Đồ án Nghiên cứu khả năng sử dụng vỏ cà phê làm cơ chất dinh dưỡng nuôi trồng nấm bào ngư Nhật và góp phần xử lý ô nhiễm môi trường trên địa bàn trồng cà phê ở Di Linh

ta. Đáng lưu ý trong số đó, P. abalonus được nuôi trồng xuất khẩu, và nói chung các loài thuộc phân chi Coremiopleurotus có hương vị rất được ưa chuộng, được thị trường khu vực và thế giới coi trọng. Các nấm bào ngư có khả năng chuyển hoá các chất xơ sợi giàu cellulose và lignin. Đây chính là ưu điểm cơ bản của công nghệ nuôi trồng nấm bào ngư, đúng như đánh giá của Uỷ ban Cộng đồng chung châu Âu tại Hội nghị Braunschweig (Cộng hòa Liên bang Đức) năm 1986. Chính nhờ các hệ enzyme ngoại bào phong phú, nấm Bào ngư còn có nhiều khả năng chuyển hóa đặc biệt. Chỉ riêng rơm rạ, trấu, thân lõi ngô, thân cành đậu đỗ, bã mía, mùn cưa, lá, cành, cỏ,vỏ cà phê,... hàng năm ở nước ta đã lên đến hàng trăm triệu tấn. Trong đó một phần không nhỏ chỉ là đốt bỏ lấy nhiệt lượng và tro khoáng, gây nên ô nhiễm môi trường và góp phần vào biến đổi khí hậu. Nếu được xử lý phối trộn dinh dưỡng phù hợp, các nguồn phế liệu này sẽ trở thành cơ chất rất thích hợp cho nuôi trồng nấm bào ngư Nhật. Công nghệ nuôi trồng có thể ở nhiều mức độ đầu tư: các hộ, trang trại nhỏ và vừa, cụm dân cư (nông, lâm trường, tổ hợp,...) theo lao động thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp và tự động hóa. Giá thành sản xuất nấm ở nước ta vào loại rất thấp trong khu vực và trên thế giới. Vì vậy, nếu tổ chức nuôi trồng và chế biến tốt, công nghệ nấm nói chung và nấm Bào ngư nói riêng có đầy đủ khả năng trở thành ngành sản xuất quan trọng, góp phần xóa đói giảm nghèo, triệt hạ các loại cây sản ra ma túy, công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn, miền núi. Đây có lẽ là một trong những hướng tiếp cận của công nghệ sinh học hiện đại, góp phần thích đáng trong thiên niên kỷ tới - thiên niên kỷ của cơ chế phát triển sạch (CDM: Clean Development Mechanism) - một nguyên lý cơ bản xuất phát từ Hội nghị thượng đỉnh về môi trường (Công ước Sao Paolo, Brasil 1992), được hầu hết các quốc gia chuẩn thuận và xác lập các nguyên tắc chủ đạo với Công ước Kyoto (Kyoto, Japan 1997). Hội thảo Quốc tế mới đây tại Hà nội (11-12/10/1999) do Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (IAEA) và Ủy ban Năng lượng Nguyên tử Việt nam (VAEC) phối hợp tổ chức đã phân tích những nguyên tắc này và vạch ra những định hướng áp dụng ở Việt nam, nhằm vận dụng tài trợ quốc tế, mà trước hết có thể lựa chọn công nghệ điện hạt nhân trong thế kỷ tới (2015-2020). Hội nghị Quốc tế về Môi trường qui tụ đại biểu từ 150 Quốc gia đang thảo luận sôi động các công nghệ phát triển sạch tại Bonn, Cộng hòa Liên bang Đức, trong 2 tuần (10/1999). Trong đó công nghệ sinh học và công nghệ nấm nói riêng có thể là những định hướng quan trọng. Thực vậy, công nghệ dựa trên quá trình chuyển hóa bởi nấm phá gỗ (Wood - Decaying - Rotting Fungal Fermentation) về cơ bản là phân hủy từ từ các polysaccharides - thành tố cơ bản của thực vật - các phế liệu giàu xơ: lignocellulose. Nhờ đó quá trình giải phóng CO2 diễn ra tuần tự (không ồ ạt như quá trình đốt bỏ rất phổ biến ở các nước đang phát triển), khép kín chuỗi chuyển hóa của tự nhiên, đồng thời tạo ra nguồn sinh khối có giá trị cao, nghĩa là giảm bớt mức phát thải khí tạo ra hiệu ứng nhà kính. Chính vì thế mà nhóm các nhà nấm học Nhật bản thuộc Đại học Tokyo đã giành được chương trình tài trợ của Viện Nghiên cứu Môi trường toàn cầu Kyoto RITE với một Dự án phát triển công nghệ chuyển hóa nấm, mà cơ bản là nấm bào ngư Nhật. Ngoài ra, nấm bào ngư Nhật đã được thử nghiệm có hiệu quả để xử lý một số phế liệu công nghiệp chế biến latex [Lê Xuân Thám và cộng sự, 1999], công nghiệp lên men ở Việt nam. Cần lưu ý rằng công nghệ lên men ở Việt nam đã có những đầu tư khổng lồ cho hệ thống lên men lớn nhất thế giới (tổng dung tích các fermentor của Công ty Vedan Taiwan, Vũng tàu lên tới 700.000 lít), hàng tuần xả ra một lượng khổng lồ dịch thải đòi hỏi phải có công nghệ giải quyết triệt để (chứ không phải chỉ là những giải pháp tình thế như hiện nay). Các thành tựu tái lên men nấm mở ra một thời kỳ mới nghiên cứu những khả năng đặc biệt của tài nguyên nấm Bào ngư Nhật. 1.3. Thực trạng công nghệ sản xuất và chế biến nấm hiện nay của Việt Nam và thế giới 1.3.1. Tình hình trong nước Việc tổ chức sản xuất nấm bào ngư Nhật của các đơn vị chuyên kinh doanh về nấm còn nhiều thiếu sót. Chất lượng giống nấm chưa đảm bảo từ khâu sản xuất đến quá trình nuôi trồng, bảo quản, cách sử dụng. Các giống nấm bào ngư Nhật đã và đang được nuôi trồng ở Việt Nam từ nhiều nguồn giống khác nhau. Một số giống được nhập từ một số nước và vùng lãnh thổ: Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản,… Một số khác được sưu tầm trong nước, song việc chọn lọc, kiểm tra để đánh giá tiềm năng về năng suất, chất lượng của từng loại, từ đó để nhân giống đại trà phục vụ cho sản xuất hầu như chưa có đơn vị nào đảm trách. Khâu hướng dẫn kỹ thuật nuôi trồng, chế biến nấm đạt chất lượng xuất khẩu đến từng hộ gia đình không đầy đủ, do thiếu cán bộ và trình độ kỹ thuật viên non kém. Đội ngũ cán bộ nghiên cứu và làm công tác kỹ thuật về nấm được đào tạo cơ bản tại các trường đại học, có kinh nghiệm lâu năm và chuyên tâm với nghề nghiệp còn quá ít. Công tác nghiên cứu về công nghệ chọn, tạo giống, công nghệ nuôi trồng nấm bào ngư Nhật đạt năng suất cao, chi phí thấp, công nghệ bảo quản nấm đạt chất lượng ở các trung tâm nghiên cứu và cơ sở sản xuất chưa được chú trọng đúng mức. Các thiết bị, công nghệ trồng nấm nhập khẩu từ Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản,… không phù hợp với điều kiện tự nhiên, kinh tế, xã hội ở Việt Nam. Hợp đồng xuất khẩu nấm thường không đủ về số lượng, chất lượng còn thấp dẫn đến mất lòng tin với khách hàng nước ngoài. Việc tuyên truyền, phổ biến, hướng dẫn về giá trị dinh dưỡng và cách ăn nấm trên các phương tiện thông tin đại chúng cón quá ít. 1.3.2. Tình hình trên thế giới Các nườc trên thế giới hiện nay tập trung nghiên cứu sản xuất nấm bào ngư, nấm hương, nấm rơm là chủ yếu. Khu vực Bắc Mỹ và Châu Âu trồng nấm theo mô hình công nghiệp được cơ giới hóa chuyên môn rất cao với sản lượng từ 200-1000 tấn/năm. Khu vực Châu Á (Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Hản Quốc, Thái Lan…) triển khai theo mô hình trang trại vừa và nhỏ, đặc biệt là ở Trung Quốc nghề trồng nấm đã thực sự đi vào từng hộ nông dân. Hiện tại Trung Quốc là nước sản xuất nhiều nấm nhất trên thế giới. Sản lượng nấm của Trung Quốc trung bình khoảng 3 triệu tấn/năm, chiếm 60% tổng sản lượng thế giới. 1.4. Thị trường tiêu thụ nấm bào ngư Nhật Thị trường tiêu thụ nấm lớn nhất trên thế giới hiện nay là Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, các nước Châu Âu. Hằng năm các nườc này phải nhập khẩu từ Trung Quốc (dạng nấm muối và nấm đóng hộp). Tại các nước này, do khó khăn về nguồn nguyên liệu và giá công lao động rất đắt nên những người nuôi trồng nấm và kinh doanh mặt hàng này đang chuyển sang các nước chậm phát triển để mua nguyên liệu và đầu tư sản xuất, chế biến tại chỗ. Hiện nay thị trường tiêu thụ nấm bào ngư Nhật trong nước đang tăng rất mạnh. Các tỉnh miền Trung và Nam Bộ tiêu thụ trung bình 50 tấn nấm/năm. Thành phố Hồ Chí Minh và Hà Nội có những lúc cao điểm đã tiêu thụ trên 30 tấn nấm/năm. 1.5. Thuận lợi và khó khăn trong sản xuất và chế biến nấm trên địa bàn huyện Di Linh 1.5.1. Thuận lợi Nghề sản xuất và chế biến nấm trên địa bàn huyện Di Linh có những điều kiện thuận lợi như sau: - Điều kiện thiên nhiên ưu đãi như đất đai dồi dào, khí hậu, phù hợp cho nấm phát triển mạnh. Chênh lệch nhiệt độ giữa tháng nóng và lạnh không lớn lắm nên có thể sản xuất nấm quanh năm. Không khí chứa nhiều hơi nước rất thích hợp cho nấm. Độ ẩm trung bình cũng không dưới 80%. - Thị trường tiêu thụ còn rất lớn trong cũng như ngoài nước là điều kiện để cho phát triển nghề làm nấm. - Nguồn nguyên liệu dồi dào như rơm rạ được khai thác quanh năm chưa kể các phế liệu khác như cùi và thân cây bắp, bông thải, vỏ cà phê... Ngoài ra nguồn meo nấm phong phú, các nguồn nhiên liệu được tận dụng triệt để cho sản xuất – chế biến nấm. - Lực lượng lao động dồi dào trong đó lực lượng lao động phục vụ trong nghề nấm tương đối đã nắm bắt được kỹ thuật sản xuất và chế biến nấm. - Một số cơ sở hiện nay đã mạnh dạn đầu tư trang thiết bị công nghệ từng bước nâng cao được sản lượng và chất lượng các loại nấm. 1.5.2. Khó khăn - Các hộ và các cơ sở sản xuất chế biến nấm chưa có sự phối hợp chặt chẽ với nhau trong quá trình sản xuất dẫn đến thiệt hại về kinh tế chủ yếu do lợi ích mỗi bên. - Chưa hình thành được khu sản xuất và chế biến tập trung từ đó dẫn đến chi phí tăng như: Vận chuyển, vốn đầu tư cho cơ sở còn yếu. - Chưa tận dụng hết tiềm năng hiện có, chưa xây dựng được mối liên kết giữa nhà kỹ thuật, nhà sản xuất và doanh nghiệp. -Năng suất chất lượng còn thấp do sản xuất còn mang tính thủ công chưa được đầu tư nhiều thiết bị vào công nghệ sản xuất nấm. - Các biện pháp phòng dịch bệnh trong quá trình nuôi trồng nấm, các cơ sở còn chưa quan tâm tích cực dẫn đến hậu quả là khi dịch bệnh xảy ra làm giảm sản lượng, chất lượng nấm, gây thất thu cho người nuôi trồng nấm. - Meo giống là khâu quan trọng trong việc nuôi trồng nấm để đạt năng suất khi thu hoạch. Tuy hiện nay trên địa bàn thị xã có các hộ làm meo giống nhưng nhìn chung meo giống còn chưa đạt được các yêu cầu cao về chất lượng, như thuần chủng, không có mầm bệnh, khả năng kháng khuẩn để tạo ra sản phẩm nấm đạt chất lượng, sản lượng trong nuôi trồng. 1.6. Vỏ cà phê ở Di Linh là phế phẩm nông nghiệp và những vấn đề phát sinh về môi trường Di Linh là một huyện thuộc tỉnh Lâm Đồng, nằm trên cao nguyên Di Linh, ở độ cao 1.000 m so với mặt nước biển. Tên Di Linh bắt nguồn từ Djiring, theo nhiều người, đây là tên của vị chủ làng có công thành lập ra buôn này. Di Linh có tiểu vùng thời tiết, khí hậu rất thích hợp đối với các loại cây công nghiệp mà đặc biệt là cây cà phê. Di Linh là vùng đất Bazan màu mỡ, có tổng diện tích tự nhiên hơn 162.000 ha; trong đó, có 47.000 ha đất nông nghiệp trồng cà phê (sản lượng 273.000 tấn /năm) [Niên giám thống kê huyện Di Linh]. Người nông dân thường đem đốt vỏ cà phê thành tro gây ô nhiễm môi trường. So với các phế phẩm nông nghiệp khác, chất thải này phân hủy lâu hơn và gây ô nhiễm môi trường. Vỏ cà phê chiếm khoảng 40-45% trọng lượng hạt cà phê. Trong khi các nước trên thế giới đã có những công trình xử lý vỏ cà phê để sản xuất thức ăn cho gia súc gia cầm, ứng dụng lên men tạo phân bón; sản xuất hương thơm tự nhiên, nghiên cứu ứng dụng nhiệt năng... thì ở nước ta, rất ít công trình nghiên cứu đến việc ứng dụng của phế phẩm này. Vỏ cà phê chậm phân hủy do nó có hai thành phần khó phân hủy là lignin và xenlulo. Hàm lượng xenlulo trong vỏ cà phê 63,2% và lignin là 17,7%. Các phế phẩm nông nghiệp khác có thời gian phân hủy nhanh hơn vì ít hai thành phần chất này hơn [Thông tin KHCN số ra thứ bảy 31/5/2008]. Do đó vấn đề chuyển hoá và sử dụng sinh khối thực vật là một vấn đề lớn mà công nghệ sinh học đang tập trung giải quyết. Trong tương lai, khi nguồn dầu mỏ cạn kiệt thì sinh khối thực vật sẽ là nguồn cung cấp nhiên liệu và hoá chất xanh (green chemicals) chủ yếu. Gần 95% sinh khối thực vật là lignin-cellulose, trong đó có 50% xenlulo, 25% hemicellulose và 25% lignin. Lignin là một polymer có vai trò bảo vệ xenlulo và hemixenlulo khỏi sự phân huỷ của enzyme. Do đó, vấn để phân huỷ lignin là bước đầu tiên rất quan trọng nhằm sử dụng sinh khối thực vật. Trong khi đó Nấm bào ngư Nhật thuộc nhóm phá hoại gỗ. Phần lớn cơ chất dùng trồng nấm bào ngư Nhật đều chứa nguồn cellulose. Tuy nhiên, đa số trường hợp lượng xenlulo bao giờ cũng thấp hơn 50% còn lại là lignin, hemicellulose và khoáng. 1.7. Đặc điểm cấu trúc thành phần vỏ cà phê 1.7.1. Cellulose Thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật và chiếm 50% tổng lượng hydrocacbon trên trái đất. Ngoài thực vật là nguồn chủ yếu còn có trong giới động vật, nhưng số lượng rất ít. Cellulose là polysacarit liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glucozit, mức độ polyme hóa của cellulose rất cao tới 10.000 - 14.000 đơn vị glucoza/phân tử. Số lượng lớn liên kết hydro nội và ngoài phân tử làm cho phân tử cellulose có độ cứng và vững chắc. Hình 1.7: Cấu trúc phân tử cellulose Liên kết glucozit không bền với acid. Cellulose dễ bị phân hủy bởi acid và tạo thành sản phẩm phân hủy không hoàn toàn là hydro-cellulose có độ bền cơ học kém hơn cellulose nguyên thủy, còn khi thủy phân hoàn toàn thì sản phẩm tạo thành là D-glucoza Về bản chất hóa học cellulose là một rượu đa chức có phản ứng với kiềm hay kim loại kiềm tạo thành cellulose-ancolat. Nguyên tử hydro ở các ở các nhóm OH bậc một và hai trong phân tử cellulose cũng có thể bị thay thế bởi các gốc -metyl, -etyl,… tạo ra những chất có độ kết tinh và độ hòa tan cao trong nước khác nhau. Cellulose cũng bị oxy hóa bởi một số tác nhân tạo thành sản phẩm oxy hóa một phần là oxy - cellulose. Tác nhân oxy hóa chọn lọc nhất là acid iodic (HIO4), và muối của nó. Cellulose không tan trong nước, dung dịch kiềm làm trương phồng mạch Xenlulo và hòa tan một phần cellulose phân tử nhỏ. Đặc biệt cellulose dễ hòa tan trong dung dịch cupri amin hydrat (Cu(NH3)4(OH)2), và hàng loạt các dung dịch là các phức chất của đồng, niken, cadmi, kẽm...[ J.F. Kennedy,1989] 1.7.2. Lignin Lignin là một polymer gốc rượu, có cấu trúc 3 chiều rất phức tạp và có nhiệm vụ nâng đỡ cấu trúc tế bào gỗ. Sau cellulose, lignin là một polymer phong phú tự nhiên được thực vật tổng hợp và là phần lớn nguồn chất thơm đa dạng trên trái đất. Sự có mặt của lignin giúp cho tế bào thực vật cứng rắn hơn và đồng thời giúp cho thực vật tránh được sự xâm nhiễm của vi sinh vật. Lignin được tìm thấy trong vách tế bào ở dạng phức hợp với những polysaccharide như cellulose và hemicellulose, nó cũng giúp bảo vệ những polysaccharide này khỏi sự phân huỷ sinh học. Lignin được sinh tổng hợp bởi sự polymer hoá các tiền chất phenylpropanoid. Có 3 loại tiền chất được phân loại tuỳ thuộc theo số lượng nhóm methoxyl trên vòng thơm, được mô tả bằng các công thức hoá học sau: p-coumaryl alcohol (p-hydroxyphenyl) Coniferyl alcohol (guaiacyl) sinapyl alcohol (syringyl) Hình 1.8: Cấu trúc phân tử lignin Lignin gỗ mềm chứa hầu hết những đơn vị guaiacyl (1 nhóm methoxy), lignin gỗ cứng chứa số lượng cân bằng guaiacyl và syringyl (2 nhóm methoxy), các lignin khác chứa cả p-hydroxyphenyl (không còn nhóm methoxy) và 2 loại kia [Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F. Kennedy, 1989]. 1.7.3. Hemicellulose Cũng là một phần polysacarit thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose.Tuy nhiên cellulose, hemicellulose được hình thành không chỉ một đường mà nhiều đường khác nhau, thậm chí cả từ acid urnoic của chúng. Người ta gọi tên cụ thể một loại hemicellulose là dựa theo tên loại đường chủ yếu tạo nên nó. Ví dụ: xylan là một hemicellulose mà thành phần chủ yếu của nó là xyloza, manan – manoza,… Trong gỗ cây lá kim, chủ yếu hemicellulose được tạo nên từ loại đường 6 cacbon : galactam, manan… Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều thông thường không quá 150 gốc đường, được nối với nhau không chỉ bằng liên kết -1,4 mà còn bằng liên kết -1,3 và -1,6 glucozit tạo ra mạch ngắn và phân nhánh. Vì độ polyme thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở xenlulo và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemicellulose dễ tan trong dung dịch kiềm, trong nước nóng và dễ bị phân hủy bởi acid lỏng. Xylan là một hemicellulose phổ biến nhất trong tự nhiên chiếm 30% khối lượng rơm, 20 - 25% cây gỗ lá rộng, 7 - 17% cây gỗ lá kim [Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F. Kennedy, 1989]. 1.7.4. Lignin-cellulose tự nhiên là một cơ chất khó phân hủy Mỗi thành phần cấu tạo nên lignin - cellulose riêng, do bản chất các kiên kết hóa học, do mức độ polyme hóa và tính không tan trong nước là đối tượng khó phân hủy. Tính khó phân hủy lại gia tăng lên nhiều lần khi chúng liên kết với nhau và với các thành phần khác nữa thành một thể cấu trúc chặt chẽ và phức tạp. Các mạch phân tử cellulose không bao giờ tồn tại riêng lẻ mà nhờ liên kết hydro giữa phân tử tạo thành các cấu trúc lớn hơn gọi là vi sợi, dọc theo sợi có những vùng tại đó các phân tử sắp xếp song song và chặt khít gọi là vùng kết tinh, xen kẽ những vùng mà có sự sắp xếp kém trật tự và chặt chẽ là vùng vô định hình. Các vi sợi liên kết với nhau bằng cách đan xen ở những vùng vô định hình này. Các vi sợi cellulose, lignin, đan xen theo những quy tắc những quy tắc nhất định để hình thành nên cấu trúc. Với cấu trúc nhiều lớp gồm nhiều thành phần có bản chất hóa học khác nhau như vậy, lignin - cellulose có độ bền vật lý cao rất khó xâm nhập đối với các vi sinh vật và enzyme. Hơn nữa để phân hủy bất cứ thành phần nào của phức hợp một cách hiệu quả và triệt để cần phải tác động đến thành phần khác [Nguyễn Thị Thanh Kiều, 2004; J.F. Kennedy, 1989]. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị 2.1.1. Dụng cụ và trang thiết bị -Tủ cấy đơn giản (hình 2.1) - Lò hấp khử trùng (hình 2.2; 2.3; 2.4) - Ống nghiệm, pipep các loại - Bông gòn không thấm - Chai thủy tinh - Đĩa Petri - Bình tam giác - Cân điện tử - Nồi hấp - Lò hấp, tủ sấy - Kính hiển vi Hình 2.1: Tủ cấy đơn giản Hình 2.2: Cấu tạo của lò hấp khử trùng Hình 2.3: Lò hấp bịch meo giống Hình2.4: Lò hấp bịch phôi 2.1.2. Nguyên vật liệu và hoá chất - Môi truờng PGA cải tiến (môi trường phân lập và nhân giống cấp 1): nước chiết, Glucose, cao nấm men , Agar. - Nước chiết gồm có: Giá đỗ, khoai tây, chuối. - Môi trường hạt lúa (môi trường nhân giống cấp hai): Thóc, cám gạo, CaCO3. - Môi trường nuôi trồng ra quả thể: vỏ cà phê, cám gạo, vôi bột, vi lượng (KH2PO4, MgSO4…) 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát tốc độ lan, đặc điểm của tơ nấm và hình thái của nấm bào ngư Nhật trên môi trường thạch (giống cấp một) Môi trường thạch là môi trường dùng để nhân giống cấp một trong sản xuất và cũng là môi trường dùng để giữ giống, ở đây là môi trường PGA cải tiến. Công thức môi trường PGA cải tiến: - Nước chiết 1 lít. - Glucose 20g. - Cao nấm men 1g, Agar 20g. - Nước chiết gồm có: 75g giá đỗ, 300g khoai tây, 100g chuối. Môi trường PGA cải tiến được thực hiện như sau: Khoai tây, chuối, giá đỗ được gọt vỏ rửa cắt lát, cho vào nồi đun chung với giá đỗ, nước, đun sôi khoảng 20 phút, lọc lấy nước chiết và bổ sung nước cất cho đủ 1 lít. Sau đó bổ sung thêm Agar và cao nấm men, đun cho các chất này hòa tan đều vào nhau sau đó đợi nguội đến khoảng 500C (áp vào má có thể chịu được) đem rót vào trong các ống nghiệm, đĩa Petri và bình tam giác, dùng để phân lập, cấy chuyền giống nấm và khảo sát tốc độ lan tơ của nấm. Với ống nghiệm rót 1/3 chiều dài ống nghiệm, còn với bình tam giác và đĩa Petri thì đổ dày khoảng 1 cm. Không đổ môi trường vào các dụng cụ trên khi đang quá nóng vì hơi nước sẽ đọng lại trên thành, nắp sau đó rơi xuống làm ướt bề mặt thạch. Cũng không đổ môi trường khi đã nguội vì đang đổ có thể môi trường đã bị đông vón lại. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC, 1at trong 25 phút hấp xong để nguội. Việc khảo sát tốc độ lan tơ nấm và mô tả hình thái đối tượng nghiên cứu trên môi truờng thạch được tiến hành làm như sau: - Dùng dao vô trùng chọn cắt một đoạn còn non, rửa sạch bằng HgCl2 0,1%. Tiếp tục rửa lại bằng nước cất nhiều lần. Thấm khô bằng giấy bản đã khử trùng. Dùng dao lam đã khử trùng gọt một lượt mỏng (lưỡi dao chỉ gọt một đường không quay lại để tránh nhiễm trùng). Dùng tiếp các lưỡi dao gọt cho đến khi được một miếng mô nấm đã sạch lớp bẩn phía ngoài. Cắt một lớp mỏng khoảng 100µm, dùng panh cấy đưa vào ống nghiệm dựng thạch nghiêng. Đặt miếng mô thật êm trên mặt thạch. - Toàn bộ công việc trên được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để ống nghiệm đã cấy nấm trong điều kiện nhiệt độ 250C. Theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Nếu mẫu cấy bị nhiễm bệnh thì xung quanh mẫu sẽ thấy có khuẩn lạc nấm mốc lạ và khuẩn ty sẽ phát triển rất chậm. Còn mẫu cấy đạt chất lượng sẽ có khuẩn ty màu trắng phát triển nhanh và không có biểu hiện nhiễm bệnh. Sau ba ngày, các mẫu cấy đạt sẽ được cấy truyền sang ống mới. Sau ba lần cấy truyền, thu được giống nấm thuần khiết làm giống cấp một. - Các ống giống cấp một sẽ được ủ cho tơ nấm phát triển trong điều kiện nhiệt độ phòng 26 – 30oC, quá trình ủ tiến hành trong môi trường ánh sáng khuếch tán nhẹ 500-1.000 lux. - Tiến hành quan sát và ghi nhận kết quả kể từ khi sợi nấm bắt đầu bám vào bề mặt môi trường. - Vẽ biểu đồ, nhận xét kết quả. Hình 2.5: Phân lập giống từ tổ chức mô của nấm bào ngư 1. que cấy; 2. Tổ chức mô; 3. nấm bào ngư; 4. đèn cồn; 5.ống thạch nghiêng 2.2.2. Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm cuả nấm bào ngư Nhật trên môi trường hạt (giống cấp hai) Môi trường hạt lúa có bổ sung cám gạo cũng là môi trường được chọn để nhân giống cấp hai đối với nấm bào ngư Nhật. Công thức môi trường hạt: - Thóc hạt: 89% - Cám gạo: 10% - CaCO3 : 1% - Nước đủ ẩm: 60-65% Quá trình chuẩn bị môi trường hạt được tiến hành như sau: Lúa ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi hạt thóc nở bung ra thì ngừng lại. Tiếp theo cho hạt thóc đã nở bung vào chai thủy tinh rồi bổ sung thêm 10% cám gạo, 1% CaCO3. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC (2500F) trong 90 phút hấp xong để nguội. Để khảo sát tốc độ lan tơ chúng tôi tiến hành như sau: - Cấy các giống cấp một (trong môi trường thạch) vào trong chai có môi trường hạt. - Tiến hành theo dõi sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Loại bỏ các mẫu cấy xuất hiện khuẩn lạc của nấm mốc. Thu nhận các mẫu cấy có tơ nấm màu trắng phát triển bình thường để làm giống cấp hai. - Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. - Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian từ 2 ngày trở lên. - Nhận xét đặc điểm phát triển. - Xử lí số liệu vẽ biểu đồ mô tả. Hình 2.6: Nhân giống cấp hai 2.2.3. Khảo sát tốc độ lan và đặc điểm tơ nấm của nấm bào ngư Nhật trên môi trường cọng mì (giống cấp ba) Môi trường cọng mì bổ sung cám gạo là môi trường nhân giống cấp ba đối với nấm bào ngư Nhật. Công thức môi trường cọng mì: - Cọng mì: 89% - Cám gạo: 10% - CaCO3 : 1% - Nước đủ ẩm: 60-65% Quá trình chuẩn bị môi trường cọng mì được tiến hành như sau: cọng mì ngâm trong nước lạnh khoảng 12 giờ, rửa thật sạch sau đó cho vào nồi nấu đến khi cọng mì chín thì ngừng lại. Cho cọng mì vào chai thủy tinh rồi bổ sung thêm 10% cám gạo, 1 % CaCO3. Sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121,1oC trong 90 phút hấp xong để nguội. Để khảo sát tốc độ lan tơ chúng tôi tiến hành như sau: - Cấy các giống cấp hai (trong môi trường hạt) vào trong chai thủy tinh có môi trường cọng mì. - Quan sát sự phát triển của mẫu cấy trong ba ngày đầu. Loại bỏ các mẫu cấy nhiễm bệnh. Thu nhận các mẫu cấy có khuẩn ty màu trắng, phát triển bình thường làm giống cấp ba. - Nuôi ủ tơ ở nhiệt độ phòng. - Thu nhận kết quả kể từ khi tơ nấm bung ra và bám vào môi trường đến khi ăn trắng toàn bộ chai, đo ngẫu nhiên với thời gian từ 2 ngày trở đi. - Nhận xét đặc điểm phát triển. - Xử lí số liệu vẽ biểu đồ mô tả. Hình 2.7: Cấy giống từ chai giống cấp hai sang chai giống cấp ba 1.Chai giống cấp hai; 2. Chai giống cấp ba; 3. Nút bông; 4. Đèn cồn 2.2.4. Quá trình nuôi trồng khảo nghiệm 2.2.4.1. Xây dựng quy trình nuôi trồng Sau khi đã nhân các giống cấp một, cấp hai, cấp ba thành công đối tượng trên với số lượng khá nhiều. Tiếp theo sẽ cấy giống cấp ba vào môi trường cơ chất vỏ cà phê để tiến hành nuôi trồng khảo nghiệm. Quá trình nuôi trồng được tiến hành ở trang trại nấm Bảy Yết (2/73A ấp Tân Lập, xã Tân Thới Nhì, huyện Hoocmon, thành phố Hồ Chí Minh). Công thức giá thể tổng hợp: - Vỏ cà phê được loại tạp bẩn - Vôi bột 1%, - Phân DAP 0.3%, - Cám gạo 10%, - KH2PO4 0.1% , - MgSO4 0.1% - Nước bổ sung cho đến khi cơ chất đạt độ ẩm 65 - 70%. Qúa trình chuẩn bị giá thể như sau: - Vỏ cà phê cho vào bao tải 20kg và ngâm trong nước vôi 10%. Sau ba ngày, lấy bao vỏ cà phê ra và ủ vỏ cà phê thành đống phủ kín bằng bao tải khoảng 2 - 3 ngày để phân giải một phần các hợp chất khó hấp thụ như (cellulose, hemicellulose, lignin…) thành các chất dễ hấp thụ hơn như glucose, đồng thời cũng để cơ chất mềm ra, nấm dễ sử dụng. - Vỏ cà phê sẽ được sàng để loại bỏ văm, mảnh vụn. - Bổ sung dinh dưỡng với tỷ lệ như trên, tiến hành đảo trộn đủ ẩm. - Cho cơ chất vào các bịch PP hoặc PE khoảng 1,1 - 1,2 kg. Mỗi bịch kích thước là 18 x 30cm. Bịch nén xong, tiến hành làm cổ. Cổ bằng giấy bìa cứng, đường kính là 2cm, chiều cao là 4cm. Sau đó cần soi lỗ lại cho rộng để tiện khi cấy giống. Miệng bịch được nhét vải bông không thấm. Cuối cùng là dùng giấy dầu bọc miệng bịch lại. Hình 2.8: Tạo lỗ hình nón ở giữa bịch phôi 1.Vải bông; 2. Phần giấy dầu xòe ra sau khi buộc chặt, 3. Giống sau khi cấy; 4. Lỗ hình nón Vỏ cà phê sau khi đóng bịch sẽ được khử trùng ngay. - Khử trùng bịch cơ chất theo phương pháp hấp khử trùng không áp suất trong lò hấp ở 100oC trong 6 giờ, sau đó để nguội 24 giờ. - Để nguội rồi cấy giống cấp ba vào bịch. - Sau đó tiến hành chuyển bịch phôi vào trong trại ủ tơ nấm trong điều kiện ánh sáng khuếch tán nhẹ ở nhiệt độ 23-260C, tiến hành quan sát và nhận xét về quá trình phát triển của tơ nấm của