Đồ án Nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số Hyponex bổ sung đến sự hình thành và phát triển chồi lan Phalaenopsis và lan Dendrobium

đính lại với nhau ở đỉnh và gốc. Ở một số loài, khi quả chín không nứt ra nên hạt chỉ ra khỏi vỏ khi quả bị mục nát. Hạt Một quả chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt. Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích thước rất nhỏ (trước đây phong lan còn được xem là họ tử vi–microspermeae) nên phôi hạt chưa phân hoá. Sau 12-8 tháng, hạt chín và phát tán nhờ gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thích trong điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm. 1.4.4. Điều kiện sinh thái Ánh sáng Dendrobium là giống ưa ánh sáng, có thể trồng trong điều kiện ánh sáng trực tiếp hay ánh sáng khuếch tán, ánh sáng hữu hiệu cho giống Dendrobium là 70%, vì thế giàn che với độ che sáng 30% dưới đất, và 40% ở trên cao như sân thượng thích hợp cho sự phát triển. Ánh sáng rất cần thiết cho sự tăng trưởng và ra hoa. Lượng ánh sáng cần thiết bằng khoảng 50% ánh sáng mặt trời (tuỳ theo điều kiện nuôi trồng trong nhà hay trong nhà kính). Nếu dùng ánh sáng nhân tạo thì cần 4 đèn neon 40 watt và 2 đèn tròn 40 watt chiếu trực tiếp lên phía cây. Ánh sáng thấp làm cho cây mảnh khảnh, lá mỏng, hoa nhỏ hoặc không có hoa. Do đó, nếu trồng trong nhà thì hướng ra cửa sổ đóng vai trò quan trọng. Mùa hè và mùa thu trồng theo hướng tây và đông, mùa đông và mùa xuân thì trồng theo hướng nam là phù hợp cho việc cung cấp đầy đủ ánh sáng. Để Dendrobium tăng trưởng tốt. Tuy nhiên ánh sáng quá cao lại làm cây bị cháy. Có thể nói Dendrobium là loài ưa sáng (60 - 70%), có những loài yêu cầu ánh sáng tới 80 - 90%. Nhiệt độ Dendrobium ưa những vùng đất thấp và ấm áp như vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây trưởng thành cần sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm là 6-90C. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của Dendrobium là: Ngày: 27-320C. Đêm: 16-180C Trong điều kiện độ ẩm và thoáng khí tăng thì nhiệt độ 35 -380C là rất tốt. Nhiệt độ dưới 100c có thể làm rụng lá. Cây lan Dendrobium có biên độ nhiệt độ rất rộng, người ta chia làm 2 hai nhóm chính: - Nhóm ưa lạnh: nhiệt độ lý tưởng là 150C sống chủ yếu ở vùng cao nguyên trên 1000m. Những loài lan này có thể ra hoa ở nhiệt độ cao. - Nhóm ưa nóng: nhiệt độ thích hợp nhất là 250C. Ngoài ra còn có giống lan thích hợp ở nhiệt độ 200C có thể ra hoa ở vùng nóng và vùng lạnh. Nước Nước rất quan trọng cho cây để tăng trưởng. Nếu thiếu nước cây sẽ không phát triển và có thể bị chết khô. Nhìn thấy thân cây hay lá cây bị nhăn nheo, là cây thiếu nước. Còn quá nhiều nước cây bị úng, thối rễ, là điều kiện tốt cho vi khuẩn, nấm xâm nhập làm cây chết. Nước giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo giữa các lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn. Dendrobium rất dễ trồng ở TP.HCM vì thời tiết, khí hậu rất thuận lợi, cây chịu nóng chiu ẩm, chịu sáng, chịu nắng 70%, nếu tưới phân thích hợp một tuần một lần đúng theo lứa tuổi thì sẽ ra hoa quanh năm. Tốt nhất nên trồng một loại Dendrobium đồng nhất và cùng lứa tuổi, cùng cở chậu, treo ngay hàng thẳng lối, dùng cùng một loại phân thì dễ chăm sóc hơn. Chỉ cần làm hệ thống tưới nước phun sương ngày 2 lần, mùa nắng thì 3 lần. Dendrobium nếu được tưới đủ ẩm củng không có rầy và nhện đỏ. Độ ẩm Dendrobium cần độ ẩm trong khoảng 50 – 60%. Nếu trồng trong nhà kính thì nên dùng máy tạo ẩm độ nếu điều kiện quá khô hanh. Độ ẩm rất cần cho cây tăng trưởng nhanh hơn và hoa tươi lâu, lâu tàn. Giá thể Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước quá lâu. Có thể sử dụng một loại giá thể hoăc trộn các giá thể với nhau như vỏ cây khô, đá núi lửa, xơ dừa hoặc đá. Phân bón Nhiều người lầm tưởng rằng cây lan chỉ cần có khí trời và nước là có thể sống và phát triển được. Thật ra cây lan cũng như các loại cây trồng khác đều phải có đầy đủ chất dinh dưỡng và kích thích tố. Nhìn chung, mỗi một loại lan (cả lan rừng lẫn lan nuôi cấy mô) đều cần nhiều nguyên tố, trong đó nổi bật là các nguyên tố đa lượng như Fe, Cu, Mn, Bo. Ngoài ra, cây lan cũng cần đầy đủ các chất khoáng dựa trên một công thức trong suốt thời gian đang tăng trưởng và chính xác loại phân cho từng cây. Thường có công thức chung: N : P : K cân bằng nhau (10 : 10 : 10), (12 : 12 : 12)… cho mỗi tuần trong thời kì tăng trưởng của chúng. Trong thời gian tưới phân cũng rất quan trọng, thời gian để tưới phân tốt nhất trong ngày là buổi sáng sớm hay chiều tối, không nên tưới vào buổi trưa. Tuy nhiên tuỳ theo mùa mà có thể chuyển lịch tưới cho phù hợp. Trung bình chỉ nên tưới mỗi tuần một lần (tùy theo mùa mưa hay khô, nơi nắng ít hay râm mát), và tưới từ nồng độ thấp đến nồng độ cao. 1.4.5. Giá trị sử dụng 1.4.5.1. Giá trị sử dụng của lan ở một số nước trên thế giới Các vườn lan Dendrobium cắt cành tại các nước trên thế giới được tổ chức trồng, thu hoạch, đóng gói và phân phối theo quy trình công nghiệp. Các vườn lan ở đấy đều có trang web giới thiệu đầy đủ từ cơ sở trang trại, tên giống, giá cả từng mặt hàng và giá cả vận chuyển trong và ngoài nước. Dendrobium được chọn làm giống chủ đạo trong ngành sản xuất lan cắt cành do những ưu điểm sau: - Siêng ra hoa, cho nhiều cành, số lượng hoa trên 1 cành nhiều (tối thiểu 6 hoa/cành), có phổ khí hậu sống rộng. - Số lượng loài lớn nên chủng loại sản phẩm rất đa dạng, dễ thay đổi theo thị hiếu của thị trường, rất được ưa chuộng, đặc biệt là trên thị trường Châu Á. 1.4.5.2. Giá trị y dược và thực phẩm Từ lâu cây lan đã được sử dụng trong y dược và thực phẩm. Được liệt kê trong dược cổ điển Hy Lạp, Trung Quốc và vùng Tiểu Á, chúng được phơi khô, xắt nhỏ làm thuốc giảm đau và thuốc kích thích. Zhao C và các cộng sự (2002) đã tách chiết được copacamphane, picrotoxane, alloarmadendrane sesquiterpene, glycoside và phenolic glycoside từ thân của Dendrobium moniliforme. Bên cạnh đó còn ly trích được 1 nhóm chất hóa học mới là dendromoliside được đánh dấu từ A–D. Bước đầu thử nghiệm cho thấy các chất này làm tăng số lượng tế bào B và ức chế tăng sinh tế bào T in vitro. Gao J. Và các cộng sự (2003) đã quan sát mô tuyến ức được nuôi trên môi trường có chứa dịch chiết từ protocorm của Dendrobium thấy rằng trọng lượng mô tăng, làm tăng khả năng của phagocyte và tốc độ biến đổi của lymphocyte. Một số bộ tộc ở Indonesia dùng Dendrobium sallacense nấu với cơm như người Việt Nam ở đồng bằng sông Cửu Long dùng lá dứa. Ngoài ra lá và giả hành được dùng làm trà hoặc lấy sợi trong thân phơi khô để làm kiềng đeo tay,... Theo Đông y người ta cho rằng cây lan này là một vị thuốc bổ dương tăng thêm sức mạnh tình dục và trường thọ, cho nên đến bây giờ vẫn còn thông dụng. D. nobile có chất alkaloid và đặc biệt chất dendrobine được dùng trong y dược. Ở Nam Dương, thân cây của những giống Dendrobium nguyên thủy như D. acuminatissimum, D. bilfate và D. macrophyllum được dân chúng dùng trong việc đan lát rổ rá hoặc đan ghế ngồi. Tại nhiều nơi khác như quần đảo Solomon, bán đảo Cape York, quần đảo Torres Strait, Irian Jaya, Molucas, v.v... người ta đem cây Dendrobium ra phơi nắng hay hơ trên lửa. Phần ngoài của thân cây có mầu vàng được tước ra để đan chiếu, vòng đeo tay, cung tên hay các vật dụng sơ khai như quần áo, đồ trang sức, đồ cúng lễ hay tang ma v.v... Tại Sulawesi và Kalimantan thân cây Diplocaulobium utile được chẻ ra và phơi khô cho có mầu vàng để trang trí cho các vật dụng nhỏ như giỏ hay hộp đựng xì gà. Vì sự hiếm quý, cho nên ở Sulawesi các thảm, chiếu hay đồ đan bằng giống lan này chỉ dành riêng cho hoàng gia hay các nhà quý tộc. Trong khi đó tại Nhật Bản D. moniliforme được coi như biểu hiệu của sự trường thọ và dùng cho việc trang trí các đền đài. (internet) Vài thứ lá cây Dendrobium ở Tân tây lan được dùng làm thuốc ho. Tại Ấn độ D.monticola và D. ovatum dùng làm cho da được mềm mại và D. moschatum (Thái Bình) chữa chứng đau tai. Tại Mã Lai D. bifarum, D. planibulbe và D. purpurum dùng để chữa trị nhiều chứng bệnh về da. Ở Tây Mã Lai và Java cây D. crumenatum được dùng để chữa chứng đau tai hay nhiễm trùng trong tai. Cây D. hymenanthum dùng để chữa bệnh phù thủng và cây D. sulbulatum được nghiền ra để trị chứng nhức đầu ở Tây Mã Lai. Lá cây D. crispatum cũng được dân Tahiti vò ra để chữa nhức dầu và làm dịu cơn đau trầm trọng. Người Phi luật tân dùng D. taurinum làm thuốc gội đầu tri chứng rụng tóc. Tại Queenland, Úc Châu người ta dùng D. discolor để làm thuốc chữa bệnh nhiễm trùng và thuốc chữa bệnh hắc lào (lác).(internet) 1.5. Các kỹ thuật nhân giống trên cây lan 1.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống 1.5.1.1. Nhân giống hữu tính bằng hạt Như đã nói, giao phấn trong tự nhiên là hiện tượng thông thường, gần như bắt buộc đối với hầu hết các loài lan. Đó là nguyên nhân vì sao họ lan có số lượng chủng loại rất phong phú. Đó cũng là phương thức tồn tại, phát triển và tiến hoá ưu thế hơn cả của họ thực vật này trong hướng thụ phấn nhờ côn trùng. Việc giao phấn đều tạo ra những giống mới, qua chọn lọc, có những đặc tính hơn hẳn cây bố mẹ. Trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện. Cánh môi của hoa lan có cấu tạo và hình dạng đặc biệt thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang phấn đi. Thông thường, để đạt tỷ lệ thụ phấn thành công cao, con người cần chủ động thụ phấn cho cây. Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã khám phá ra được nguyên nhân làm cho hạt lan có thể nảy mầm liên quan đến sự có mặt của nấm rễ. Nếu không có nấm cộng sinh thì lan không thể nảy mầm. Với vai trò là nguồn cung cấp đường cho hạt lan, hệ thống rễ sợi của nấm xâm nhập vào trong phôi và cung cấp nguồn carbon cho phôi phát triển. Năm 1922, Knudson đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn. Khi quả đã chín khoảng 2/3, có thể khử trùng quả bằng dung dịch thuốc tẩy và cồn. Sau đó, dùng một con dao tách vỏ và lấy hạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Sau khi hạt nảy mầm được 30 – 60 ngày chuyển cây con sang môi trường mới. Rễ thường hình thành khi cây con đã có 2 – 3 lá. Cấy chuyền cây con sau mỗi 30 – 60 ngày đồng thời giảm mật độ cây trong bình. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn tùy giống. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật ở các cây họ lan là biến dị xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp đem lại sự đa dạng cho các loài lan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì các cây con tạo thành từ hạt không đồng nhất về mặt di truyền. 1.5.1.2. Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết Phương pháp này dùng để tách các chậu lan quá đầy, đồng thời làm tăng số lượng cây mới. Các giả hành già được tách ra khi hoa đã tàn và chỉ tách khi đã trồng được từ 2 - 3 năm. Giả hành già được ươm lại trên giá thể ẩm để tạo chồi con, các chồi con được nuôi cùng với giả hành cho đến lúc đã tạo ra rễ mới, đủ sức phát triển mới tách lần thứ hai. Từ một giả hành có thể cho mỗi đợt 1 - 2 cây con. Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng. Trong điều kiện ẩm độ tốt hoặc trồng trong các nhà kính mang tiểu khí hậu nhân tạo thì có thể tách chiết quanh năm. Vào thời kỳ cuối mùa sinh trưởng của cây, cây được cắt rời cây thành từng đơn vị và vẫn giữ nguyên trong chậu. Sau một thời gian, lấy cây ra đem cắt bỏ các rễ hư rồi rửa bằng dung dịch khử trùng để tiêu diệt hết mầm mống gây bệnh, sau đo, đặt các đơn vị lan vừa tách chiết vào giữa chậu mới. Để cây ở nơi có điều kiện ẩm độ và ánh sáng thích hợp với từng loài cụ thể để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Những loài lan đơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió. Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to. Phần bên gốc cây đã cắt sẽ nảy ra 2 – 3 cây con ở nách lá, gần chỗ cắt. Có thể dùng dây kẽm cột siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc lên 2 – 3 cây con. Khi cây con có 2 – 3 rễ mạnh thì cắt ra trồng, mở dây kẽm ra, cây mẹ vẫn sống bình thường. Hoặc khi hoa tàn thì cắt bỏ và chừa 3 – 4 mắt phía trên phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên cây con. Phalaenopsis trồng lâu năm cũng có thể ra cây con từ các nách lá ở gần dưới gốc. Keiki: Khi keiki có bộ rễ khỏe và 2 – 3 lá (sau khoảng 6 tháng), ta có thể chiết cây trồng vào chậu. Sử dụng phương pháp nhân giống này có thể giúp Phalaenopsis ra hoa trong khoảng 18 tháng đến 2 năm. Đối với Dendrobium, là cây đa thân nên dễ dàng tách chiết để nhân nhanh giống. Đây là phương pháp nhân giống cổ truyền được nhiều người trồng áp dụng. Ưu điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, ít tốn công và vốn, tuy nhiên cây non dễ bị nhiễm bệnh do thao tác và không thể đáp ứng một lượng giống lớn, đồng bộ theo mô hình trồng theo công nghiệp. Bên cạnh đó, thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao. 1.5.2. Kỹ thuật nhân giống in vitro 1.5.2.1. Lịch sử Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào đã phân hoá đều mang các thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Tuy ông đã gặp thất bại trong nuôi cấy các tế bào đã phân hoá tách từ lá một số cây một lá mầm: Erythronium, Ornithogalum, Tradescantia (do cây một lá mầm là đối tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông dùng các tế bào mất khả năng tái sinh). Năm 1922, Kotte (học trò của Haberlandt) và Robbins đã thành công trong việc lặp lại thí nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ rễ của một cây hoà thảo trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose. Tuy nhiên sự sinh truởng chỉ tồn tại một thời gian, sau đó chậm dần và ngừng lại mặc dù tác giả chuyển qua môi trường mới. Năm 1934, White J.P thông báo nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cà chua (Lycopersicum esculentum) trong môi trường lỏng chứa muối khoáng và glucose và nước chiết nấm men. Sau đó cũng chính White chứng minh có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hổn hợp loại vitamin B: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid. Đồng thời trong thời gian này, R.J. Gautheret (ở Pháp) đã tiến hành nuôi cấy môi tượng tầng một số cây gỗ (cây liễu) khi đưa auxin vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên sự sinh sản các tế bào đầu tiên không vượt quá 8 tháng. Năm 1939, Gautheret thông báo kết quả đầu tiên của ông với Viện Hàn Lâm Khoa Học Pháp về việc nuôi cấy các mô vô hạn của cây cà rốt (Daucus carote ). Sau thế chiến thứ hai, lĩnh vực này đặc biệt phát triển nhanh và nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng trong nông nghiệp đươc công bố. 1.5.2.2. Các bước nhân giống in vitro Nhân giống vô tính các cây trồng in vitro thường gồm các giai đoạn sau: Giai đoạn 1: chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy là mảng mô thực vật được đặt vào môi trường nuôi cấy. Để tiến hành nuôi cấy in vitro thành công, khi lựa chọn mô cấy cần lưu ý đến tuổi sinh lý của cơ quan được dùng làm mẫu cấy, vụ mùa lấy mẫu, chất lượng của cây lấy mẫu cấy, kích thước và vị trí lấy mẫu đó. Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân,... Giai đoạn 2: tạo thể nhân giống in vitro Mẫu được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng thích hợp tạo thể nhân giống in vitro. Có 2 thể nhân giống invitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây trồng. Đối với những loài không có khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo. Trong môi trường nhân giống thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. Giai đoạn 3: nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Cây nhân giống in vitro ở trạng thái trẻ hóa và được duy trì trong thời gian dài. Giai đoạn 4: tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường tự nhiên. Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình tạo rễ in vitro. Giai đoạn 5: chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp,...Sau khoảng 2 tuần, cây cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, độ ẩm thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện tượng chết. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao,... Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên cần phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp để rút ngắn thời gian ra rễ. 1.5.2.3. Các kỹ thuật nhân giống in vitro a. Nhân giống bằng chồi nách Chồi nách nhô từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống như thân chính. Khi các mẫu cấy là chồi được giảm ưu thế ngọn sẽ dẫn tới sự tự sản xuất chồi nách ở mỗi lá hay ở cả nách lá. Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy vào sự cung cấp cytokinin, chồi nách thường xuất hiện sớm và phát triển thành chồi bậc hai, bậc ba …. . Khi các cụm chồi này phát triển chúng ta có thể phân tách để cấy chuyền trong môi trường mới. Nói chung kỹ thuật tăng sinh bằng chồi nách được áp dụng cho bất kỳ cây cây trồng sản xuất chồi nách bình thường và phản ứng với cytokinin như: BAP, Zip & Zeatin (Mantell, Mathew & Mackee). b. Nhân giống bằng chồi đỉnh Sự thành công trong nuôi cấy đỉnh chồi thay đổi tùy theo mẫu cấy sử dụng và việc áp dụng kích thích tố riêng biệt. Kích thước đỉnh chồi nhỏ (0.1 mm – 0.5 mm) thường khó cắt và cho tỉ lệ sống thấp, nhưng nó lại quan trọng trong việc phát triển nguyên liệu gốc sạch bệnh. Những kích thước đỉnh chồi từ 0.5 mm – 2 mm thì thông dụng hơn và thích hợp trong việc nhân giống (Hartmann & Kester, 1983). Thường nuôi cấy đỉnh chồi trong môi trường có chứa auxin kết hợp với cytokinin, nồng độ cytokinin sẽ tăng lên trong những lần cấy chuyền . c. Nhân giống bằng chồi bất định Chồi bất định là một cấu trúc thân và lá mọc lên một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở vị trí khác với nách lá bình thường. Một số các nguyên liệu nuôi cấy gồm: lá, vẩy, cuống lá …… Mặc khác các chồi mới có thể phát triển gián tiếp từ callus hình thành trên mặt cắt của mẫu cấy. Chồi nhô lên từ ngoại biên của callus và không liên hệ trực tiếp tới mô mạch của mẫu cấy. Tuy nhiên chồi bất định có thể làm tăng tỉ lệ cây bị biến dị. d. Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa. Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện của auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ. Từ một cụm tế bào có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn. Nuôi cấy mô hay tế bào sẽ sinh ra mô sẹo (qua sự cảm ứng phát sinh cơ quan hay phôi) là phương pháp nhân giống in vitro có khuynh hướng cho giá trị thấp. e. Nhân giống bằng các đoạn giả hành Chọn những cây lan in vitro từ 5-6 tháng tuổi, sau đó cắt giả hành thành những đoạn có chiều dài khoảng 5mm và đem nuôi cấy trên những môi trường có bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng. f. Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép. Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác như lai hữu tính hoặc gây đột biến nhân tạo Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn đã được phát triển thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội. Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn