Đồ án Nghiên cứu sản xuất rượu trái cây từ cherry

guyên liệu chính dùng để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra bổ sung thêm một số hóa chất mà mật rỉ không đủ. Quá trình nuôi dưỡng men Saccharomyces là quá trình hiếu khí vì vậy người ta phải cung cấp một lượng lớn khí oxi vào bồn lên men. Nấm men này hiện đang được sử dụng như một công cụ đặc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của kĩ thuật di truyền. Saccharomyces cerevisiae còn gọi là nấm men bánh mì, men bia rượu. Chúng là loại nấm men nổi có khả năng lên men ở nhiệt độ cao 280 – 320C. Có năng lực lên men mạnh, biến đường nhanh và hoàn toàn, sau lên men nấm men lắng chậm. Chúng có thể lên men 95% đường glucose theo con đường đường phân kỵ khí. Nếu lên men hiếu khí cũng theo con đường này thì chúng sử dụng được 70% glucose. Hoạt lực lên men cực đại ở pH = 4,5 - 5. Saccharomyces cerevisiae có sử dụng nhiều loại đường: glucose, galactose, maltose, saccharose. Nhưng không đồng hóa trực tiếp đường lacotose và nitrat. Saccharomyces ellipsoideus là loại nấm men của rượu vang nho, được coi là một loại gần với saccharomyces cerevisiae nhất, chúng có khả năng hình thành 17 – 18% rượu. Saccharomyces carlsbergensis là nấm men còn có tên gọi khác Saacharomyces urarum, đây là nấm men chìm, thường dùng sản xuất bia vàng. Chúng chỉ lên men được 81% đường của dịch, hình thành sinh khối ở đáy bình, lên men hoàn toàn đường raffinose. 2.4.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm men 2.4.4.1. Dinh dưỡng nấm men - Nấm men thường có hai loại dinh dưỡng, đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng tế bào từ các chất ở môi trường bên ngoài. Khi môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregalose, lipip và các chất chứa N sẽ được sử dụng gọi là dinh dưỡng nội bào. Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ đi vào thành phần tế bào để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào. Các chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng tế bào chất để vào nội bào, màng này có khả năng điều chỉnh tính thấm của tế bào đối với vật chất vào hoặc ra khỏi tế bào. Cấu tạo của tế bào nấm men thay đổi khác nhau tùy theo loài, độ tuổi và môi trường sống, nhưng nhìn chung bao gồm: Nước: 75 – 85% Chất khô: 15 – 25% . Trong đó chất khoáng chiếm 2 – 14% hàm lượng chất khô. Bảng 2.2 : Bảng thành phần hóa học nấm men Các chất Thành phần (% chất khô) Carbon CaO Nitrogen Hydro P2O5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO 49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09 2.4.4.2. Dinh dưỡng carbon Các chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, các rượu, acdi hữu cơ, acid amin…đều có thể là nguồn dinh dưỡng của nấm men. Các nguồn dinh dưỡng trước hết phải kể đến các loại đường, đường glucose thuộc loại đường 6C (hexose) được tất cả nấm men sử dụng. Glucose được coi như là nguồn C vạn năng đối với sinh vật. Các loại Saccharomyces lên men sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose, còn với raffinose chỉ sử dụng một phần, còn lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng. Trong nuôi cấy liên tục nấm men có tốc độ sinh trưởng cùng với tốc độ pha loãng của môi trường thì những hợp chất có nhiều C trong phân tử được sử dụng sau cùng. Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men, chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng nấm men, là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất. Tất cả các sản phẩm trung gian trao đổi chất của vòng Krebs đều là nguồn cacbon dinh dưỡng cho nấm men. Song, tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật này trong môi trường chỉ có acid acetic, acid citric, acid succinic, acid malic hay acid oxalic đều thấp hơn so với ở môi trường glucose. Hô hấp hiếu khí: C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 674 cal Hô hấp kị khí C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal 2.4.4.3. Dinh dưỡng nitơ Nguồn nitơ cần thiết để tổng hợp các cấu tử chứa nitơ của tế bào là các chất hữu cơ hoặt vô cơ có sẵn trong môi trường. Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như là hữu cơ, đó là amoni sulfate, phosphate rồi đến các muối acetate, lactate, maltate, succinate. Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptide, các nucleotide…Trong thực tế người ta dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên ( đậu tượng, khô lạc…) làm nguồn nitơ hữu cơ. Nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, còn pepton kém hơn và hoàn toàn không sử dụng được protein. 2.4.4.4. Dinh dưỡng khoáng Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men thì phospho được quan tâm đầu tiên, sau đó là kali, mangne, lưu huỳnh… Nấm men sử dụng tốt nguồn phospho vô cơ là orthophosphate, hợp chất này sẽ chuyển hóa polyphosphate và sau khi hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp. 2.4.4.5. Các chất sinh trưởng Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vitamin B8), biotin (vitamin B7 hay H), acid pantotenic (B3), taimin (B1), pyridocin (B6), acid nicotinic ( B5 hay PP). Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh trưởng là tiamin, ngoài ra còn có acid paraminobezic. 2.5. Sinh trưởng và phát triển nấm men 2.5.1. Sinh trưởng của nấm men Nấm men thuộc giống Saccharomyces là loại hiếu khí không bắt buộc. Trong điều kiện có oxy chúng tiến hành quá trình tăng sinh khối là chính. Trong điều kiện không có oxy chúng tham gia quấ trình lên men để tạo rượu etylic, CO2 và các sản phẩm lên men khác. Trong quá trình lên men, lúc đầu môi trường mới có oxy hòa tan, nấm men dùng oxy này để oxy hóa cơ chất tạo năng lượng cho sinh sản và phát triển. Khi dịch lên men đã trãi qua một giai đoạn lên men, lượng oxy hòa tan cạn dần thì tế bào nấm men lại thu năng lượng nhờ hệ enzyme đặc biệt của mình qua oxy hóa khử các cơ chất. Khi nuôi cấy nấm men trong một hệ kín thì quá trình sinh trưởng và phát của chúng trải qua 4 phage: † Pha tiềm phát (phase lag) Đây là giai đoạn nấm men thích nghi với môi trường, số lượng tế bào nấm men ở giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể, nhưng sự trao đổi chất cảu chúng lại xảy ra mạnh mẽ. Trong môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng giống nấm men cầy vào càng trẻ khỏe thì phase lag càng ngắn. † Pha phát triển (phase log) Trong phase này tế bào tăng nhanh về số lượng tế bào theo cấp số nhân với tốc độ sinh trưởng cực đại. Chất dinh dưỡng trong môi trường cạn dần, đồng thời cacsanr phẩm trao đổi chất sinh ratawng lên, không thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nên chuyển sang pha ổn định. † Pha ổn định (phase stationary) Trong pha này té bào sống ổn định và mật độ quần thể tối đa ( có nghĩa là số lượng tế bào mới sinh ra bằng số lường tề bào cũ chết đi. † Pha suy vong (phase death) Trong pha này các tế bào sống giảm đáng kể và tế bào chết tăng nhanh, một số tế bào tự phân chia do các enzyme nội bào. Các tế bào sống trở nên giafddi, kích thước nhỏ lại và biến dạng. Hình 2.10. Quá trình phát triển nấm men 2.5.2. Một số loài nấm men thường gặp trong sản xuất rượu vang Sau đây là một số loài nấm men thường gặp trong nước quả có vai trò quan trọng trong nghề làm rượu vang. 2.5.2.1. Saccharomyces cerevisiae Đây là tên hiện nay dùng phổ biến, trước đây người ta gọi là Saccharomyces cerevisiae Meyer hay là S. ellipsoideus theo Lodder là Saccharomyces vini. Nấm men này phổ biến trong quá trình lên men nước quả chiếm tới 80% trong tổng số Saccharomyces có trong nước quả khi lên men. Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông. Nguồn dinh dưỡng cacbon của loại này là đường, cồn và acid hữu cơ, những tác nhân sinh trưởng là acid pantotinic, biotin, mezoinozit, thiamin và piridoxin. Đa số các tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3 – 8) x (5 – 12)m, sinh sản theo lối nẩy chồi và tạo thành bào tử. Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invertase có khả năng khử đường saccharose thành fructosevà glucose, vì vậy trong lên men ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men này chỉ đạt được 8 – 10% so với thể tích. Ở giai đoạn cuối lên men Saccharomyces cerevisiae kết lắng nhanh và làm trong dịch rượu. Ở nòi của giống này có đặc tính riêng về khả năng tạo cồn, chịu sunfit, tổng hợp các cấu tử bay hơi và các sản phẩm thứ cấp tạo ra cho vang có mùi vị đặc trưng riêng biệt. Giai đoạn cuối cùng của quá trình lên men các tế bào Saccharomyces cerevisiae thường bị già, không tiếp tục chuyển đường thành cồn và bị chết rất nhanh. Hình 2. 11 : Nấm men được chụp dưới kính hiển vi Hình 2. 12: Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi 2.5.2.2. Saccharomyces uvarum Men này được tách từ nước nho, rượu len men tự nhiên. Về hình thái nó không khác với các loài khác. Khả năng sinh bào tử khá mạnh trên môi trường thạch – malt. Các nòi của loài này có thể lên men 12 – 130 cồn trong dung dịch nước nho. Một vài nòi được dùng trong sản xuất rượu vang. 2.5.2.3. Saccharomyces chevalieri Nấm men này được tách từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây men nước dừa hoặc nước cọ. Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 160 cồn. Nó thường lẫn với Saccharomyces cerevisiae. Hình 2. 13: Nấm men Saccharomyces chevalieri dưới kính hiển vi 2.5.2.4. Saccharomyces oviformics Theo Lodder là Sac. Beuanes saccardo. Được tách ra từ nước nho tự lên men, nhưng loại nấm men này ít hơn so với Sacch. vini. Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo thành tới 180 cồn. Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như Sacch. vini và có khả năng chịu được cồn cao. Dùng các nòi thuần chủng của giống này lên men dịch quả có hàm lượng đường cao để chế vang khô cho kết quả tốt. Có hình dáng giống như Saccharomyces cerevisiae và có thể tạo thành 18% rượu trong quá trình lên men, giống này tạo thành màng trên dịch quả. S. oviformis lên men được glucose, fructose, mantose, saccarose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men được lactose, pentose. Điều khác nhau cơ bản của S. oviformis với S. vini là: S. oviformis không lên men được galactose và men nổi lên bề mặt dịch lên men tạo thành màng. Hai giống sản xuất rượu trái cây này (S. vini và S. oviformis) có nhiều nơi được dùng trong sản xuất. CHƯƠNG 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ ngày 01/04/2009 – 30/06/2009. 3.1.2. Địa điểm Tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Môi Trường & Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 3.2. Vật liệu nghiên cứu Nguyên liệu Trái cây cherry được mua từ chợ Bà Chiểu, quận Bình Thạnh, Tp.HCM. Trái Cherry được chọn là những trái chín đỏ, quả to, không bị bầm dập, hư hỏng. Giống vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae được phân lập từ dịch quả Sơri đã cho lên men tự nhiên trong 5 ngày. Saccharomyces cerevisiae được cung cấp từ phòng Thí nghiệm Vi sinh, Khoa Môi Trường và Công nghệ Sinh học,Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM. 3.2.1.2. Đường tinh luyện: Nhằm cung cấp nguyên liệu và ổn định chất lượng trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đường tinh luyện Biên Hoà do công ty Cổ phần đường Biên Hòa sản xuất (phụ lục 2.2) . 3.2.1.3. Hóa chất [1],[2]: + Môi trường Hansen + Natri Alginate (NaC6H7O6 ) + CaCl2 2% + CH3COOH, CH3COONa + HCl 0,1 N, CaCO3 0,1N + NaOH 5% + Phenolphthalein, Methylene Blue… 3.2.1.4. Nước Hai nguồn nước được sử dụng trong khi tiến hành thí nghiệm là: - Nước cất lấy từ máy cất nước trong phòng thí nghiệm: phù hợp để dùng trong các công đoạn pha loãng, phối trộn, pha hóa chất, các quá trình phân tích, kiểm nghiệm… - Nước máy từ hệ thống cấp nước thành phố: dùng để rửa nguyên liệu, dụng cụ thí nghiệm,vệ sinh thiết bị… 3.2.2. Thiết bị [1] † Autoclave † Tủ ấm 370C, 300C † Phòng cấy vi sinh † Thiết bị chưng cất: Bếp điện, bình cầu cất rượu, ống sinh hàn, bình định mức 250ml. † Máy đo pH Metrohm 744 † Dụng cụ chuẩn độ acid Khúc xạ kế Atagon - 1a Rượu kế có vạch đo độ rượu và nhiệt độ † Các thiết bị cần thiết khác 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp phân lập nấm men [1],[2],[4] Mục đích: Trong dịch lên men, vi sinh vật tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau (nấm men, nấm mốc, vi khuẩn). Muốn nghiên cứu những đặc tính sinh lý, sinh hóa hoặc sử dụng một loài nào đó thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết. Phân lập nấm men là quá trình tách riêng các chủng nấm men từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết. Nấm men ở dạng thuần khiết là giống nấm men được tạo ra từ một tế bào ban đầu. Ép, lọc Cherry Bình tam giác Lên men (tự nhiên) Dịch chiết Môi trường Hansen Đường, pH Tủ ấm Cấy truyền Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Nước tinh khiết 3.3.2. Quy trình thực hiện thực hiện Hình 3.1: Quy trình thực hiện nhân giống 3.3.3. Thuyết minh quy trình 3.3.3.1 Nguyên liệu: Cherry sau khi mua về ta tiến hành chọn lựa những quả chín có màu đỏ tươi, không chín quá hay bầm dập. Ta rửa sạch và loại bỏ những trái xanh. 3.3.3.2. Xử lý: Sau khi rửa sạch ta ép lấy nước, dùng vải lọc để loại bỏ cặn. Tiếp theo cho vào bình tam giác và pha với nước tinh khiết được lấy trong phòng thí nghiệm. Ở đây chúng tôi pha trộn với tỉ lệ 1 : 1. 3.3.3.3 Lên men: Để quá trình lên men diễn ra thuận lợi, nâm men phát triển tốt chúng tôi cung cấp thêm đường, điểu chỉnh pH và điều chình nồng độ chất khô (Brix). Việc cung cấp dinh dưỡng, pH và độ Brix có thể ở nhiều tỉ lệ khác nhau. Nhưng qua quá trình khảo sát, tiềm hiểu và thực nghiệm chúng tôi đã chọn được tỉ lệ thích hợp nhất để nấm men phát triển theo bảng sau: Bảng 3.1:Bảng chỉ tiêu theo dõi cho quá trình lên men Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ Tỉ lệ pha loãng 1: 1 pH 4,0 ÷ 4,2 Brix 20 Thời gian 8 ngày Sau thời gian lên men trong 8 ngày, ta hút 0,1 ml dịch lên men để trãi đĩa trên môi trường Hansen (phụ lục 2.1). Sau khi cấy xong ta chuyển vào tủ ấm để ủ với nhiệt độ 370C, 24 ÷ 48h. Nấm men sau khi phát triển ta tiếp tục cấy chuyển sang môi trường Hansen khác. Ta tiếp tục ủ trong tủ ấm 370C, 24 ÷ 48h. Sau thời gian này ta kiểm tra xem có phải là nấm men Saccharomyces cerevisiae hay không. Việc kiểm tra này ta tiến hành quan sát trên kính hiển vi quang học. Ta quan sát xem nấm men có kích thước hình dạng đặc trưng hay không. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu, hình trứng hay elip, tế bào có kích thước lớn, khuẩn lạc có màu trắng sữa. 3.3.3.4. Nhân giống cấp 1: Sử dụng môi trường Hansen lỏng đã vô khuẩn ở 1210C trong 15 phút. Ta tiến hành cấy nấm men vào trong bình tam giác đã chuẩn bị sẵn môi trường Hansen lỏng với thể tích 10ml. Mục đích nhằm nấm men làm quen dần với trạng thái môi trường mới và cung cấp đủ nguồn oxy cần thiết cho quá trình sinh trưởng tăng sinh khổi của nấm men. Ta nuôi trên máy lắc trong 48 giờ với vận tốc lắc 150 vòng/ phút. 3.3.3.5. Nhân giống cấp 2: Ta chuyển 10 ml ở môi trường trên vào bình tam giác có chứa 50ml môi trường Hansen lỏng. Ta tiếp tục nuôi trên máy lắc trong 48 – 72 giờ, vận tốc lắc 150 vòng/phút. Sau đó hút 10ml ở môi trường này vào 100ml môi trường Hansen lỏng đã chuẩn bị sẵn và nuôi tiếp trong máy lắc với thời gian 48 – 72 giờ, vận tốc 150 vòng/phút. Hình 3.2: Nấm men được nuôi cấy trên đĩa peptri. Nguyên liệu Sản phẩm Nước vô trùng Đường Men giống Xử lý nguyên liệu Ép,lọc lấy nước Bã Pha loãng Phối trộn Thanh trùng Lên men Làm lạnh Lọc Chiết rót Thanh trùng Kiểm tra vi sinh Điều chỉnh pH 3.3.4. Sơ đồ quy trình sản suất rượu trái cây Hình 3.3: Quy trình lên men rượu cherry 3.3.5. Thuyết minh quy trình 3.3.5.1. Nguyên liệu Sau khi mua chery về ta lựa chọn những trái chín, không được chín quá, màu hơi đỏ. Chọn kích thước các trái đồng đều nhau, không bầm dập, không thối rửa. Xử lý nguyên liệu Ta tiến hành rửa sạch để loại bỏ tạp chất, bụi bẩn, kiểm tra lại những trái không đạt yêu cầu. Những hạt bụi hay chất bẩn trên bề mặt vỏ quả sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Sau khi rửa sạch, ta dùng tay ép từng trái hay cho vào một túi vải để ép lấy nước. Sau đó dùng tấm vải lọc để lọc cặn giúp cho sản phẩm trong và có màu sắc đẹp hơn. Giai đoạn này ta tiến hành càng nhanh càng tốt để hạn chế sự mất vitamin C và thành phầm dinh dưỡng. Pha loãng Mục đích: nhằm giảm độ chua của dịch cherry. Ta dùng nước cất đã vô trùng để pha loãng theo tỉ lệ đã được khảo sát. Các biến đổi khi pha loãng là không đáng kể, chủ yếu là màu sắc và mùi vị, lượng nước pha loãng càng nhiều thì màu sắc càng giảm. Phối trộn Mục đích: cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho nấm men phát triển, điều chỉnh nồng độ dịch quả trước khi lên men. Để quá trình lên men diễn ra tốt nhất ta khống chế các thành phần, nồng độ pH. Yêu cầu lượng đường cho vào và pH tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của chủng nấm men mà ta sử dụng. Ở đây chúng tôi sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae để lên men, thường nồng độ đường từ 20 ÷35%, pH = 3,5 ÷ 5,0 Dịch sau khi lọc va pha loãng có màu đục, pH rất thấp ( pH = 2,73 ÷ 3,07) ta cần nâng pH lên đến điểm thích hợp pH = 3,5 ÷5,0 bằng Na2CO3 và để kiểm tra độ đường ta dùng khúc xạ kế. Thanh trùng Mục đích: tiêu diệt vi sinh vật gây hại cho nấm men. Đun dịch cherry sau khi phối trộn đun nóng ở nhiệt độ 70 ÷ 800C trong 15 phút. Lưu ý: Không được đun quá nóng và quá lâu sẽ làm các vitamin trong dịch cherry bị biến tính, đường và các acid bị thất thoát do bay hơi hay biến tính…sau khi thanh trùng xong ta phải hạ nhiệt độ dịch cherry xuống khoảng 28 ÷ 300C để lên men. Lên men Dung dịch sau khi đã điều chỉnh nồng độ, pH và thanh trùng bằng nhiệt được tiến hành lên men. Quá trình lên men ở những điều kiện tối ưu đã được tiến hành ở trên, pH = 3,5 ÷ 5,0; ở nhiệt độ phòng và thời gian lên men thường kéo dài 5 ngày. Khi lên men tránh tình trạng mở nắp thường xuyên vì khi mở nắp làm cho oxy cũng như vi khuẩn xâm nhập vào ảnh hưởng đến nấm men. Làm lạnh Mục đích: + Làm cho tế bào nấm men lắng xuống, giảm bớt sự phát triển nấm men, thành phần dinh dưỡng được ổn định. Tạo thuận lợi cho quá trình lọc Hạn chế tổn thất CO2 và mùi hương Sau khi lên men, ta tiến hành làm lạnh dịch lên men bằng cách bảo quản trong tủ lạnh dưới 100C. 3.3.5.8. Lọc Sau quá trình làm lạnh, ta tiến hành lọc thô để thu lấy dịch rượu sản phẩm. Quá trình này cần đảm bảo vệ sinh, hạn chế sự mất mùi sẩn phẩm. Chiết rót Sản phẩm dịch rượu sau khi lọc được chiết rót vào chai thủy tinh. Chai đựng nước giải khát yêu cầu phải có kích thước xác định, thường có dung tích là 650, 500, 330, 200 ml. Đậy chai bằng nút sắt tây lót cao su hay giấy carton và yêu cầu phải kín. Chai phải trong suốt, có màu xanh tối hay sẫm vàng. Điều này sẽ hạn chế tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời, tránh cho nước giải khát bị đục. Ngoài ra chai còn phải chịu được áp suất và sự thay đổi nhiệt độ đột ngột. Yêu cầu chung với tất cả nước giải khát có ga trước khi chiết rót phải làm lạnh tới nhiệt độ 8÷100C. Thanh trùng Mục đích: do trong rượu lên men vẫn còn chứa tế bào nấm men, đó là nguyên nhân làm mất ổn định chất lượng sản phẩm khi bảo quản. Bảo quản lạnh chỉ hạn chế được hoạt động của nấm men, nhưng không làm ngừng hoàn toàn quá trình sinh học xảy ra trong thành phẩm. Vì thế, thanh trùng là biện pháp chung nhất nhằm giữ cho sản phẩm lâu hỏng. Sản phẩm được thanh trùng bằng nhiệt ở 65÷75oC trong 35÷40 phút (thanh trùng Pasteur), sau đó làm lạnh xuống 10oC và được bảo quản trong tủ lạnh. Đối với nước giải khát đóng chai thanh trùng như vậy sẽ bảo quản được từ 2÷3 tháng. Kiểm tra chất lượng Sản phẩm sau khi làm nguội được kiểm tra rồi dán nhãn. Đây là khâu để loại bỏ các chai không đạt yêu cầu và hoàn chỉnh sản phẩm để có thể tiêu thụ buôn bán trên thị trường. Việc kiểm tra này chúng tôi tiến hành kiểm nghiệm tổng vi sinh hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa, đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường PCA sau thời gian ủ ở 350C trong 24 giờ. 3.3.6. Phương pháp cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trong hạt gel alginate [6] v Cách tiến hành: Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Natri alginate để cố định môi trường có chứa nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng phương pháp nhốt nấm men theo quy trình sau: Tiến hành pha loãng Natri alginate thành 2,5% (w/v) rồi đun sôi ở bếp từ để cho dung dịch này tan đều, không được đua quá nóng hoặc quá nguội như vậy dung dịch sẽ không tan đều. Sau đó tiến hành pha trộn với môi trường có chứa nấm men theo tỉ lệ 1 : 1 (v/v). Ta dùng đũa khuấy đều để hai dung dịch này tan đều với nhau, sử dụng pipete 10ml hút rồi nhỏ từng giọt hỗn hợp này vào dung dịch CaCl2 2% để tạo hạt cố định. Tiếp tục ngâm hạt nấm men được cố định trong CaCl2 này trong 2 giờ để tăng độ bền của hạt. Sau 2 giờ ta vớt hạt cố định ra dung dịch này và rửa sạch 3 lần với nước cất và được ngâm vào dung dịch đệm acetate 0,1M, pH = 4,5 trước khi sử dụng. Hạt nấm men được cố định có hình cầu với đường kính trung bình 3 -4 mm. 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ pha loãng Tỉ lệ pha loãng giữa nước và dịch cherry có ảnh hưởng lớn quá trình lên men, chất lượng sản phẩm nên ta tiến hành khảo sát để tìm ra một tỉ lệ tốt nhất. Chúng tôi tiến hành pha loãng giữa nước và dịch cherry (L) theo các tỉ lệ: không pha loãng (1 : 0), L = 1 : 1; L = 1 : 2; L = 1 : 4. Bảng 3.2: Chỉ tiêu theo dõi trong quá trình khảo sát tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ pha loãng Chỉ tiêu theo dõi Không pha loãng 1 : 1 1 : 2 1 : 4 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn ( %V ) u Cách tiến hành Sau khi thu được dịch Cherry phân phối vào 4 bình tam giác khác nhau với mỗi bình là 100 ml, bổ sung thêm nước tinh khiết ở tỷ lệ như trên. Ta tiến hành bổ sung thêm các thành phần khác như đường, điều chỉnh pH thích hợp. u Yếu tố cố định Thời gian lên men: 8 ngày pH = 4,0 ÷ 4, 2 Nồng độ chất khô: 0Bx = 20 Tỷ lệ nấm men: 15%V Nhiệt độ lên men: 300C Mật độ tế bào lên men: 30.106 được cố định trong hạt alginate u Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau lên men và nồng độ chất khô (0Bx) Khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt, tốc độ lên men, mùi hương của sản phẩm 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ chất khô hoà tan thích hợp trong quá trình lên men Nồng độ đường được cung cấp vào dịch lên men đóng vai trò là nguồn năng lượng chính cho nấm men phát triển, giúp cho qúa trình lên men nhanh hay chậm. Chúng tôi tiến hành bổ sung đường (N) vào dịch lên men theo các tỉ lệ khác nhau để được độ 0Bx tương ứng bảng sau: Bảng 3.3: Chỉ tiêu theo dõi trong quá trình khảo sát nồng độ chất khô Nồng độ chất khô(0Bx) Chỉ tiêu theo dõi 18 20 22 24 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Cách tiến hành Sau khi đã chọn được tỷ lệ pha loãng thích hợp ở thí nghiệm 1 ta tiến hành khảo sát xem nồng độ đường nào là thích hợp nhất. Ta bổ sung thêm đường theo tỷ lệ ở trên và kiểm tra nồng độ chất khô, pH. u Các yếu tố cố định Thời gian lên men: 8 ngày pH = 4,0 ÷ 4,22 Tỷ lệ nấm men: 15%V được cố định trong hạt alginate Nhiệt độ: 300C Tỷ lệ pha loãng: được chọn ở thí nghiệm1 u Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau lên men và 0Bx Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt và mùi của sản phẩm. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ pH ảnh hưởng đến quá trình lên men Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 4 mẫu có pH thay đổi như sau: pH1 = 3,5; pH2 = 4; pH3 = 4,5; pH4 = 5 với tỉ lệ pha loãng, pH và lượng đường tối ưu đã khảo sát trên, ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Bảng 3.4: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát nồng độ pH pH Chỉ tiêu theo dõi 3,5 4,0 4,5 5,0 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Cách tiến hành Sau khi chọn được tỷ lệ pha loãng, nồng độ đường thích hợp nhất ở thí nghiệm 2, ta tiến hành khảo sát độ chọn pH nào là thích hợp nhất. Chúng tôi sử dụng NaOH 0,1N để tăng pH và sử dụng HCl 0,1N để giảm pH. u Các yếu tố cố định - Thời gian lên men: 8 ngày - Tỷ lệ nấm men: 15%V được cố định trong hạt alginate - Tỷ lệ pha loãng: được chọn thí nghiệm 1 Nhiệt độ: 300C 0Bx được lấy từ thí nghiệm 2 u Các chỉ tiêu theo dõi - Chỉ tiêu hóa lý: pH, độ cồn sau khi lên men và 0Bx - Tốc độ lên men, khả năng sinh CO2 được ghi nhận bằng mắt và mùi hương. 3.4.4. Thí nghiệm 4a: Khảo sát tỷ lệ nấm men được bổ sung trực tiếp vào dịch lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Bảng 3.5: Chỉ tiêu theo dõi quá trình khảo sát tỷ lệ nấm men khi cấy trực tiếp vào dịch lên men Tỷ lệ nấm men (%V) Chỉ tiêu theo dõi 5,0 10,0 15,0 20,0 Nồng độ chất khô (%) pH Độ cồn (%V) u Các tiến hành Để khảo sát ảnh hưởng của lượng men giống cho vào dịch lên men, chúng tôi tiến hành thí nghiệm các mẫu với tỷ lệ men giống (M) được cho vào như sau: M1 = 5%V, M2 = 10%V, M3 = 15%V, M4 = 20%V so với thể tích dịch lên men,ở đây nấm men không được cố định trong hạt algina