Đồ án Nghiên cứu cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trên bã mía để sản xuất rượu dâu tằm

i chất mang: Chất mang tự nhiên: Tinh bột, cellulose, agar, alginate, BC ( bacterial cellulose), .. Chất mang nhân tạo: polyme từ mủ cao su, poly striren, poly acetate... Bảng 2.1. Phân loại chất mang [3]. Phân loại Tên chất mang Hữu cơ Tự nhiên Agarose, cellulose, alginate, BC (bacterial cellulose), … Nhân tạo Polyacrylamide, poly striren, poly vinyl Vô cơ Tự nhiên Seolit, silicate, … Nhân tạo Allumimium oxide ( Al2O) Các chất mang hay sử dụng: Cellulose: giá rẻ, tính cơ lý khá tốt, nhưng không đồng nhất và ổn định nên chỉ sử dụng dạng sợi và vi hạt. Agarose: ổn định, đồng nhất, dễ tạo hạt, tuy nhiên giá đắt nên khônng sử dụng trong sản xuất mà chỉ dùng trong nghiên cứu, y học. Alginate: tạo gel trong môi trường có CaCl2, để nhốt enzym và tế bào, nhưng tính chất không ổn định trong môi trường có phosphat. Dù vậy, đây là vật liệu dễ tìm, rẻ ( acid alginic có trong rong biển), có khả năng tạo gel, tạo hạt. Nên ứng dụng nhiều trong công nghiệp, cố định tế bào và enzym. Poly acrilamide: có nhiều đặc tính quý báo: bền, tính trơ cao, độ trương tốt, độ đồng nhất cao, kích thước lỗ gel có khả năng điều chỉnh, diện tích tiếp xúc lớn. Tuy nhiên giá hơi cao. Seolite: Men/2 O. Al2O3.xSiO2. yH2O. Là các tinh thể alluminosilicat, có cấu trúc không gian ba chiều, mang các lỗ xốp kích thước cỡ phân tử. Được dùng nhiều trong cố định nấm men. 2.2.3. Kỹ thuật cố định tế bào: 2.2.3.1. Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang: Phương pháp gắn tế bào lên bề mặt chất mang: Vật liệu: Thủy tinh xốp, cellulose, than, các oxit kim loại, đất hiếm, cao lanh, … Nguyên tắc thực hiện: Thông qua các liên kết cộng hóa trị( giữa nhóm amin và nhóm cacboxyl), liên kết tĩnh điện giữa những bề mặt mang điện tích, lực Vandewalls. Các phương pháp gắn này cụ thể dựa trên, những nguyên tắc sau: + Gắn tế bào bằng liên kết ion: dựa vào sự tích điện trái dấu giữa tế bào và chất mang. + Gắn tế bào bằng liên kết cộng hóa trị: có thể xảy ra 2 trường hợp: Trường hợp 1: Chất mang có chứa các nhóm có thể tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein vi sinh vật. Trường hợp 2: Phải hoạt hóa chất mang bằng cách gắn lên chất mang những chất có khả năng phản ứng . Tiếp theo đó, là tạo liên kết giữa các nhóm trên chất mang với tế bào vi sinhvật. Ưu & nhược diểm của phương pháp: Phương pháp này có thể tạo được những liên kết hóa học mạnh giữa tế bào và chất mang. Tuy nhiên, để tạo ra các mối nối đồng hóa trị này thường tốn công và mắc tiền [2][3]. Phương pháp hấp phụ: Vật liệu: Sử dụng các chất có hoạt tính bề mặt mạnh như: cellulose, agarose, polyacrylamide, chitin, nylon, thủy tinh, … Nguyên tắc thực hiện: Dựa vào cơ chế hấp phụ. Có thể xảy ra các trường hợp sau: + Thứ nhất là, chất mang có nhiều lỗ xốp, tế bào vi sinh vật bám vào các lỗ xốp và toàn bộ bề mặt chất mang. + Thứ hai, đối với chất mang không có lỗ xốp (thủy tinh) tế bào sẽ bám trên bề mặt chất mang. + Thứ ba, khi chất mang tích điện (nhựa trao dổi ion) chúng sẽ tạo liên kết ion. Phương pháp thực hiện: tế bào vi sinh vật được phối trộn với chất mang trong môi trường lỏng, khuấy trộn trong điều kiện thích hợp, sau đó rửa bã để loại bỏ phần tế bào vi sinh vật dư. Ưu & nhược điểm: Ưu điểm của phương pháp là dễ thực hiện, đơn gản. Tuy nhiên, có nhược điểm là liên kết vật lý này rất yếu nên vi sinh vật dễ tuột khỏi chất mang [2][3]. 2.2.3.2. Phương pháp nhốt tế bào vào hệ gel: Vật liệu: Có thể sửa dụng các loại sau: Ion gel: các polymer mà tế bào gắn kết với nhau tạo thành mạng lưới bằng liên kết ion. Covalent gel: polymer gắn với nhau bằng liên kết cộng hóa trị, tạo thành mạng lưới Non-covalent gel: polymer gắn với nhau thường bằng liên kết hydro. Cryogel: là cấu trúc gel polymer mới được tạo bởi phương pháp lạnh đông các tiểu phần polymer có phân tử lượng cao hay thấp Aginate là vật liệu lấy từ rong biển, có khả năng tạo gel tốt, rất tốt để bao gói enzym hay tế bào. Nguyên tắc thực hiện: Trong hệ gel cac polymer sẽ tạo thành mạng lưới bao bọc tế bào. Mạng lưới có lỗ nhỏ đến mức tế bào không thể ra ngoài, nhưng đủ lớn để cơ chất và sản phẩm chui vào. Đối với chất mang tạo liên kết ion, ta trộn chung huyền phù tế bào và hỗn hợp chất mang đa điện tích và dung dịch đa điện tích trái dấu. Với chất mang polymer như covalent: trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với các monomer rồi đem trùng hợp, hoặc trộn chung với polymer tạo liên kết giữa các sợi polymer. Gel aginate: tiến hành như sau: Đầu tiên gel alginate được đun sôi để nguội đến 30oC. Sau đó, khuấy trộn alginate và huyền phù tế bào tỷ lệ 1:1, khuấy nhẹ 30vòng / phút, trong 5’ – 10’. Tạo hình, cố định hình trong dung dịch CaCl2. Tiếp theo, rửa nước vô trùng. Cuối cùng bảo quản lạnh. Ưu & nhược điểm: Phương pháp này có ưu điểm là: hiệu suất cao, tế bào ít bị rửa trôi. Tuy nhiên, vì nằm trong khuôn gel nên không chịu được khuấy trộn. Các tế bào trong khuôn gel phân bố không đồng đều, các tế bào nằm trên bề mặt sẽ tham gia lên men. Đồng thời sản phẩm trao đổi chất làm trương nở hạt gel, gây bể vỡ [2][3]. 2.2.3.3. Phương pháp cố định không có chất mang: Vật liệu: Sử dụng các tác nhân liên kết như: glutaraldehyde, toluen, hexamethylen, … Nguyên tắc: Sử dụng các tác nhân liên kết để gắn tế bào thành một khối. Các tác nhân này phải có tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật và liên kết với thành tế bào vi sinh vật [2][3] Bảng 2.2. So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào. Tên phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Hấp phụ lê bề mặt rắn Phương pháp đơn giản, điều kiện nhẹ nhàng, đảm bảo sự sống tốt cho tế bào. Lực liên kết yếu, tế bào dễ bị tách khỏi nếu có lực cơ học, số lượng tế bào bị hấp thụ thấp. Tạo liên kết cộng hóa trị Độ bền giữa các liên kết tốt, khả năng trao đổi chất cao. Tế bào gắn vào khả năng sống thấp, hoạt lực thấp. Do đó, đòi hỏi tế bào phải có khả năng tạo liên kết vơi chất mang. Nhốt vào hệ gel Hiệu suất nhốt cao, độ bền cao, có khả năng ứng dụng với nhiều loại tế bào. Hoạt tính tế bào thấp hơn tế bào tự do, vì bị chất mang cản trở. Có thể xảy ra sự cạnh tranh giữa chất mang và cơ chất. Những sản phẩm bậc hai tích tụ có khả năng làm hư hỏng chất mang. Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng, nên tùy vào mục đích công nghệ, cách tiến hành mà chọn phương pháp cố định phù hợp. 2.3. SƠ LƯỢC VỀ NGUỒN BÃ MÍA: 2.3.1. Nguồn bã mía: Việt Nam là một đất nước nhiệt đới, rất thuận lợi cho việc phát triển mía đường. Hiện nay mía đường, được trồng trên cả nước, nhiều nhất là vùng Đồng bằng sông Cửu Long, Đông Nam Bộ, và Duyên hải Nam Trung Bộ [12]. Hình 2.7. Sản lượng và năng suất mía [12]. Theo như thống kê, sản lượng mía mỗi năm là 1,3 triệu tấn dùng trong công nghiệp, tức là có khoảng hơn 1 triệu tấn bã mía được thải ra mỗi năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất. 2.3.2. Cấu tạo hóa học bã mía: Bã mía chứa khoảng 40% cellulose, 24% hemicellulose và 25% lignin. Trong tế bào thực vật, bao gồm bã mía, có một vách có cấu tạo gồm 3 lớp ( S1, S2, S3) được bao quanh bởi lignin. Các lớp S1, S3 chứa chủ yếu là cellulose và hemicellulose vô định hình. Lớp S2 chứa cellulose kết tinh. Vùng kết tinh được định dạng bởi liên kết hydrogen theo một sắp xếp có thứ tự. Tuy nhiên, các vùng vô định hình cũng tồn tại trong cellulose. Cellulose, hemicellulose, lignin hiện diện giữa ba lớp S1, S2, S3. Sự minh họa cấu trúc thành tế bào được thể hiện qua hình 2.8. Hình 2.8. Cấu trúc của lignocellulose. Lớp S1 vàS3 chứa hemicellulose và cellulose vô định hình nhiều hơn. Lớp S2 chứa các vùng cellulose kết tinh [11]. Bảng2. 3.Thành phần hóa học của bã mía [6]. Thành phần hóa học % trọng lượng chất khô Cellulose 40% Hemicellulose 24% Glucan 40,2 Manan 0,5 Galactan 1,4 Xylan 22,5 Arabinan 2,0 Lignin 25,0 Tro 1,1 Cellulose: Cellulose chiếm 40% trong thành phần bã mía. Cellulose là một polymer mạch thẳng, gồm nhiều phân tử đường D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucosid. Liên kết glucoside giúp sợi khó cắt, và vì phân tử glucose định hướng thành dạng trans với phân tử glucose bên cạnh nên không tạo liên kết với nước, không tan trong nước. Ngoài ra có sự hình thành liên kết hydro nội phân tử, làm cellulose cứng và dai. Và chính liên kết hydro giữa các mạch cellulose cạnh nhau giúp định hình thành bó sợi song song. Cấu trúc cellulose không đồng nhất nên tồn tại vùng vô định hình và vùng kết tinh. Vùng vô định hình ít hơn vùng kết tinh. Vùng kết tinh có trật tự cao, khó bị phá hủy bởi enzym cellulase, hóa chất dung môi, đây là vùng mà các vi sợi được định hướng. Vùng vô định hình thì cấu trúc hỗn độn, nằm lẫn với vùng kết tinh, dễ bị thủy phân. Các vi sợi trong tế bào tập trung thành phiến mỏng, giữ các vi sợi là lignin và glycan liên kết ngang với nhau gọi là hemicellulose. Hình 2.9. Cấu tạo cellulose [11] Hemicellulose: Là một polusaccharide có thể tan trong kiềm và acid. Công thức phân tử (C5H8O4)n , có cấu tạo phức tạp do 50 – 200 phân tử đường tạo nên. Các đường tạo nên hemicellulose là pentose ( arabinose, xylose), hexose ( galactose, glucose, mannose). Trong đó nhiều nhất là xylose. Xylan được cấu tạo từ D – glucose liên kết với nhau bằng liên kết β – 1,4 glycoside. Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định hình. Mạch nhánh có cấu trúc đơn giản là disaccharide hoặc trisaccharide. Hemicellulose liên kết với các polysaccharide khác và lignin nhờ các nhánh này. Hình 2.10. Cấu trúc Hemicellulose [11] Lignin: Là chất kết dính các xơ sợi. Lignin là một polymer phân nhánh tìm thấy trong tế bào thực vật có khả năng chống lại sự phát triển của vi sinh vật, và tích tụ nhiều năng lượng mặt trời hơn các polysaccharide khác. Cấu trúc phức tạp, chứa chủ yếu là các vòng thơm, nên lignin có khả năng tăng tính đàn hồi, mềm dẻo như một hàng rào bảo vệ trước sự tấn công của enzym hoặc các hóa chất khác. Hình 2.11. Cấu tạo Lignin. [11] Các thành phần khác: Chất béo, parafin, axit béo, alcohol, resin. Chiếm 4% tổn khối lượng chất khô. Các chất này hình thành đầu kỵ nước và ưa nước. Do đó, có thể loại những chất này bằng dung môi phân cực mà không phá hủy cấu trúc biomass. Tùy theo nguồn lấy mẫu mà thành phần và hàm lượng các chất này khác nhau. 2.4. PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TRÊN CHẤT MANG BÃ MÍA: 2.4.1. Vật liệu: Nguyên liệu bã mía, phế phẩm của nhà máy đường, hay phế phẩm do mục đích sử dụng khác và nấm men Saccharomyces cerevisiae 2.4.2. Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: Cố định nấm men trên bã mía, dựa vào cơ chế hấp phụ. Ban đầu, phải xử lý bã mía. Vì thành phần bã mía có nhiều hợp chất phức tạp nên phải được xử lý trước bằng dung dịch NaOH 0,5M, theo phương pháp Brangik et al (2001). Mục đích quá trình xử lý: + Loại bỏ lignin (để vi sinh vật dễ xâm nhập) và các thành phần khác như chất béo, parafin, alcohol, ... để vi sinh vật không phá hủy chất mang. + Giảm bớt cấu trúc kết tinh của cellulose. + Tăng trạng thái xốp của nguyên liệu. SƠ ĐỒ TIỀN XỬ LÝ BÃ Bã mía Cắt thành 0,5 cm Sàng lọc, phân chia Tiệt trùng 121oC, 20’ Trộn NaOH 0,5M Sấy (khối lượng không đổi) Rửa Ủ, lắc 120 vòng/ phút, 24h Rửa, nước vô khuẩn Sấy Bã mía đã xử lý Sau đó, cho bã mía đã xử lý vào huyền phù nấm men, đặt vào tủ lắc ở chế độ: 30oC, 200 vòng/ phút, 24h. Cứ sau 3h kiểm tra mật độ tế bào. Nấm men sẽ phát triển ở trên bề mặt bã mía và cả ở bên trong bã. Liên kết của nấm men ở bên ngoài không bền vững như nấm men ở bên trong. Nấm men bám vào những nhu mô bên trong của bã mía và sinh trưởng và tạo những liên kết bền vững. Thêm vào đó, dinh dưỡng có sẵn bên tron nhu mô bã mía kích thích sự phát triển của tế bào nấm men, nên tế bào nấm men có khuynh hướng di chuyển vào bên trong nhu mô. Hình 2.12. Cấu trúc của chất mang bã mía.(a) Hình sợi bã mía ,(b) Hình nấm men bên trong bã mía, (c) Hình nấm men bám vào nhu mô bã mía [8] Tuy nhiên, trong quá trình lên men do hạn chế của bề mặt chất mang, nên tế bào nấm men bị rơi ra , lẫn vào môi trường. Nồng độ tế bào tự do này thay đổi tùy theo thời gian, nhiệt độ. Nhưng tế bào cố định bên trong bã mía vẫn được duy trì. Theo các kết quả nghiên cứu cho thấy, chất mang bã mía sử dụng tốt như chất mang kỹ thuật, nó có thể tồn tại đến 220 ngày liên tiếp. Hệ thống nấm men cố định, tái sử dụng đến 20 lần. (theo nghiên cứu của Lebaka Veeranjaneya Reddy & Lebaka Prasannanjaneya Reddy & Young-Jung Wee & Obulam Vijaya Sarathi Reddy) [8]. 2.5. QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT RỰƠU VANG DÂU TẰM: 2.5.1. Bản chất của quá trình lên men: Quá trình lên men rượu là quá trình lên men kỵ khí. Ở đây xuất hiện hiêu ứng Pasteur: Pastuer quan sát quá trình sống của men rượu Saccharomysces và đã phát hiện ra hiệu ứng mang tên ông. Nấm men sống trong môi trường đủ oxi chúng sinh trưởng tăng sinh khối. Nếu thiếu hoặc không có oxi, chúng chuyển sang lên men ( hô hấp kỵ khí). Khi cung cấp oxi vào môi trường thì nấm men chuyển từ trạng thái lên men sang hô hấp. Quá trình hấp thu glucose trong tế bào đang hô hấp diễn ra chậm hơn trong lên men. Pasteur đã giải thích: trong trạng thái lên men 1 phân tử glucose sinh ra ít năng lượng hơn trong hô hấp. Vì vậy trong điều kiện lên men cần nhiều glucose hơn. Vì trong điều kiện kỵ khí, chức năng tạo năng lượng ở ti thể bị giảm gần hết. Để bù đắp năng lượng, tăng cường giai đoạn đường phân. Axit pyruvic sản sinh ra ethanol và axit acetic được tạo ra trong tế bào. Chính vì thế mà trong điều kiện kỵ khí nấm men chủ yếu sinh ethanol. Quá trình lên men rượu từ glucose qua 13 bước: mỗi giai đoạn có enzym xúc tác. Phản ứng tổng quát, như sau. Trong lên men kỵ khí, nấm men sử dụng năng lượng từ quá trình đường phân. Đầu tiên, glucose đi vào chu trình đường phân tạo pyruvate. Acid pyruvic tạo acetaldehyde nhờ enzyme decacbonxylase, acetaldehyde nhận H+ tạo ethanol. Hình 2.13.a. Quá trình đường phân [7] Hình 2.13.b. Quá trình chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol [7] 2.5.2. Nấm men Saccharomyces cerevisiae: Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang cần đảm bảo một số yêu cầu sau:[2] Lên men cồn đạt hiệu suất cao. Khả năng lắng nhanh. Chịu được nhiệt độ thấp. Chịu được acid thấp. Có khả năng tạo hương. Nhìn chung, nấm men dùng trong sản xuất rượu vang cũng giống như nấm men dùng trong sản xuất bia, có khác là nó cần có khả năng tạo hương. Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được dùng nhiều trong sản xuất ethanol. Nó có nhiều ưu điểm như: hiệu suất lên men cao, chịu được độ acid thấp (của cả vi khuẩn lactic), chịu được nồng độ ethanol và chất ức chế cao, ít tạo sản phẩm phụ. Tuy niên nhược điểm của nó là khả năng tạo hương kém, có thể khắc phục nhược điểm này bằng những nguyên liệu có nồng độ hương cao. Những chủng nấm men thuần khiết thường sử dụng trong sản xuất rượu vang như: Saccharomyces vini, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces oviforis. 2.5.3. Dâu tằm: Cây dâu tằm có tên chung là Mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau như: White Mulberry ( Morus alba L.), Black Mulberry ( Morus nigra L.), American Mulberry, Red Mulberry (Morus rubra L.). Chúng có họ hàng gần với giống Korean Mulberry ( Morus australis), Himalayan Mulberry ( Morus laevigata). Trong nghiên cứu này ta sử dụng giống dâu tằm đen ở Đà Lạt. Dâu tằm đen có nguồn gốc từ Iran, trồng nhiều nhất ở vùng Địa Trung Hải, Nam châu Âu, Tây Nam châu Á, Trung Quốc. Tùy theo tùng loài mà cây dâu tằm có hình dáng khác nhau. Mùa ra hoa, cho quả thường vào tháng 5 – 7. Một cây dâu tằm trưởng thành có tuổi đời từ 100 – 200 năm. Chiều cao cây dâu tằm đen thường đạt 9 – 23 m, tuy nhiên ngày nay để thuận tiện cho việc thu hoạch chiều cao cây dâu tằm được rút ngắn, đường kính 1 – 3,5m, lá dâu hình tim , có răng cưa, dùng để nuôi tằm nhả tơ. Hình 2.14. Cây dâu tằm Đà Lạt Hình 2.15. Dâu tằm đen Đà Lạt Quả dâu tằm đường kính 15,34 – 16,25mm, dài 22,23 – 25,15mm, nặng 3,11 – 4,49g. Hàm lượng chất khô là 13,91% - 18,36%, hàm lượng đường cao xấp xỉ 10%, pH = 3,35 – 3,82. Đặc biệt màu dâu tằm có đặc điểm rất riêng, và nồng độ hương cũng rất cao, thích hợp để sản xuất vang đỏ Tuy nhiên, nguồn trái dâu tằm ở nước ta hiện nay vẫn rất hạn chế và bị lãng phí khá nhiều, vì việc trồng dâu theo truyền thống “trồng dâu, nuôi tằm”. Hơn hết, dâu tằm có nhược điểm là khó bảo quản vì thế nguồn nguyên liệu khá khó khăn. Bảng 2.4. Thành phần hóa học của dâu tằm [17] Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Năng lượng (Kcal) 73 Chất xơ (%) 0,8 Hàm lượng ẩm (%) 80,8 Chất tro (%) 0,6 Protein (%) 1,3 Fe (mg) 2,5 Chất béo(%) 0,7 P (mg) 31 Carbonhydrat (%) 16,6 Ca (mg) 42 Bảng 2.5. Hàm lượng vitamin có trong dâu tằm [17] Vitamin A 174IU Thiamine 9mg Riboflavin 184mg Nicotinic acid 0,8mg Ascorbic acid 28mg Ngoài sản xuất rượu, dâu tằm đen có nhiều chức năng chủ yếu nhờ vào khả năng chống oxy hóa của nó, sử dụng làm siro màu, mùi trong thực phẩm, làm thuốc trị bệnh nhuận tràng, và cón nhiều ứng dụng khác. 2.5.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu cho nấm men Saccharomyces cerevisiae là 28 – 32oC. Nếu nhiệt độ quá thấp vi sinh vật hoạt động kém. Nhiệt độ quá cao, sẽ kích thích những vi sinh vật khác phát triển đặc biệt là vi khuẩn lactic, đồng thời sinh ra những sản phẩm phụ như aldehide, este, giảm hiệu suất sản sinh ethanol. Nhiệt độ lên men cao khoảng 30 – 35oC tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng đường vẫn chưa sử dụng hết. Điều này rất nguy hiểm vì đường sót sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic hoạt động làm chua dịch. Nhiệt độ lên men cao dẫn đến việc tích tụ nhiều sản phẩm thứ cấp, rượu bậc cao, acetaldehyde. Nhiệt độ lên men tăng từ 10 – 25oC kéo yheo hàm lượng acetaldehyde tăng từ 1,25 – 21,5mg/l. Lên men rượu thích hợp nhất là nhiệt độ 10 - 30oC Giữa nhiệt độ và oxi lien quan chặt chẽ với nhau. Nấm men thường sinh trưởng manh trong thời gian đầu, trong thời gian này có một lượng oxi hòa tan và nhiệt độ thích hợp là 25 – 30oC. Ở vùng nhiệt đới khí hậu nóng, nhất là vào mùa hè, để đảm bảo chất lượng rượu luôn ổn định tốt nhất ta nên chọn chủng giống có khả năng chịu nhiệt tốt, lên men ở nhiệt độ cao 36 – 38oC mà khả năng lên men không đổi. pH: pH tối ưu là 3,5 -3,8. Nếu pH quá cao thì sản phẩm độ chua thấp, vi sinh vật khác dễ phát triển. Dịch trái cây pH khá thấp đối với dâu tằm khoảng pH thích hợp để lên men. Đối với men rượu thì những chủng men vang chịu được độ axit cao hơn. Trong quá trình lên men pH giảm rồi lại tăng lên. Nguyên nhân là do sự tạo thành CO2 và axit hữu cơ. Nồng độ cơ chất: Nồng độ cơ chất chính là đường, nồng độ quá cao ức chế nấm men, quá thấp không đủ cho hoạt động lên men, vi sinh vật tạp, vi khuẩn lactic phát triển. Trong môi trường có 4 nhóm thành phần chính là: nguồn cacbon (đường), nguồn nitơ, chất khoáng, chất sinh trưởng vitamin, peptit, axit amin, … Nồng độ đường thích hợp là 16 %– 18% tổng chất khô trong dung dịch. Tùy theo hàm lượng đường có sẳn mà ta tính toán lượng đường bổ sung, sao cho mỗi mẻ lượng đường đồng nhất. Cần lưu ý lượng đường chưa được sử dụng trong dịch quả vì nó sẽ tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic phát triển. Nồng độ oxy: Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí, tuy nhiên Saccharomyces cerevisiae là loài kỵ khí tùy nghi. Trong điều kiện hiếu khí, tăng sinh khối, kỵ khí lên men rượu. Thế nên, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men cần để nấm men tiếp xúc với không khí, thực hiện quá trình tăng sinh. Để quá trình lên men rượu xảy ra, cần điều kiện yếm khí nghiêm ngặt vì trong điều kiện này, hoạt động hô hấp ngừng lại, hoạt động lên men diễn ra, sinh ra năng lượng. Trong quá trình này không được để oxy lẫn vào vì oxy sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic. Nhưng sản phẩm quá trình lên men ngoài rượu còn có CO2, nên cần tạo điều kiện lên men sao cho, O2 không thể vào, CO2 không thể ra. Vì thế khi lên men rượu vang trong thùng gỗ sồi, hoặc trong thiết bị hác người ta chỉ dể môi trường chiếm 2/3 thiết bị hoặc tạo mặt nghiêng (mặt nón) để có khoảng không cho CO2 thoát lên. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt nấm men không sinh sản. Nhưng qua thực nghiệm cho thấy, nấm men sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí rồi đưa vào điều kiện kỵ khí, qua 4 – 5 thế hệ chúng sẽ tổng hợp hệ enzyme hô hấp trong điều kiện kỵ khí và sinh sản. Ở đây cần biết rằng, nấm men nuôi ở nhiệt độ cao, khả năng hòa tan oxi tốt hơn ở nhiệt độ thấp. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp, ban đầu ta có thể sục oxi và khuấy để oxi hòa tan tốt hơn, thực hiện quá trình tăng sinh. Mật độ tế bào càng cao thì thời gian lên men sẽ được rút ngắn, nồng độ O2 là 2,6 – 5,2 mg/l thì mật độ nấm men là 30 – 90 triệu /ml. Khi tăng lượng oxi lên 17mg/l thì tế bào lên dến 174triệu/ml, thời gian lên men lại được rút ngắn và acetaldehyde, rượu bậc cao, axit bay hơi, aceton, … cũng tăng lên. Do đó phải tính toán lượng khí đưa vào cho phù hợp. Nồng độ CO2: Dưới áp suất CO2 sinh trưởng nấm men không bị ảnh hưởng. Nếu loại CO2 bằng nitơ, hoặc không khí thì quá trình lên men được rút ngắn thời gian, nhưng nếu rút dần CO2 bằng bơm chân không thì lên men có mạnh hơn nhưng không nhiều. CO2 là một sản phẩm trao đổi nhưng nó cũng có khả năng kìm hãm sinh sản của nấm men. Đồng thời CO2 có tác dụng bảo quản dịch quả, rượu vang trắng, vang đỏ, … Rượu etylic: Rượu etylic tích tụ trong môi trường ở giai đoạn tăng sinh, rượu tích tụ ngày càng nhiều, làm nấm men sinh trưởng chậm, đến nồng độ nào đó làm giảm hoạt tính nấm men. Các lọai rượu khác nhau có tác dụng sát khuẩn và ức chế nấm men khác nhau. Khả năng chịu được nồng độ rượu cao do các chủng nấm men không giống nhau, dựa vào khả năng trao đổi chất của tế bào. Một chủng có khả năng sinh cồn cao nghĩa là chịu được cồn cao. Những sản phẩm thứ cấp khác: Glycerin đượctạo thành trong quá trình lên men do acetaldehyde lien kết với bisulfitnatri. Glycerin được tạo thành mạnh mẽ từ khi bắt đầu lên men. Nhờ vị ngọt và sánh như dầu glycerin đóng vai trò nhất định trong việc điều vị. Các axít bay hơi thường thấy là: axit acetic, axit propionic, acit butyric, …Các axit bay hơi được tích tụ chủ yếu trong giai đoạn dầu quá trình lên men, nhưng gần cuối giảm ( do nấm men sử dụng).Axit lactic là thường xuyên có mặt khoảng 5%. Axit sucxinic khoảng 0,1 – 0,4%. Axit malic có trong nước quả khoảng 3 – 4,5g/l, axit này có trong vang gây vị chua gắt. Các este là những hợp chất quan trọng trong việc tạo hương, trong đó etylacetate là nhiều nhất, nó có mùi hoa quả tự nhiên. Sự tạo thành những este không đồng nhất, và phức tạp tùy thuộc vào giống loài. Các rượu bậc cao được tạo thành bằng khử hoặc chuyển amin của các axit amin, tiếp đó là khử cacboxyl của cetoacid và khử aldehyde trong quá trình lên men. Các rượu bậc cao thường thấy là methanol, propanol, izopropanol, butanol, hexanol, ... Đặc biệt các rượu mạch vòng như β-phenyletylic, triptofol,tiozol, …có tác dụng làm cho hương vị vang êm dịu Ngoài ra còn có các sản phẩm khác như lipid, aceton, diacetyl, H2S, … Hệ vi sinh vật tạp nhiễm trong quá trình lên men: Các nguồn tạp nhiễm chính là: từ giống men gốc do nhân giống ( loại tạp nhiễm này khá nguy hiểm vì giống sản xuất bị nhiễm làm toàn bộ quá trình lên men bị nhiễm), từ nguyên liệu loại này có thể xử lý được, từ nước, từ không khí loại này do quá trình vệ sinh, hoặc thiết bị, nhiễm loại này gây tác hại trên diện rộng. Vi sinh vật tạp nhiễm có thể có hại hoặc vô hại. Trong số này vi khuẩn gây tác hại cho nấm men là nhiều nhất. Chúng làm thay đổi mùi vị của dịch lên men, làm giảm độ bền và làm xấu màu, hương vị của sản phẩm. Nhiễm nhẹ thì làm hiệu suất lên men giảm. Thành phần vi sinh vật tạp nhiễm thay đổi trong quá trình sản xuất. Nhóm vi khuẩn: Vi khuẩn Lactic: Lactobacillus, là trực khuẩn làm chua dịch đường, sử dụng đường trước khi nấm men sử dụng, loại này rất phổ biến và dễ nhiễm. Pediococcus, cầu khuẩn vi hiếu khí, cần CO2 trong quá trình phát triển, thường gặp là Pediococcus cerevisiae trong sản xuất rượu trái cây (vang), vì điều kiện sống gần giống với nấm men nên dễ nhiễm vào gây đục, cặn, vị chua, tuy nhiên không sống được trong môi trường 8% độ cồn. Vi khuẩn Acetic: chủng này không yêu cầu nhiều về dinh dưỡng, chúng có khả năng phát triển khi có mặt nitơ ở dạng axit amin ( glutamine, prolin, aspartate). Cúng sử dụng rượu etylic và đường tạo axit acetic, CO2 , và nước. Tuy nhiên chủng này là vi khuẩn hiếu khí, nên không phát triển được trong lên men kỵ khí, mà có thể sống trong điều kiện hiếu khí lúc đầu. Không phát triển ở 6% độ cồn. Vi khuẩn đường ruột: E.coli, không phát triển trong giai đoạn lên men, thậm chí giảm số lượng vì pH thấp. Nhưng trong giai đoạn lên men phụ và tàng trữ pH cao hơn chúng có thể phát triển gây đục sản phẩmvà làm chua sản phẩm. Flavobacterium trực khuẩn, kỵ khí tùy nghi, sống ở pH 5, và nhiệt độ 30 – 35oC, có khả năng sử dụng glucose và fructose trong dịch quả. Trong dịch lên men bị nhiễm Flavobacterium bị đục có mùi H2S nhẹ và mùi táo, pH giảm 4,4 – 4,5. Ờ pH 2 hoặc thấp hơn không thể phát triển và kết lắng Nhóm nấm men: Monilia có khả năng lên men dịch đường có thể bị nhiễm từ vỏ quả, thùng chứa. Phát triển trong vang sẽ gây ra mùi chuột. Schizosaccharomyces xuất hiện trong dịch lên men tạo được 12% độ cồn, có khả năng thủy phân hoàn toàn axit malic thành CO2