạc khá rõ ràng: C5H12O4NCHO + 2[Ag(NH3)]OH C5H12O4NCOONH4 + 2Ag + 3NH3 + H2O 500C • Phản ứng với Cu(OH)2. Sản phẩm có màu xanh nhạt. CHO CHNH2 CHOH CHOH CHOH CH2OH + Cu(OH)22 CHO CHNH2 CHO CHO CHOH CH2OH CHO CHNH2 CHOH CH2OH Cu H OHC OHCH + 2 H2O • Phản ứng với C6H5CH=O. Phản ứng xác nhận có mặt của NH2. Bazơ Shiff tạo ra dưới dạng keo sánh màu nâu: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 17 CHO CHNH2 CHOH CHOH CHOH CH2OH CHO CHN CHOH CHOH CHOH CH2OH + CHO HC H2SO4d 500C + H2O 1.6. Cấu trúc hóa học và tính chất vật lý một số muối của glucosamin Trong thực tế, một số dẫn xuất của glucosamin được sử dụng làm nguyên liệu làm thuốc. 1.6.1. Glucosamin hydroclorua. Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH HCl 4 Tên gọi khoa học: 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose hydrochloride; Chitosamine hydrochloride; D-glucosamine hydrochloride; D-(+)-glucosamine hydrochloride. Công thức phân tử: C6H13O5N.HCl Phân tử lượng: Mglucosamin.HCl = 215.63 Glucosamin hydroclorua là chất rắn dạng tinh thể màu trắng, không mùi. Điểm nóng chảy 190-1940C hoặc 3000C Tan được trong nước 0,1g/ml 1.6.2. Glucosamin sulfat Công thức cấu tạo: OHC OH NH2 OH OH OH H2SO4 5 Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 18 Tên gọi khoa học: 2-Amino-2-deoxy-D-glucose sulfate; D-glucosamine sulfate. Công thức phân tử: C6H13O5N.H2SO4 Phân tử lượng: Mglucosamin.H2SO4 = 277,24 1.6.3. Acetyl glucosamin Công thức cấu tạo: OHC OH NHAc OH OH OH 6 Tên gọi khoa học: 2-Acetoamido-2-deoxy-D-glucopyranose; N-acetyl-D- (+)-glucosamine; N-acetyl-β-D-glucosaminide; N-acetylchitosamine. Công thức phân tử: C8H15O6N Phân tử lượng: Macetylglucosamin = 221,21 Điểm nóng chảy: 201 - 2100C Tan được trong nước, 0,1g/ml 1.7. Dược lý và dược động học của glucosamin và muối của nó [9] Glucosamine là một aminomonosacharit được thấy trong tự nhiên, nguyên liệu để tổng hợp proteoglycan. Glucosamin kích thích tế bào sụn khớp tăng tổng hợp và trùng hợp nên cấu trúc proteoglycan bình thường. Kết quả của quá trình trùng hợp là tạo ra mucopolysaccharit, thành phần cơ bản tạo nên sụn khớp. Bình thường sụn khớp được cấu tạo chủ yếu bởi nước, collagen và proteoplycan. Glucosamin đồng thời ức chế các enzym phá hủy sụn khớp như collagenase, phospholipase A2 và giảm các gốc tự do superoxid phá hủy các tế bào sụn. Glucosamin còn có tác dụng kích thích sinh sản Hình 5 : Đau xương cột sống Hình 6 : Khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 19 mô liên kết của xương, giảm quá trình mất canxi của xương [ 9]. Khi thiếu glucosamin thì sụn đặc biệt là sụn khớp háng, đầu gối bị hỏng, cứng, tạo gai xương gây biến dạng khớp làm hạn chế vận động, dẫn đến bệnh viêm xương khớp phát triển. Do glucosamin làm tăng sản xuất chất nhầy dịch khớp nên tăng độ nhớt, khả năng bôi trơn của dịch khớp, vì thế không những làm giảm triệu chứng của thoái hóa khớp (đau, khó vận động) mà còn ngăn chặn quá trình thoái hóa khớp, ngăn chặn bệnh tiến triển [9]. Thuốc tác động vào cơ chế sinh bệnh của thoái hóa khớp, điều trị các bệnh thoái hóa xương khớp cả cấp và mãn tính, cải thiện chức năng khớp và ngăn chặn bệnh tiến triển, phục hồi cấu trúc sụn khớp. Từ tuổi 45 - 50 trở lên, bệnh có chiều hướng tăng (27% ở tuổi 60 - 70%, 45% ở tuổi 80). Đối tượng nguy cơ dễ mắc bệnh khớp nhất là người già, người béo phì, người bị chấn thương khớp, có dị tật bẩm sinh, bệnh về chuyển hoá, di truyền hoặc bị xáo trộn về kích tố [1]. Các muối của glucosamin có khả năng giải phóng và sản sinh mucopolysacharit khuếch tán tốt vào dịch khớp, phát huy tốt tác dụng chống viêm khớp. Các dẫn xuất glucosamin thông dụng được dùng phổ biến ngày nay là: • Glucosamin hydroclorua. • Glucosamin sulfat. • Acetyl glucosamin. Trong thực nghiệm trên thỏ con, người ta thấy glucosamin chỉ làm tăng thành phần các proteoglycan trong các vị trí mô sụn hư cần phải sửa chữa mà không có tác dụng tương tự trên phần sụn khớp bình thường. Những năm gần đây, glucosamin được dùng rộng rãi trong điều trị viêm khớp, thoái hóa khớp. Tuy nhiên, theo một nghiên cứu mới của tiến sĩ Ronald Hình 7 :Các vị trí khớp nối Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 20 Tallarida thuộc trường Đại Học Y khoa Temple, Philadelphia (Mỹ) cho thấy nếu sử dụng glucosamin đơn độc sẽ không có hiệu quả chống đau. Nhưng nếu kết hợp với một loại thuốc nhóm kháng viêm không steroid (NSAID) thì tác dụng chống đau, chống viêm tăng lên rất nhiều. Thực tế lâm sàng cho thấy nó mang lại nhiều ưu điểm trong điều trị hơn hẳn các thuốc NSAID. Nhược điểm của thuốc NSAID là có nhiều tác dụng phụ, còn khi sử dụng glucosamin thì lại rất ít tác dụng phụ. Một vài dị ứng không đáng kể đối với người có cơ địa quá mẫn cảm với thuốc. Trước đây glucosamin được xếp vào nhóm thuốc bảo vệ sụn (gồm có glucosamin, chondroitin và diacerin) hay thuốc tác dụng chậm với các bệnh viêm khớp. Hiện nay cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMEA) chấp nhận xếp glucosamin vào danh mục thuốc giúp cải thiện cấu trúc trong bệnh viêm khớp. Các loại khác chưa được chấp nhận vì không đáp ứng được các yếu cầu trên lâm sàng. Ở Việt Nam hiện nay cũng đang sử dụng một số loại thuốc có chứa glucosamin như : Lubrex, Lubrex-F, Glucosamin, Glusivac,…[9]. Nhưng các thuốc này chủ yếu vẫn nhập khẩu từ nước ngoài. Đã có rất nhiều nghiên cứu thử nghiệm so sánh glucosamin với các loại thuốc NSAID, cho kết quả như sau [8]: 1. Cải thiện triệu chứng viêm khớp tương đương với NSAID trong thời gian ngắn và vượt trội hơn hẳn nếu uống thuốc thời gian dài. Hình 8 : Một số thuốc glucosamin hiện đang lưu bày trên thị trường Việt Nam Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 21 2. Tính an toàn hơn hẳn với các loại đi từ NSAID. 3. Người ta dùng phối hợp glucosamine và NSAID cho kết quả tốt hơn khi dùng đơn độc NSAID trong thời gian ngắn. Sau đó ngưng sử dụng NSAID, tiếp tục sử dụng glucosamin thì tình trạng cải thiện vẫn tiếp tục được duy trì theo kiểu tuyến tính. 4. Người ta thấy nếu dùng NSAID, những ích lợi giảm triệu chứng cho bệnh nhân sẽ nhanh chóng mất đi ngay sau khi ngưng thuốc. Ngược lại, ngưng uống glucosamin tác dụng vẫn tiếp tục kéo dài trong nhiều tháng sau đó. 5. Với những bệnh nhân tuân thủ phác đồ điều trị dùng glucosamin càng dài thì lợi ích kinh tế càng lớn vì tính an toàn và hiệu quả của nó càng được phát huy. Theo các nhà nghiên cứu khi bị hấp thu vào dạ dày, muối glucosamin sulfat bị ion hóa hoàn toàn do nồng độ tương đối lớn axit HCl (pH = 1 - 3) sẵn có trong dạ dày. Như một tất yếu, các ion glucosamin và các ion sulfate bị trộn lẫn với một lượng lớn ion Cl- và ion H+. Nếu khảo sát hỗn hợp này và tách loại muối glucosamin ra thì lại nhận được 99% muối glucosamin hydroclorua do muối dạng sulfate đã bị mất đáng kể do nồng độ rất thấp so với nồng độ rất lớn axit HCl có mặt trong dạ dày. 1.8. Một số quy trình sản xuất chitin, chitosan trên thế giới và tại Việt Nam 1.8.1. Trên thế giới 1.8.1.1. Quy trình thủy nhiệt Yamasaki và Nacamichi (Nhật bản) [3] Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%). Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dịch NaOH 15N ở nhiệt độ 1500C trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên 70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 22 Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hóa chất sử dụng ít (HCl và NaOH), chitosan thu được có độ tinh khiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất. 1.8.1.2. Quy trình sản xuất chitin của Hackman [3] Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 1000C; tiếp theo được khử khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem rửa trung tính và sấy khô ở 1000C, và đem xay nhỏ. Ngâm tiếp trong dung dịch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2,5 ở nhiệt độ phòng. Sau 48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung dịch NaOH 1N với tỷ lệ w/v= 1/2,5 ở nhiệt độ 1000C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ đem ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó làm khô ta được sản phẩm dạng bột màu kem. Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ dừng lại đến sản phẩm là chitin. 1.8.1.3. Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [3] Nguyên liệu (vỏ tôm) sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ. Khử proteinn bằng NaOH 3,5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 650C, sau 2 giờ vớt ra rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2 giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl + NaCl) 0,135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu được chitin sạch đẹp. Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/4, ở nhiệt độ 850C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính, thu được chitosan. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 23 Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp, sạch do có hai bước khử sắc tố. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh, ảnh hưởng đến mạch polyme, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton có giá trị đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố trong an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện nay. 1.8.1.4. Phương pháp điều chế chitin của Capozza [17] Cân 149g nguyên liệu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy, thêm từ từ 825ml axit HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 40C trong thời gian 48 giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7. Xác định hàm lượng tro 0,4 - 0,5%. Sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với 1500ml axit fomic HCOOH 90%, để qua đêm. Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. Sản phẩm sạch sau đó được ngâm ngập trong 2 lít dung dịch NaOH 10% và đun nóng ở 90 - 1000C trong 2,5 giờ. Dung dịch được lọc và rửa sạch với nước đến pH = 7, sau đó sản phẩm được tráng rửa lại trong ethanol 960 và ether. Sấy khô ở 400C dưới áp suất giảm. Khối lượng chitin khô sạch thu được là 66g. Hiệu suất 44,3%. 1.8.2. Tại Việt Nam 1.8.2.1. Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/v=1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1,5, ở nhiệt độ 1000C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa trung tính. Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10%, sau 1 giờ đem rửa sạch và khử màu phụ bằng Na2S2O3 1,5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được chitin. Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 800C sau 24 giờ đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan. Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp. Song thời gian còn dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 24 1.8.2.2. Quy trình sản xuất chitosan ở Trung tâm cao phân tử Viện Khoa Học Việt Nam [3] Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4% ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH tiêu hao ở công đoạn sau. Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục khử khoáng lần 2 bằng HCl ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ đem di rửa trung tính và đem nấu lần 2 trong NaOH ở nhiệt độ 90 - 950C, sau 3 giờ đem rửa trung tính. Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan. Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo dài, nhiều công đoạn. 1.8.2.3. Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp thủy sản Hà Nội [3] Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24giờ vớt ra rửa trung tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2,8 ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 cũng dùng NaOH 2%, w/v=1/2,8, ở nhiệt độ 90=950C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem làm khô thu được chitin. Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Nhưng nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hóa chất xử lý cao kết hợp với thời gian xử lý dài (công đoạn khử khoáng) làm cắt mạch polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm. 1.8.2.4. Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học [3] Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước : khử khoáng, khử protein và deacetyl. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 25 Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học. Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng proteaza và deacetyl bằng enzym deacetylaza. Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v = 1/10, để ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5giờ. Rửa sạch đến pH= 7. Sau đó khử protein bằng papain 13%, tỷ lệ w/v = 1/5, pH = 5 - 5,5, ở nhiệt độ 70 - 800C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch, tẩy màu và sấy khô ở 600C thu được chitin khô, trắng. Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở 900C trong thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan sạch. Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp, trong và mềm mại. Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện khó khăn do việc tìm mua hoặc sản xuất enzym deacetylaza nên công đoạn deacetyl được thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc. 1.9. Quy trình sản xuất glucosamin hydroclorua (glu.HCl) 1.9.1. Quy trình sản xuất glu.HCl của Trần Thị Luyến [3] Để khử khoáng, vỏ tôm được ngâm trong HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ, sau đó vớt ra rửa sạch đến pH=7. Sau đó khử protein kết hợp deacetyl hóa trong NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 6,5 giờ. Tẩy màu rửa sạch, sấy khô. Chitosan được đun trong HCl 35%, tỷ lệ w/v = 1/4, ở nhiệt độ 95 - 1000C trong thời gian 4 giờ. Sau đó lọc bỏ cặn, làm lạnh 0 - 20C trong thời gian 2 giờ khi đó kết tinh sẽ xuất hiện. Lọc tách kết tinh, hòa tan trong nước cất, khử màu qua than hoạt tính, cô cạn và lại thực hiện kết tinh. Sau khi kết tinh lần cuối (khoảng 3 lần), tinh thể trắng, lọc lấy tinh thể đem rửa lại bằng cồn, sau đó sấy khô ở 50 - 600C. 1.9.2. Quy trình sản xuất glu.HCl của Đỗ Đình Rãng [14] Vỏ tôm khô, sạch, nghiền thành bột, sau đó đun sôi nguyên liệu với nước trong 2 giờ và gạn bỏ protein, sấy khô. Nguyên liêu khô đun trong HCl 5% tách khoáng, rửa sạch đến pH=7 và sấy khô. Khử hoàn toàn protein trong NaOH 5%, đun sôi. Sản phẩm rửa sạch đến pH=7, sấy khô. Chitin thu được có màu trắng Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 26 phớt hồng. Từ chitin để chuyển hóa thành glucosamin bằng cách thủy phân trong dung dịch axit HCl đậm đặc 36%, ở nhiệt độ 1000C, tẩy màu băng than hoạt tính, để kết tinh và lọc. Sấy khô, thu được tinh thể glucosamin hydroclorua trắng. Hiệu suất quá trình 51,4%. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 27 Chương II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu *Vật liệu: Vỏ tôm *Hóa chất: Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết như axit hydroclorua (HCl), natri hydroxit (NaOH), kali permanganat (KMnO4), axit oxalic (C2H2O4), oxi già (H2O2), axit acetic CH3COOH, ngoài ra còn có các dung môi khác như nước cất, methanol, ethanol… *Dụng cụ thí nghiệm: Bình tam giác, bình cầu cổ nhám, cốc thủy tinh, cân phân tích, nhiệt kế, thiết bị đo điểm nóng chảy, tủ sấy, bình hút ẩm, thiết bị gia nhiệt, khuấy từ, sinh hàn hồi lưu, dụng cụ lọc… 2.2. Phương pháp nghiên cứu 1. Sử dụng các phương pháp chiết tách hóa học để tách chiết vỏ tôm thu được chitin và deacetyl hóa chitin trong dung dịch NaOH đậm đặc thu được chitosan. 2. Tổng hợp glucosamin hydroclorua từ chitin và chitosan. 3. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng tới phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng và nồng độ tác nhân tác nhân phản ứng. 4. Kiểm tra cấu trúc của sản phẩm điều ra thông qua các loại phổ như : IR, 1H-NMR, 13C-NMR tại Viện Hóa Học – Viện Khoa Học Việt Nam. So sánh với các số liệu phổ đã công bố để xác định cấu trúc sản phẩm. - Đo phổ IR trên máy FTR – IMPACT 410 của hãng Nicolet. - Đo phổ 1H – NMR và 13C – NMR trên máy Bruker AC- 500MHz trong dung môi D2O. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 28 5. Kiểm tra, đo một số thông số như nhiệt độ nóng chảy trên máy Boetius – MK (Đức). 6. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. 7. Phưong pháp xác định hàm lượng chất không tan. a) Nguyên lý: Chitosan tan được trong axit acetic loãng, còn chitin và các tạp chất khác thi không tan. b) Tiến hành : Cân chính xác a gam chitosan hoà tan trong dung dịch axit acetic 1%, khuấy đảo 60 phút cho chitosan tan hết rồi lọc, rửa cặn bằng axit acetic loãng, sau đó rửa lại bằng nước cất và đem sấy khô đến khối lượng không đổi. Hàm lượng chất không tan được tính theo công thức: (%)100*(%) a BAX −= Trong đó: A : khối lượng phễu lọc + giấy + tạp chất sau khi sấy (g). B : khối lượng phễu lọc + giấy lọc trước khi sấy (g). a : khối lượng chitosan sử dụng (g). X : Hàm lượng chất không tan (%). 8. Phương pháp xác định hiệu suất quá trình bằng phương pháp trọng lượng. Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 29 Chương III : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1.Quy trình điều chế chitin, chitosan và glucosamin hydroclorua (glu.HCl) Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế chitin, chitosan và glu.HCl từ vỏ tôm Vỏ tôm sạch Ngâm trong HCl 10%, Ts = 12 giờ, T0 = t0 phòng Rửa trung tính Đun trong NaOH 3%, Ts = 3,5 - 4 giờ, T0 = 90 - 950C Rửa trung tính 1.Ngâm trong hỗn hợp KMnO4 + C2H2O4. Hoặc 2.Ngâm trong H2O2 1%. Chitin trắng sạch Loại Khoáng Loại Protein Rửa sạch, sấy khô ở T0 = 600C Đun trong NaOH 50%, Ts = 4 giờ, T0=110 - 1200C Chitosan Đun trong HCl 36%, Ts= 4 giờ, T0 = 90-95% Glucosamin hydroclorua Rửa trung tính, sấy khô Tẩy màu, lọc, sấy khô Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 30 3.2. Điều chế chitin từ vỏ tôm Cân 40g vỏ tôm khô cho vào cốc 1lít, sau đó cho từ từ 200ml HCl 10% vào và để ngập toàn bộ vỏ tôm, nhận thấy có hiện tượng sủi bọt mạnh chứng tỏ có phản ứng xẩy ra, kiểm tra pH=1 - 2 là được, ngâm trong khoảng 12 giờ (để qua đêm) và để ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lại khuấy để cho phản ứng xảy ra nhanh hơn (đến khi không thấy bọt, khí thoát ra, thử pH vẫn còn axit). Sau 12 giờ, vớt vỏ tôm ra và rửa lại bằng nước thường đến pH=7, sau đó rửa bằng nước cất. Lúc này vỏ tôm có màu hồng nhạt và mềm do đã được loại hết các tạp chất vô cơ. Vỏ tôm thu được để ráo bớt nước sau đó cho vào bình cầu 500ml, đồng thời cho NaOH 3% vào cho đến khi ngập hoàn toàn vỏ tôm và kiểm tra pH= 11- 12 là đạt yêu cầu. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong khoảng 3,5 - 4 giờ, lúc đun có lắp sinh hàn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài và mùi khó chịu. Sau khi phản ứng kết thúc đem sản phẩm đi rửa bằng nước thường đến pH=7, sau đó tráng lại bằng nước cất. Sản phẩm thu được có màu trắng phớt hồng. Chất màu (astaxanthin) có trong chitin được loại bỏ theo 2 phương pháp: 1. Cho 10ml dung dịch KMnO4 1% vào trong bình đựng chitin ở trên, sau đó trộn đều với nhau, để trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau 1 giờ, rửa sạch sản phẩm, nhận thấy sản phẩm có màu tím đen chứng tỏ vẫn còn nhiều KMnO4 chưa được rửa sạch. Để loại hết KMnO4 ta dùng 50ml axit Oxalic HOOC-COOH 1%, nhận thấy nếu để ở nhiệt độ phòng thì khó loại hết màu tím, ta đem đun nóng ở nhiệt độ 50 - 600C thì màu mất hoàn toàn, rửa sạch thu được sản phẩm có màu trắng đẹp. 2. Ngâm ngập chitin bằng 60ml H2O2 1%, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm sau khi ngâm tuy màu đã bớt nhiều nhưng vẫn còn thấy hơi phớt hồng, rửa sạch bằng nước, tráng lại bằng nước cất. Sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 600C, thu được chitin trắng sạch. Hiệu suất quá trình điều chế chitin được tính theo công thức sau: Đồ Án Tốt Nghiệp Nghiên cứu điều chế glucosamin từ vỏ tôm Nguyễn Đức Duy Lớp CN Hoá Dược và Hoá Chất BVTV K47 31 2 1 1 (%) *100%mH m = Trong đó : m1: số gam của vỏ tôm