Đồ án Nghiên cứu sản xuất nước dừa Kefir có bổ sung nha đam

. Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của kefir [29], [30], [31] ¯ Kefir là kết quả cộng sinh của vi khuẩn lactic và nấm men. Nó giống như probiotic, tập hợp của nhiều vi sinh vật sống có lợi, giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, giúp cho việc tiêu hóa dễ dàng, đặc biệt là những người không tiêu hóa được đường lactose. ¯ Kefir là một loại thực phẩm tốt, nếu sử dụng thường xuyên có thể giúp giảm bớt sự xáo trộn đường tiêu hóa, bệnh đau thắt dạ dày, viêm ruột mãn tính và những bệnh về gan, mật, thận; cân bằng sự chuyển động của ruột, làm giảm sự đầy hơi và tạo ra một hệ tiêu hóa khỏe mạnh hơn. Ngoài ra, nó còn cân bằng hệ miễn dịch, giảm tiêu chảy, giúp ăn ngon miệng, có lợi cho những người bị mất ngủ và suy nhược. ¯ Kefir có thể giúp kiểm soát mức cholesterol cao, do đó có thể ngăn chặn được những bệnh về tim mạch. ¯ Kefir chứa nhiều chất khoáng vô cơ như K, Fe, Na, Mg, Ca và các acid amin thiết yếu, giúp duy trì các chức năng sinh hóa của cơ thể. Nói chung, kefir là loại thức uống đơn giản, dễ làm, rẻ tiền mà rất có lợi cho sức khỏe. Nếu bạn muốn mình luôn khỏe mạnh, có làn da đẹp, hệ tiêu hóa tốt và ăn ngon miệng,... thì hãy sử dụng kefir. Ngoài ra, nó có thể giúp bạn sống thọ và luôn vui vẻ nhưng bạn đừng lạm dụng nó nếu không bạn sẽ bị dư acid ở dạ dày. 2.4. Giới thiệu một số vi sinh vật trong hạt kefir 2.4.1. Vi khuẩn lactic [1], [16], [17], [18] Ø Vi khuẩn lactic thường là vi khuẩn gram dương, không tạo bào tử, hầu hết không di động. Ø Hô hấp hiếu khí, kỵ khí hoặc tùy tiện. Chúng ít hay không phân giải protein, không có cytochrome và catalase, không phân giải H2O2. Ø Vi khuẩn lactic có loài lên men đồng hình và có loài lên men dị hình. Lên men đồng hình thì sản phẩm tạo thành chỉ có acid lactic. Nó có thể tạo được trên 85% acid lactic. Lên men dị hình ngoài sản phẩm là acid lactic thì còn có các sản phẩm phụ khác. Nó sản sinh được khoảng 50% acid lactic, 25% cồn,… STREPCOCCUS Từ Strepcoccus bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp. Từ Streptose nghĩa là mềm dẻo và Kokkos nghĩa là hạt – do đó Strepcoccus có nghĩa là một chuỗi hạt mềm dẻo. Streptococcus thermophilus Nó là tế bào hình cầu hoặc hình trứng, đường kính 0.7-0.9mm, không chuyển động được, thường kết thành chuỗi ngắn, thuộc loại vi khuẩn gram dương, phát triển thuận lợi ở nhiệt độ 40-45oC và pH=5.8-6.0. Chúng sẽ bị tiêu diệt ở nhiệt độ trên 53oC và dưới 20oC. Streptococcus thermophilus là loài rất nhạy cảm với muối, không phát triển được trong môi trường chứa 2% NaCl và 0.01% xanh metylen. Nó có khả năng lên men glucose, fructose, saccharose..., phân giải tinh bột ở môi trường thích hợp nhưng không phân giải gelatin và esculin. Khi lên men thường tạo một lượng nhỏ acetone và các chất tạo hương. Chúng là những loài tất nhạy cảm với các chất kháng sinh, dễ dàng bị ngăn chặn bởi 0.01 mg penicillin hay 5mg streptomycin/ml. Streptococcus lactis Thuộc loài vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, lên men được glucose, lactose, galactose, maltose, dextrin, không lên men được saccharose. Phát triển tốt ở nhiệt độ 30 – 350C, độ chua tạo ra khoảng 110 - 1200T. Streptococcus cremoris Thường tạo thành chuỗi dài, phát triển tốt ở 20 – 250C, lên men lactose,glucose thành acid lactic nhưng không lên men saccharose, maltose, dextrin. LEUCONOSTOC Loại này ban đầu được biết là Betacoccus và tên hiện nay xuất phát từ tiếng Hy lạp. Leucus nghĩa là không màu và nostoc nghĩa là giống có vỏ nang màu xanh da trời. Leuconostoc là tế bào hình cầu tạo thành từng cặp hay chuỗi và có thể xem là Streptococcus lên men dị hình. Chúng tạo ra acid acetic, ethanol, CO2 và acid lactic từ lên men carbonhydrate (thường là glucose). Chúng là loại vi khuẩn đặc trưng tạo hương cho sản phẩm. Leuconostoc dextranicum Leuconostoc dextranicum là vi khuẩn gram dương, đường kính từ 0.6-1m. Nó phát triển tốt ở nhiệt độ 25-300C và phát triển chậm ở 80C, ở 450C ngừng phát triển, không tồn tại khi thanh trùng, rất nhạy cảm với chất kháng sinh penicillin. LACTOBACILLUS Từ này xuất phát từ tiếng Latinh, lac nghĩa là sữa và bacillum nghĩa là hình que. Nó có dạng hình que, dài, nhỏ, thường lên men lactic đồng hình. Lactobacillus acidophilus Nó là trực khuẩn, kích thước trung bình 0.6-0.9 x1.5-6 mm. Khi trẻ là vi khuẩn gram dương, về già trở thành gram âm, phát triển tốt ở 37-40oC, không phát triển ở 4% muối. Lactobacillus acidophilus là một một chuỗi, dài chỉ kết hạt khi nhuộm với xanh methylene. Nó có thể lên men glucose, maltose, saccharose, và lactose, lên men đồng hình tạo sản phẩm chính là acid lactic. Lactobacillus brevis Là trực khuẩn gram dương, kích thước rộng 0.7-1.0m, dài 2.0-4.0m. Chúng có thể lên men các loại đường như arbinose, xylose, glucose, fructose, maltose, nhiệt độ phát triển tối đa là 30oC. Lactobacillus delbrueckii Là vi khuẩn gram dương, không di động, thuộc trực khuẩn dài, kích thước 0.5-0.8mm, 2.0-9.0mm. Nó có khả năng lên men được các loại đường glucose, maltose, fructose, galactose, dextrin; Và không có khả năng lên men xylose, arabinose, rhamnose, lactose, raffinose, mannital. Lactobacillus helveticus Là trực khuẩn, có kích thước 0.7-0.9mm; 2.0-6.0mm, nhiệt độ phát triển cuả vi khuẩn này là 40-42oC. tạo độ chua đến 200-3000T. Nó có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. 2.4.2. Nấm men [1], [4], [5], [7], [12], [18]. Nấm men thuộc đơn bào, tế bào có hình elip hoặc hình trứng, đường kính 10-15mm, không di chuyển được. Một vài loài nấm men tạo bào tử túi (thường 4 tế bào), chúng sinh sản chủ yếu bằng cách nẩy chồi. Nấm men phát triển tốt ở 24-40oC và có thể chịu được acid cao, pH=3.5. Chúng oxi hóa và lên men mạnh mẽ nguồn nguyên liệu carbonhydate và acid hữu cơ. Nhìn chung, chúng không phân giải protein, một vài loài có thể phân giải lipid. Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5-14 mm, sinh sản bằng cách tạo chồi hay bào tử. Nó có khả năng lên men rất nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, galactose, raffinose. Loài này có nhiệt độ lên men thích hợp 28-320C, chịu được độ acid cao. Saccharomyces fragitis Nó có hình trứng hay hình thuôn dài, đường kính 1.8-5.6mm, được đặc trưng bởi khả năng tạo cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích là 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC và không bị tiêu diệt khi thanh trùng. Candida pseudotropicalis var lactose Nó là tế bào hình trứng, dài từ 7-15mm, lên men tạo ra cồn và CO2. Nhiệt độ tối thích 37oC, không phát triển ở 5oC hay 43oC. Nó không sinh bào tử, về mặt sinh hóa Candida oxy hóa tốt hơn lên men và được xem là nấm mốc hơn nấm men. Tế bào có hình hình trụ tròn và sinh sản bằng cách nhân đôi. Tế bào con được tách ra từ sự phân chia tế bào mẹ. Loài vi sinh vật này oxy hóa acid lactic thành CO2 và H2O . 2.4.3. Vi khuẩn Acetobacter [18] Acetobacter aceti Vi khuẩn này có hình dạng giống như vi khuẩn hình que khác, nhưng có kích thước rất ngắn, không tạo được bào tử. Nó chịu được nồng độ rượu 11%, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động sống của vi khuẩn là 34oC. 2.5. Một số quá trình lên men chính tạo nên sản phẩm 2.5.1. Lên men lactic [4] Trong công nghệ vi sinh vật, nhìn chung các vi khuẩn lactic đồng hình luôn chiếm vai trò ưu thế. Tuy nhiên, trong công nghệ sản xuất một số sản phẩm lên men truyền thống như phômai, kefir … các vi khuẩn lactic dị hình đôi khi vẫn được sử dụng nhằm mục đích đa dạng hóa các chỉ tiêu về mùi, vị và cấu trúc cho sản phẩm. Đối với nhóm vi khuẩn kactic đồng hình như giống Lactococcus, các loài Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis,…chu trình đường phân là con đường chính chuyển hóa glucose thành acid lactic. Acid lactic là sản phẩm chủ lực trong quá trình lên men lactic đồng hình. Phương trình tổng quát quá trình lên men lactic đồng hình: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi 2CH3-CH-COOH + 2ATP OH Các vi khuẩn lactic dị hình như giống Leuconostoc do không có một số enzyme của chu trình đường phân nên chúng chuyển hóa glucose giai đoạn đầu theo chu trình pentose-phosphate và tạo ra sản phẩm trung gian là xylulose-5-P. Chất này sẽ được chuyển hóa tiếp thành glyceradehyde-3-P rồi tiếp tục đi theo giai đoạn cuối của chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic rồi acid lactic như trong quá trình lên men đồng hình. Theo một con đường trao đổi chất khác, xylulose-5-P sẽ được chuyển hóa thành acetyl-P và sau đó là thành ethanol. Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác. Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện hàng trăm hợp chất hóa học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất thấp (vài ppm hoặc ít hơn). Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic. Đáng chú ý nhất là diacetyl (CH3COCOCH3) và acetaldehyde (CH3CHO), đây là những hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men . Quá trình sinh tổng hợp diacetyl liên quan đến sự chuyển hóa citrate. Citrate oxaloacetate acetate CO2 pyruvate CO2 acetaldehyde-TPP Acetyl-CoA CoASH + TPP diacetyl acetoin 2,3 butanediol acetolactate CO2 NAD(P)H NAD(P)H NAD(P+) NAD(P+) Hình 2.8: Sinh tổng hợp các chất tạo hương từ citrate [4] (Cogan và Fordan, 1994) Ở giai đoạn đầu của quá trình lên men, diacetyl được tổng hợp. Hàm lượng diacetyl trong môi trường sẽ tăng dần rồi sau đó sẽ giảm dần vào giai đoạn cuối, đặc biệt khi hàm lượng citrate giảm dần. Một phần diacetyl chuyển hóa thành acetoin và 2,3 butanediol. Acetaldehyde được tổng hợp từ các sản phẩm của quá trình chuyển hóa glucose và một số acid amin. Nhiều loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp acetaldehyde. Ngược lại, một số chủng thuộc giống Leuconostoc lại có khả năng sử dụng và chuyển hóa acetaldehyde. Đây là hợp chất quan trọng quyết định đến mùi vị đặc trưng cho sản phẩm lên men. Tỷ lệ hàm lượng diacetyl và acetaldehyde ảnh hưởng đến giá trị cảm quan của sản phẩm. Tỷ lệ này phụ thuộc vào thành phần các vi sinh vật sử dụng trong tổ hợp giống và các thông số kĩ thuật của quá trình lên men như nhiệt độ, pH đầu, lượng giống cấy... Glucose Glucose 6-phosphate 6-phosphogluconate Xylose-5-phosphate Acetyl-CoA Fructose 1,6-diphosphate Pyruvate Acetate Acetaldehyde Alanin Lysine Serine Hình 2.9: Sinh tổng hợp acetaldehyde ở một số vi khuẩn lactic ưa nhiệt [4] (Varnam và Sutherland, 1994) Glucose Glucose-6-P Fructose 6P Fructose-1,6-DP Dihydroxylacetone-P FDP aldolase Glyceraldehyde-3-P 1,3-diphosphoglycerate 3-phosphoglycerate 2- phosphoglycerate Phosphoenolpyruvate Pyruvate Lactate 6 phosphogluconate 2 ketone-6-phosphogluconate Ribulose 5-P CO2 Xylulose 5-P Acetyl-P Acetyl-CoA Acetaldehyde Ethanlol Hình 2.10: Cơ chế lên men lactic đồng hình và dị hình của vi khuẩn [4] 2.5.2. Lên men ethanol [4] Trong công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men, quá trình lên men ethanol được thực hiện chủ yếu bởi các nấm men thuộc giống Saccharomyces và Kluyveromyces. Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hóa thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hóa thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glyxerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men. Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid. C6H12O6 + 2ADP +2Pi 2 C2H5OH + 2CO2 + 2ATP Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men. Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và ester. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990). Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Crebs nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic... Glucose Glucose-6-P Fructose 6P Fructose-1,6-DP Dihydroxylacetone-P FDP aldolase Glyceraldehyde-3-P 1,3-diphosphoglycerate 3-phosphoglycerate 2- phosphoglycerate Phosphoenolpyruvate Pyruvate Acetyl P Acetyl CoA Acetaldehyde Ethanol Hình 2.11: Cơ chế lên men rượu của nấm men [4] 2.6. Qui trình sản xuất 2.6.1. Qui trình sản xuất men giống kefir Nước dừa Thanh trùng Cấy giống Lên men Lọc thô Men giống Kefir Làm nguội Hạt kefir 7% Bảo quản Hạt kefir Hình 2.12: Qui trình sản xuất men giống kefir 2.6.2. Thuyết minh qui trình ¯ Môi trường sản xuất giống Chọn dừa non làm môi trường sản xuất vì trái cho nước ngọt và chứa nhiều chất dinh dưỡng hơn nước dừa già. Ta chọn những trái tươi (cho phép trong 1 tuần sau khi chặt khỏi cây), những trái có độ tuổi 6-7 tháng. Sau khi lấy nước dừa, ta đem đi lọc thô để loại tạp chất làm cho nước trong hơn. ¯ Thanh trùng Sau khi lọc thô xong, ta đem nước dừa đi thanh trùng ở 90-950C, trong thời gian 20 phút. Thanh trùng giúp giảm bớt sự có mặt của vi sinh vật, ức chế hoạt động của enzyme. Sau khi gia nhiệt, ta làm lạnh nhanh để giảm nhiệt độ xuống 20-250C, chuẩn bị cho quá trình cấy giống. ¯ Lên men Sử dụng hạt kefir với lượng ban đầu 7% theo khối lượng, quá trình nhân giống cũng được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Do hạt kefir có kích thước lớn, chúng thường bị chìm xuống dưới đáy nên cần phải khuấy trộn môi trường để quá trình lên men xảy ra nhanh. Quá trình nhân giống kết thúc khi pH môi trường giảm xuống trong khoảng 3.8-4.0. ¯ Men giống Khi đạt pH theo yêu cầu, canh trường được lọc. Dịch thu được sau quá trình lọc thô chứa các vi khuẩn lactic và nấm men được sử dụng để cấy vào nước dừa nguyên liệu để sản xuất kefir. Nếu sau quá trình nhân giống như trên vẫn chưa đủ thể tích giống cần dùng, ta tiếp tục nhân giống thêm một cấp nữa. Khi đó ta sẽ sử dụng lượng giống thu được từ qui trình trên để cấy tiếp vào môi trường nước dừa đã thanh trùng. ¯ Bảo quản Sau khi lọc, các hạt kefir được đưa đi xử lý bằng cách rửa chúng trong nước vô trùng ở nhiệt độ thấp (6-100C) để loại bỏ các tạp chất bám trên bề mặt hạt. Hạt kefir đã qua rửa sạch được đem bảo quản trong nước vô trùng hoặc dung dịch NaCl 0.9%. Khi cần nhân giống cho mẻ sản xuất tiếp theo, người ta sẽ sử dụng tiếp các hạt kefir trên để nhân giống. 2.6.3. Qui trình chế biến kefir Nước dừa Thanh trùng Cấy giống Men giống kefir Lên men Ủ lạnh Làm lạnh Phối chế Nha đam Đường Bảo quản Đóng chai Hình 2.13: Qui trình chế biến kefir 2.6.4. Thuyết minh qui trình ¯ Nguyên liệu Nước dừa Sau khi thu mua trái dừa về, ta chỉ lấy nước dừa để làm nguyên liệu chế biến. Để loại bỏ tạp chất và làm nước trong hơn, ta tiến hành lọc thô nguyên liệu. Nha đam Khi mua lá về rửa sạch, sau đó gọt sạch vỏ để lấy phần thịt bên trong, rồi ngâm trong giấm đã pha loãng để loại bớt độ nhớt, vị đắng, giảm bớt mùi khó chịu của nha đam. Sau khi thấy thịt nha đam hết nhớt thì vớt ra, rửa sạch với nước và để ráo. Ta đem phần thịt nha đam này đi xay, lưu ý là không xay nhuyễn. Sau đó đun sôi với agar, đường khoảng 10 phút, rồi đổ vào hộp hình chữ nhật cho đông lại, cắt nhỏ thành khối vuông có kích thước 4mm, đem để vào tủ mát bảo quản. ¯ Thanh trùng Sau khi lọc thô, nước dừa đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 90-950C, trong 20 phút . Thanh trùng giúp loại bớt các vi sinh vật và ức chế hoạt động của enzyme trong nước dừa. Sau đó ta làm lạnh xuống còn 20-250C, để chuẩn bị cấy giống. ¯ Lên men Cấy 7% men giống theo thể tích, lên men ở nhiệt độ phòng (25 -300C), thời gian khoảng 24-48 giờ. Trong thời gian lên men, cần thường xuyên đảo trộn để quá trình lên men xảy ra nhanh hơn. Lúc này, các vi khuẩn lactic cùng với nấm men sẽ chuyển đường thành acid lactic, ethanol, khí CO2,… và các chất tạo hương khác như diacetyl, aldehyde, acid fomic,…. Ngoài ra còn có quá trình thủy phân protein. Quá trình lên men kết thúc khi pH đạt 3.8 - 4.0. ¯ Ủ lạnh Sau khi pH đạt 3.8- 4.0, ta đem đi ủ ở nhiệt độ 10-150C. Trong thời gian này, các vi khuẩn lactic phát triển kém và giảm lên men tạo acid lactic. Lúc này, nấm men hoạt động mạnh và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Mặt khác, quá trình ủ lạnh giúp lắng cặn, tạo độ trong cho sản phẩm. ¯ Phối chế Sau khi ủ xong, để giảm độ nhớt và tăng tính đa dạng cho sản phẩm, ta phối thêm nha đam và đường cát vào. ¯ Bảo quản Sản phẩm được bảo quản ở 4-60C, để hạn chế hoạt động của vi sinh vật, các quá trình biến đổi hóa lý và giữ được chất lượng, mùi vị của sản phẩm. Sử dụng sản phẩm 1-3 tuần. Hình 2.14: Nguyên liệu sử dụng Hình 2.15: Dụng cụ lọc hạt kefir [18] CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian tiến hành thí nghiệm Từ ngày 1/4/2009 đến ngày 30/6/2009 3.2. Địa điểm Tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc khoa Môi trường và Công nghệ sinh học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu 3.3.1. Nguyên liệu Nước dừa già và dừa non. Hạt kefir Nha đam Đường RE 3.3.2. Dụng cụ và thiết bị Erlen 100ml Cốc 250ml, 1000ml Ống đong 100ml Pipet 10ml Micropipet 0.1ml, 1ml Buret 20ml Ống bóp bằng cao su Rây Tủ lạnh Tủ ấm Autoclave Cân phân tích Bếp từ 3.3.3. Hoá chất Hoá chất chuẩn độ acid: NaOH 0.1N Hóa chất xác định độ cồn: nitro cromic, KI 10%, K2Cr2O7, Na2S2O3 0.1N. Môi trường đếm vi sinh vật có lợi: Hansen (nấm men) MRS (vi khuẩn) Môi trường đếm vi sinh vật gây hại: + E.coli: Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) Eosine Methylene Blue Lactose Agar (EMB) TSA (Tryptone Soya Agar) Canh Trypton Thạch Simmon Citrate Methyl Red Voges Prokauer ( MRVP) + Salmonella: Rappaport Vassiliadis Soya Pepton Broth (RV) Xylose Lysine Desoxycholate Agar (XLD) Buffered Peptone Water (BPW) Triple Sugar Iron Agar (TSI) Mannitol phenol red broth Urea broth Lysine Decarboxylase Broth (LDC) 3.4. Phương pháp 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Chọn nguyên liệu tốt nhất để quá trình lên men xảy ra nhanh, tạo độ chua và độ cồn cao. ¯ Cách tiến hành N G Cấy giống ( 5%) Lên men (25-300C, pH 5.5) Nước dừa Trong đó: N là nước dừa non G là nước dừa già Khảo sát trên môi trường nước dừa non và dừa già (với nồng độ chất khô hòa tan là 5%) Khảo sát với tỉ lệ men giống là 5% Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. Độ cồn theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan trong nguyên liệu đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Chọn nồng độ chất khô hòa tan thích hợp trong nguyên liệu để quá trình lên men xảy ra nhanh và tạo ra độ chua, độ cồn cao. Nước dừa (thí nghiệm 1) B B1 B2 B3 Cấy giống ( 5%) Lên men (25-300C, pH 5.5) ¯ Cách tiến hành Trong đó: B: Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 1 Bi : Nồng độ chất khô hoà tan (%) trong nguyên liệu B1: 5% B2: 7% B3: 9% Khảo sát 3 nồng độ chất khô hòa tan (%) trong nguyên liệu: 5%, 7%, 9%. Tỉ lệ men giống là 5% Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. Độ cồn theo thời gian: 5 giờ, 15 giờ, 25 giờ. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ men giống đến quá trình lên men. ¯ Mục đích Xác định tỉ lệ men giống thích hợp để quá trình lên men xảy ra nhanh và tạo ra độ chua, độ cồn thích hợp. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) C1 C3 Cấy giống Lên men (25-300C, pH 5.5) C2 Trong đó: Ci: tỉ lệ men giống C1: 5% C2: 7% C3: 9% Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Khảo sát 3 tỉ lệ men giống: 5%, 7%, 9% Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 4 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua sau 24 giờ Độ cồn sau 24 giờ 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của độ chua đến quá trình lên men và chất lượng sản phẩm. ¯ Mục đích Xác định độ chua thích hợp để kết thúc quá trình lên men và sản phẩm có chất lượng cao. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống (thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) D1 D3 D2 D5 D4 Trong đó : Di : độ chua ( 0T) D1 : 800T D2 : 900T D3 : 1000T D4 : 1100T D5 : 1200T Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Khảo sát độ chua 800T, 900T, 1000T, 1100T, 1200T Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần ¯ Chỉ tiêu theo dõi Thời gian lên men Độ cồn Mật độ vi khuẩn và nấm men 3.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tỉ lệ phối chế thích hợp cho thành phẩm sau lên men. ¯ Mục đích Tìm công thức phối chế thích hợp để sản phẩm ngon, lạ mắt và bảo quản được lâu. ¯ Cách tiến hành Phối chế (Nha đam 10% v/v) Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống ( thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) Ủ lạnh (140C, 24h) T1 T2 S1 S3 S2 S1 S2 S3 Trong đó: Ti: nồng độ siro (%) T1: 30% T2: 50% Si: tỉ lệ dịch siro phối chế (%) S1: 10% S2: 15% S3: 20% Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Độ chua, độ cồn thích hợp được chọn ở thí nghiệm 4 Thời gian kết thúc quá trình lên men được chọn ở thí nghiệm 4 Khảo sát 2 nồng độ siro: 30%, 50% Khảo sát 3 tỉ lệ dịch siro: 10%, 15%, 20% Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức ¯ Chỉ tiêu theo dõi Đánh giá cảm quan sản phẩm (phụ lục 1) 3.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng sản phẩm. ¯ Mục đích Theo dõi, chọn thời gian bảo quản thích hợp cho sản phẩm để chất lượng được ổn định. ¯ Cách tiến hành Nước dừa (thí nghiệm 2) Cấy giống ( thí nghiệm 3) Lên men (25-300C, pH 5.5) Ủ lạnh (140C, 24h) Đóng chai Bảo quản (4-60C) V1 V3 V2 V5 V4 Phối chế (thí nghiệm 5) Trong đó: Vi: thời gian bảo quản (ngày) V1: 0 ngày V2: 5 ngày V3: 10 ngày V4: 15 ngày V5: 20 ngày Nguyên liệu được chọn ở thí nghiệm 2 Tỉ lệ men giống được chọn ở thí nghiệm 3 Độ chua, độ cồn thích hợp được chọn ở thí nghiệm 4 Thời gian kết thúc quá trình lên men được chọn ở thí nghiệm 4 Tỉ lệ phối chế được chọn ở thí nghiệm 5 Khảo sát thời gian 0 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày, 20 ngày. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức Mỗi nghiệm thức lặp lại 2 lần. ¯ Chỉ tiêu theo dõi Độ chua Độ cồn Escherichia coli. Salmonella 3.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 3.5.1. Phương pháp phân tích Độ acid: phương pháp xác định độ chua của sản phẩm (phụ lục 2) Độ cồn: phương pháp xác định độ cồn (phụ lục 2) Vi sinh vật: xác định vi sinh vật có lợi và gây hại trong sản phẩm (phụ lục 2) 3.5.2. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng chương trình Statgraphic 3.0 (phụ lục 3) CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến quá trình lên men. Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của nước dừa non và dừa già đến độ chua, độ cồn trong quá trình lên men. Nguyên liệu Thời gian (giờ) Độ chua (0T) Độ cồn (g/l) Dừa non (N) 5 15 25 14.45c 39.8b 51.8a 0.02c 0.096b 0.165a Dừa già (G) 5 15 25 9.6c 12.3b 30.55a 0.0195c 0.085b 0.125a Trong đó: Xa, Xa: Khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê Xa, Xb: Khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê Hình 4.1: Đồ thị thể hiện độ chua (0T) của nguyên liệu theo thời gian Theo bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy, nguyên liệu có ảnh hưởng đến lượng acid, tạo ra trong quá trình lên men. Khi bổ sung men giống vào, các vi khuẩn lactic chưa quen với môi trường mới, số lượng tế bào vi khuẩn trong môi trường thấp, mặc dù đã tạo pH tối ưu 5.5 cho vi khuẩn lactic hoạt động. Thời gian này (5 giờ), độ chua tạo ra trong môi trường tương đối bằng nhau, nguyên liệu sử dụng là nước dừa non hay già hầu như không có ảnh hưởng gì đến quá trình lên men của vi sinh vật. Sau một thời gian (15 giờ), chúng thích nghi và bắt đầu phát triển, tạo ra lượng acid lớn, làm chua môi trường. Lúc này, lượng acid tạo ra trong môi trường giữa nguyên liệu là nước dừa non hay nước dừa già đã có sự khác biệt. Đến 25 giờ, thì lượng acid tạo ra càng nhiều và vẫn có sự khác biệt lớn. Điều này có thể giải th