Đồ án Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi hoa mười giờ (Portulaca grandiflora.) qua trung gian mô sẹo

cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liên tục sau giai đoạn nghỉ. Người ta còn cho rằng sự phân chia tế bào trong mô sẹo xảy ra khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nó Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy. Cytokinin cũng có khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước. Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin. Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích sự tạo thành rễ bất định khi không có sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết các trường hợp, chỉ có nồng độ cytokinin thấp là có hiệu quả. Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là những cây lá rộng. Tuy nhiên, cũng có vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh phôi ở cây một lá mầm ví dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 µM đủ để ngăn cản sự sinh phôi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng có thể ngăn cản sự tạo phôi ở một số loài thực vật. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn. Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu cấy được thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành. Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin. Hầu như sự tăng trưởng chồi không xảy ra ở 30oC. Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in vitro. 2.1.9.3. Ảnh hưởng của vitamin lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Vitamin thường có chức năng xúc tác trong các phản ứng enzyme. Vitamin được xem là quan trọng cho sự phát triển của thực vật là thiamine (vitamin B1). Các vitamin khác như acid nicotinic (B3) và pyridoxine (B6) cũng có thể được thêm vào môi trường nuôi cấy bởi chúng có thể tăng cường sự đáp ứng của tế bào. Các dung dịch vitamin được bảo quản tốt nhất trong tủ lạnh và dùng 10 ml cho 1 lít môi trường. Các dung dịch vitamin sử dụng trong các thí nghiệm. Hiện nay, trong quá trình pha chế môi trường ta thường thêm các dung dịch vitamin vào môi trường trước khi hấp khử trùng. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu đặc biệt về vitamin thì ta nhận thấy rằng tốt nhất là nên lọc khử trùng các dung dịch vitamin và sau đó thêm vào môi trường đã hấp khử trùng. 2.1.9.4. Ảnh hưởng của đường lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Khi được nuôi cấy in vitro, thường thì các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp và do đó nó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt động biến dưỡng của tế bào. Trong nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần) thì lượng đường sử dụng thường thấp, ngược lại trong nuôi cấy phôi và bao phấn thì dùng đường nhiều hơn. Đường có thể bị caramel hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất amino. Sự caramel hóa xảy ra khi đường bị đun nóng, thoái biến và hình thành melanoidin, một chất sẫm màu và có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào. 2.1.10. Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô Có thể nói, khó khăn lớn nhất khi tiến hành nuôi cấy mô là phải tạo được thể nhân giống in vitro vô trùng. Có nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy. Mẫu cấy, các mảnh mô thực vật, dùng để nuôi cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng thông thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết những vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Để tăng cường hiệu quả khử trùng của các chất khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng, ngoài ra có thể dùng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần. Một số chất khử trùng thường được sử dụng như: Chlorur thủy ngân (HgCl2): đây là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0.01% - 0.05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cẩn thận khi tiếp xúc. Sodium hypochlorite NaOCl: có trong các dung dịch tẩy trắng 5 – 20%. Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mô về sau. Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: nồng độ khoảng 5 – 10%, xử lý mô cấy từ 5 – 30 phút. Ethyl hay isopropyl alcohol 70%: thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 – 5 phút. Nước oxy già (H2O2): là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc đối với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch. Khí Clo (Cl2): thường sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô. Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này. Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: những kháng sinh này có tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy. Sodium dichloroiso cyanurate (dichloroiso cyanuric acid sodium salt) (NADCC): chất này ít độc đối với mô thực vật, vốn rất dễ tổn thương bởi Ca(OCl)2 và NaOCl, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước vô trùng sau khi xử lý bằng chất này. Iso thiazolone biocide (PPM): là một loại sản phẩm được chào bán của viện Plant Cell Technology (Washington DC.) và được quảng cáo là :”… có khả năng ngăn chặn sự tạp nhiễm vi sinh trong nuôi cấy mô thực vật”. Cũng đã có những thử nghiệm và khẳng định công dụng diệt trùng của chất này nhưng nếu sử dụng với nồng độ cao sẽ gây độc cho tế bào thực vật. Nói chung việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn và nồng độ chất khử trùng thấp mà vẫn thu được mẫu cấy sạch là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng có thể phá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002). 2.2. Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan thực vật Kỹ thuật tạo mô sẹo được tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, là một trong những phương pháp đầu tiên của kỹ thuật nuôi cấy mô trong nhiều năm. Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hòa sinh trưởng thực vật,…). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp. Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin (riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin) để cho ra mô sẹo. Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan. 2.2.1. Hình thái tế bào trong sự phát sinh mô sẹo từ các mảnh mô hay cơ quan song tử diệp khi nuôi cấy in vitro Ở các cây song tử diệp, auxin gây ra tình trạng rối loạn tổ chức của sinh mô ngọn rễ, làm chậm sự kéo dài rễ. Ở thân, auxin kích thích hoạt động của tượng tầng và có thể cảm ứng sự phản phân hóa của các tế bào nhu mô vỏ trong, libe 1 và libe 2, các tia tủy và tủy để tạo nên những vùng mô phân sinh rộng lớn, còn các tế bào vỏ ngoài và các tế bào biểu bì thường chỉ phù ra mà không phân chia. Tuy nhiên, ở nồng độ thích hợp auxin có thể dẫn tới sự tạo những điểm dinh dưỡng mà trong phần lớn các trường hợp chúng có thể trở thành mô phân sinh rễ, trong vài trường hợp khác thì là mô phân sinh chồi. Nhìn chung người ta xác nhận sự tạo mô sẹo in vitro nhờ áp dụng auxin có thể do ba quá trình khác nhau: sự phản phân hóa của vài tế bào nhu mô, sự kích thích hoạt động của các mô phân sinh cấp 2 và sự xáo trộn của các mô phân sinh cấp 1, đặc biệt là các mô phân sinh rễ của các cây con. Tạo mô sẹo từ sự phản phân hóa của vài tế bào nhu mô Tế bào nhu mô vỏ của thân song tử diệp có thể tạo ra mô sẹo, nhưng thường nhất là các tế bào nhu mô ở sâu bên trong: các tế bào nhu mô của mộc và libe, các tế bào tiết và các tế bào nhu mô tủy. Auxin riêng rẽ không đủ kích thích sự phân chia của các tế bào nhu mô tủy được cô lập từ vài loại cây mà phải dùng phối hợp với một cytokinin để kích thích sự phân chia này. Những tế bào được tạo ra sẽ hợp thành một vùng nhu mô phân sinh, ở giữa vùng nhu mô này các tế bào phân chia theo mọi hướng và biểu lộ những đặc tính tế bào học của các tế bào ở tầng phát sinh. Đây có thể là nơi xảy ra hiện tượng tái phân hóa để tạo các mô dẫn truyền hay phản phân hóa dẫn đến sự thành lập những điểm sinh trưởng của thân hay rễ. Tạo mô sẹo từ sự phân chia của các tế bào tượng tầng Các tế bào tượng tầng của song tử diệp không cần phải qua giai đoạn phản phân hóa trong quá trình tạo mô sẹo khi có sự hiện diện của auxin trong môi trường nuôi cấy. Các tế bào tượng tầng của phần nhiều song tử diệp có thể phân chia trong điều kiện hoàn toàn thiếu auxin ngoại sinh, nhất là đối với các trường hợp của các loài cỏ hay dây leo. Tạo mô sẹo từ các xáo trộn của các mô phân sinh sơ khởi Dù ở đơn tử diệp hay song tử diệp, các mô sinh rễ của những cơ quan trưởng thành có tập tính giống như các mô ở cây mầm. Trong thực nghiệm, các xử lý với auxin thường không được áp dụng đối với các rễ cô lập, nhưng lại xử lý trên các cây mầm nguyên vẹn để tạo nên những khối u lớn ở mức cổ rễ. Các khối u này phát triển chủ yếu từ các sơ khởi rễ. Các rễ bị biến dạng cũng thường được thấy trong quá trình kích thích tiềm năng sinh rễ của trụ hạ diệp rễ sơ cấp. Mặt khác, ở các song tử diệp, rễ thường cho những tổ chức hình thái thứ cấp rất phát triển như các rễ củ. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, các rễ mới được thành lập, được nuôi cấy liên tục với môi trường có chứa auxin, các rễ này dính với nhau và có thể tạo nên một mô sẹo. Mô sẹo được hình thành sẽ tiếp tục phát triển qua các lần cấy chuyền trên những môi trường thích hợp. 2.2.2. Vai trò của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mô sẹo Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo dưới một tác động thích hợp nào đó và chỉ có rất ít cơ quan thực vật không thể hiện khả năng này. Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen. Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy. Vai trò của loại cơ quan thực vật thường được sử dụng để tạo mô sẹo Có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó. Các mô và các cơ quan khác nhau của một thực vật có thể được sử dụng làm vật liệu tạo mô sẹo như: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn,… Vai trò của tuổi cơ quan thực vật trong sự tạo mô sẹo Tuổi của những mảnh mô hay cơ quan có ảnh hưởng rất lớn trong khả năng tạo mô sẹo. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mới cơ quan, cũng không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, cây non hay những mảnh thân còn rất non của cây trưởng thành có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin. Vai trò của ánh sáng trong quá trình tạo mô sẹo Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo. Trong đa số trường hợp, sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng, đặc biệt đối với mẫu cấy là lá. Ví dụ: Các trường hợp tạo mô sẹo trong tối như: Lá khoai tây, Lá Vitis rupestris,… Các trường hợp tạo mô sẹo trong điều kiện chiếu sáng như: Lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum, mô củ khoai tây,… Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong thu nhận mô sẹo Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo. Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào. Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo. Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thay đổi khác nhau tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy. Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Ví dụ: Sự tạo mô sẹo từ lá Solanum melongena xảy ra trên môi trường có bổ sung nhiều loại auxin khác nhau như: NAA; 2,4 – D; 2,4,5 – T ở các nồng độ thay đổi từ 0.1 – 10 mg/l. Tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BAP 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo. Lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4 – D 3,0 mg/l; NAA 1,0 mg/l và Kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo. Vai trò của auxin trong tăng trưởng của mô sẹo: mô sẹo sau khi hình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin. Vai trò của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong phát sinh hình thái mô sẹo: hình thái của mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Qua các thí nghiệm ghi nhận được nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi. Trong đa số các trường hợp, sự hiện diện của BAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và có khả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường không có khả năng sinh phôi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. 2.2.3. Tạo mô sẹo từ lá song tử diệp Trong quá trình tạo mô sẹo từ lá song tử diệp, mô sẹo xuất hiện trước hết là ở vị trí vết cắt, kế đến xuất hiện ở vùng đáy lá, vùng giữa của lá, hay dọc theo hệ thống mạch. Mô sẹo ít được tạo ra ở vị trí ngọn lá mà thường ở đó chỉ có sự phân hóa rễ, sự phân hóa rễ cũng xảy ra ở vị trí cuống lá để ngăn chặn sự lão suy của lá. 2.2.4. Môi trường nuôi cấy mô sẹo Sự đáp ứng của những mẫu cấy, việc cung cấp tất cả các nguyên tố khác ở mức độ tối thích phụ thuộc phần lớn vào nồng độ auxin và cytokinin. Sự đáp ứng của mẫu phụ thuộc vào cả hai lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh và ngoại sinh. Auxin thường được sử dụng để khởi đầu và duy trì mô sẹo gồm IAA (10-10 ÷ 10-5M) và NAA (10-10 ÷ 10-5M). Một vài mô không thể tạo được mô sẹo khi chỉ có tác dụng của auxin mà đòi hỏi cả sự có mặt của cytokinin. Để duy trì mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự hiện diện của các amino acid khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Các amino acid thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là glycine, arginine hoặc hỗn hợp các amino acid như trong casein hydrolysate. Mô sẹo thường tăng trưởng trong môi trường đặc còn môi trường lỏng thì đôi khi cũng được sử dụng. Trước đây, người ta đã làm nhiều thí nghiệm tạo mô sẹo trên môi trường đặc có agar, gelatine hoặc silicagen. Hiện tại có những dạng xác định của acrylamide gel được dùng để làm đặc môi trường. Agar là chất làm đặc môi trường thông dụng nhất và được sử dụng với nồng độ 8 ÷ 10 g/l. Một thuận tiện khi sử dụng agar để làm đặc môi trường là khi cho vào trong nước thì nó trở thành dạng gel, sẽ lỏng ra ở 100oC và đặc lại ở 45oC. Đặc điểm này giúp cho môi trường agar ổn định trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy mẫu. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất hiện diện trong môi trường nuôi cấy và không bị phân hủy bởi enzyme. Nuôi cấy trên môi trường đặc đôi khi cũng có những bất lợi, do đó người ta cũng sử dụng môi trường lỏng để nuôi cấy. Ví dụ như khi nuôi trên môi trường đặc thì chỉ có một phần của mô sẹo tiếp xúc với môi trường nuôi cấy do đó sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ không đều do gradient các khoáng chất, sự trao đổi khí và sự tiết ra các sản phẩm có độc tính ra môi trường từ mô sẹo. Đồng thời sự phân phối ánh sáng lên toàn bộ khối mô sẹo không đều sẽ làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mô sẹo. Sự tăng trưởng của mô sẹo sẽ bị giới hạn ở mặt tiếp xúc với môi trường. Cuối cùng, mô sẹo tăng trưởng trên môi trường đặc khi được chuyển qua môi trường lỏng thì không thể tránh khỏi sự xáo trộn bên trong mô. Bên cạnh những hạn chế này thì việc tạo mô sẹo trên môi trường đặc vẫn là phương pháp được lựa chọn để duy trì việc tạo mô sẹo. Việc nuôi cấy mô sẹo ổn định trong môi trường lỏng không lắc có những thuận lợi là những hợp chất cản tiết ra từ mẫu cấy sẽ phân tán trong môi trường chứ không cố định quanh mẫu như trong môi trường đặc. Phương pháp nuôi cấy tăng trưởng này dành riêng cho sự nuôi dưỡng khoáng. Mô sẹo được đặt trên một tờ giấy lọc trong một đĩa petri trên bề mặt môi trường. Giấy lọc sẽ hút môi trường cung cấp cho mô đồng thời cũng giúp mô tiếp xúc tốt với không khí. 2.2.5. Cấy chuyển mô sẹo Mô sẹo thường được chuyển sang môi trường dinh dưỡng mới theo từng giai đoạn. Sự tăng trưởng của mẫu cấy sẽ làm tích tụ các sản phẩm thải, cạn kiệt nguồn dinh dưỡng và môi trường bị khô nước. Mẫu được nuôi ở 25oC thì nên được cấy chuyển sau mỗi 4 – 6 tuần. Hầu hết mô sẹo nuôi cấy đều đòi hỏi phải được phân cắt thường xuyên và đặt các mặt cắt úp trên môi trường mới trừ khi mô sẹo đang ở giai đoạn đầu của sự tăng trưởng. Các mẫu mô sẹo tươi tốt không được cắt ra quá nhỏ, nếu không thì nó không thể sống được khi được chuyển sang môi trường mới. Nếu như cứ nuôi mãi mà không tách ra và cấy chuyền thì mô sẹo sẽ bị hoại tử và chết. Mô sẹo có khả năng tạo phôi sẽ tăng trưởng chậm hơn mô sẹo không có khả năng tạo phôi. Đây là những mô chắc và dễ tái sinh hơn mô không sinh phôi. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa mười giờ 2.3.1. Các đặc điểm của cây hoa mười giờ Cây hoa mười giờ có nguồn gốc Nam Mỹ, nhưng được trồng rộng rãi trong các khu vực ôn đới. Tại Việt Nam hoa mười giờ được trồng trong vườn hay làm cảnh. Đây là loài cây thích hợp với những chỗ đất ráo nước và nhiều nắng. Hoa mười giờ thuộc họ rau sam là một họ trong thực vật có hoa, bên cạnh hoa mười giờ thì còn có 500 loài khác thuộc họ rau sam đều là những cây thân thảo hay cây bụi nhỏ. Theo tạp chí Birds & Blooms, ngày 1 tháng 6 năm 2006 thì "nó được đưa vào các khu vườn của châu Âu khoảng 300 năm trước và nhanh chóng thu được sự phổ biến vì các tính chất y học của nó. Cây mười giờ có khả năng chữa một số bệnh trong y học như: bệnh co thắt cơ, làm dịu vết bỏng do thuốc súng, làm mất tiếng nghiến răng, bệnh viêm họng, bệnh chàm, ghẻ, mụn nhọt,… Trong họ rau sam còn có cây rau sam trông nó gần giống với cây hoa mười giờ, cũng là loài cây dễ mọc và có rất nhiều tác dụng trong y học như làm lành vết thương, chống lão hóa, tác dụng diệt khuẩn, giúp làm gia tăng sự co bóp của tử cung, có tác dụng diệt giun móc, giun kim, điều trị bệnh goute, phòng ngừa bệnh tim mạch, trị mụn trứng cá,…; các tác dụng đó đã được nghiên cứu và thử nghiệm trên một số động vật như chuột, chó, thỏ và cũng đã thử nghiệm trên một số bệnh nhân. Mặc dù chỉ là những loài cây thân thảo rất phổ biến và dễ trồng nhưng chúng có rất nhiều tác dụng tốt đối với con người mà nhiều loài cây khác không có. Một số bài thuốc thông thường chữa bệnh bằng hoa mười giờ: Đau họng: nghiền cây và chiết dịch, lấy một lượng nhỏ dùng ngậm. Chàm, đinh nhọt: nghiền cây tươi đắp ngoài. Một số bài thuốc thông thường chữa bệnh bằng rau sam: Trừ giun kim: rau sam tươi 50g, rửa sạch, thêm ít muối, giã nát, vắt lấy nước, uống liên tiếp 3 – 5 ngày, có thể thêm ít đường cho dễ uống. Tẩy giun móc: rau sam tươi 300g giã vắt lấy nước nấu lên thêm ít muối hoặc đường, ngày uống 2 lần khi đói, uống trong 3 ngày. Trị mụn trứng cá: rau sam tươi khoảng 30 – 50g, rửa sạch, giã nhỏ lấy nước cốt để riêng, bã để riêng, rửa mặt sạch và lau khô, dùng bông y tế thấm nước cốt rau sam bôi lên mặt mụn, bôi nhiều lần trong ngày, cứ khô là bôi tiếp, vào buổi trưa hoặc tối có thể đắp xác và nước cốt rau sam lên mặt như thế không những các nốt mụn sẽ lặn dần mà còn đem lại cảm giác dễ chịu. Hình 2.1. Hoa mười giờ 2.3.1.1. Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Caryophyllales Họ: Portulacaceae Chi: Portulaca Loài: P. grandiflora 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái Hoa mười giờ hay còn được gọi là rau sam hoa lớn, nó được gọi là mười giờ vì hoa của nó thường chỉ nở từ khoảng 8 – 10 giờ sáng trong ngày. Là loại cây thân thảo, có những đặc điểm hình thái như sau: Thân: mọng nước, nhỏ, có nhiều nhánh và lớn nhanh, thân cao khoảng 10 – 15 cm. Thân có màu hồng nhạt. Lá: hình trụ, hơi dẹt, dài 1.5 – 2.0 cm, lá có màu xanh nhạt Hoa: có nhiều màu sắc sặc sỡ như đỏ, cam, hồng, trắng hay vàng. Hoa to, thường mọc ở đỉnh, có đường kính từ 3 – 4 cm. 2.3.2. Một số nghiên cứu đã được tiến hành Năm 2006, một nhóm sinh viên của Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh (nhóm sinh viên gồm Nguyễn Sĩ Tuấn, Du Ngọc Yến, Hà Bảo Ngọc, Hứa Mỹ Ngọc và Nguyễn Thanh Mai) đã nghiên cứu thành công nuôi cấy mô cây mười giờ và cho ra hoa trong ống nghiệm, đã có thể cho cây tượng nụ và ra hoa trong khoảng thời gian 1 tháng nuôi cấy và hoa có thể tươi 2 ngày kể từ khi nụ hé nở. Năm 2000, Trung tâm nghiên cứu Bhabha Atomic, Mumbai 400 085, Ấn Độ đã tiến hành nghiên cứu dùng GA3 thay đổi màu sắc và kích thước hoa mười giờ, màu hoa được thay đổi từ đỏ sang trắng hoàn toàn hoặc nửa trắng nửa đỏ tùy vào lượng GA3 bổ sung, kích thước hoa tăng từ 20 – 40%. Hình 2.2. Các loại hoa mười giờ Chương 3: Vật liệu và phương pháp Thời gian và địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2009 tại phòng thí nghiệm thực vật trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP. Hồ Chí Minh. Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa mười giờ (Portulaca grandiflora) được bán ở các nhà vườn. Nguồn mẫu được sử dụng là đốt thân hoa mười giờ được chọn để cấy tạo nguồn mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Đốt thân hoa mười giờ được chọn phải to, khỏe, tươi, thân có màu hồng nhạt. Trang thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân điện tử, máy lạnh, kệ đặt bình, đèn neon,… Dụng cụ: pince, kéo, dao cấy, chai nước biển 500ml, đĩa thủy tinh, đèn cồn, đũa thủy tinh. Các loại môi trường nuôi cấy Môi trường sử dụng là môi trường muối khoáng cơ bản của Murashige và Skoog (1962), có bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (10g/l) và các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của từng thí nghiệm mà môi trường có thể bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau. Môi trường sau khi được bổ sung đầy đủ các chất cần thiết thì được