Đồ án Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bacillus subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm

nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau.Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại kìm hãm mạnh sự sinh tổng hợp enzym. 1.2.5.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường : Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym. Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng. Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhau không giống nhau. Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật tổng hợp định hướng một enzym xác định. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Ở vi khuẩn Bac.subtilis, quá trình tổng hợp proteaza xảy ra khá mạnh khi dùng cacbon là tinh bột với nồng độ khoảng 2%. Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống dưới 2% sẽ làm giảm một ít hoạt độ phân giải protein của dịch môi trường nuôi cấy. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp proteaza vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ thường dùng là : các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein v.v…Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cần phải chọn tỷ lệ thích hợp. Có như vậy mới bảo đảm cho việc sinh proteaza là lớn nhất . Ngoài những yếu tố kể trên thì các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến quá sinh tổng hợp. Người ta đã chứng minh được rằng với Bac.subtilis có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau để thu được các chế phẩm có tỷ lệ khác nhau hoặc là chủ yếu là phức hệ amylaza hoặc chủ yếu là hệ proteaza. Theo Ortrosko (1977) để thu proteaza từ Bac.subtilis thì thành phần môi trường gồm : dịch thuỷ phân cazein :0.3%, glucoza :1%, MgSO4.7H2O:0.05%, KH2PO4 :0.005%. Còn để thu amylza thì dùng bằng nước chiết cám 20% . 1.3. Một số nghiên cứu, ứng dụng của proteaza hiện nay : 1) Theo Thạc sĩ Vũ Xuân Dũng, năm 1997 đã làm nghiên cứu “Phân lập, lựa chọn chủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính proteaza cao và thăm dò khả năng ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày”. Sau khi phân lập được chủng vi khuẩn sinh proteaza mạnh kí hiệu là Bacillus D15 và ứng dụng vào sản xuất nước mắm ngắn ngày. Khi bổ sung 5% dịch nuôi cấy vào chượp cá sau 30 ngày thuỷ phân thì hàm lượng nitơ toàn phần đạt :22.6g/kg, nitơ foocmol đạt:12.7g/kg, nitơ amin đạt:7.5g/kg. Dịch lọc từ chượp sau 30 ngày đạt được những chỉ tiêu chuẩn của chượp chín và đạt được các chỉ tiêu chất lượng về cảm quan : màu vàng sáng, mùi thơm, vị mặn, ngọt [5,tr125_133] 2) Dùng Bacillus subtilis CNTP_B_08 có khả năng sinh tổng hợp a_amilaza cao sau để ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia nhằm thay thế một phần malt đại mạch bằng các loại nguyên liệu có sẵn trong nước như: ngô :30%; gạo: 30%; malt : 40%. Do đó giá thành sản phẩm hạ 22%(báo cáo khoa học, 43) 3) Nghiên cứu và triển khai sản xuất nước mắm ngắn ngày vào thực tiễn bằng bromelain từ dứa. 4) Ảnh hưởng của muối ăn đến quá trình thuỷ phân cá mối bằng proteaza Bacillus và nồng độ muối thích hợp là 3% (Tạp chí thuỷ sản ,2003) 5) Theo kết quả nghiên cứu thu nhận và bảo quản proteaza từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bac.subtilis . Proteaza của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất 40 ¸50oC ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn ( trên 60oC ) thì proteaza mất hoạt độ đáng kể chỉ còn lại khoảng 40% . pH thích hợp cho proteaza hoạt động là 6.4 ¸7. Proteaza vi khuẩn rất bền với nhiệt độ, ở nhiệt độ 50oC, hoạt độ proteaza không giảm sau 6h. Ở nhiệt độ cao hơn thì hoạt độ proteaza giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70oC thì hoạt độ proteaza giảm rất nhanh. 6)"Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh proteaza của Bac.subtilis" là kết quả của quá trình nghiên cứu của Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS Trần Thị Xô, năm 2004 đã cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao nhất là tinh bột hoà tan và cazein. Thành phần nuôi cấy chủng Bac.subtilis ở quy mô phòng thí nghiệm bao gồm : pepton 1%, cao thịt 0.3%, muối 0.5%, tinh bột hoà tan 1.75%, cao nấm 0.1%. pH ban đầu bằng 6.5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ứng với môi trường tối ưu để Bac.sutillic sinh proteaza mạnh nhất là 35oC. CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và thiết bị 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu được sử dụng là cá cơm than được đánh bắt từ biển Quảng Nam -Đà Nẵng. Muối biển dạng hạt của Sa Quỳnh - Quảng Ngãi. Chủng vi khuẩn Bacillus subtillis C10 từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm - Huế. 2.1.2. Các hoá chất Hoá chất : Các hoá chất tinh khiết : K2HPO4, NaH2PO4.2H2O, foocmol 40%, cồn tuyệt đối, NaOH 0.1N, H2SO4 0.1N.Các chỉ thị màu: thimolphtalein, phenolphtalein, metyl đỏ. NaCl tinh khiết, cao nấm, agar-agar từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng . Pepton, cazein tinh khiết, tinh bột sắn, tinh bột tan, phế liệu tôm từ phòng thí nghiệm Hoá Sinh bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm_Sinh Học . Thiết bị : Máy li tâm : MIRRO 24R Tủ ổn định nhiệt, máy lắc từ, thiết bị thanh trùng, thiết bị màng lọc vô khuẩn, thiết bị phân tích đạm Kiendal, tủ lạnh đông –200C Máy đo pH, bút đo pH Các thiết bị xay thô, xay mịn, nghiền Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10-2, 10-4 Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm . 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 2.2.1. Quy trình thu nhận dịch chiết enzym : Qui trình thu nhận enzym proteaza từ Bacillus subtilis: Phối trộn môi trường pH=6 Thanh trùng 1210C 30phút Làm nguội về nhiệt độ phòng Nuôi tăng sinh 24h Bacillus subtilis Nuôi cấy vi khuẩn trong MTTƯCB Nuôi cấy vi khuẩn trong MTTT,pH=10 Ly tâm tách tế bào Dịch chiết enzym Các chế phẩm enzym được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác nhau. Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có chứa enzym được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đó không gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này. Cũng có nhiều trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzym tinh khiết với mức độ khác nhau tuỳ theo yêu cầu sử dụng . Qua tài liệu nghiên cứu về cách thu nhận proteaza vi sinh vật mà enzym được tiết ra môi trường ( nuôi theo phương pháp chìm ) thì để thu dịch enzym người ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi cach trường bằng cách ly tâm hoặc ép lọc với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa nếu cần thiết . Dựa vào các tài liệu đã nghiên cứu, tôi xây dựng qui trình thu nhận enzym để nghiên cứu như trên. Thuyết minh qui trình công nghệ : Hoạt hoá giống Bacillus subtilis ( nuôi cấy tăng sinh ): Giống Bacillus subtilis sau khi phân lập được giữ trong môi trường thạch nghiêng ở 50C. Trước khi đưa vào sản xuất enzym, giống này được hoạt hoá bằng cách chuyển vào 1ml môi trường tối ưu cơ bản trong ống nghiệm và nuôi cấy lắc 200vòng/phút, trong 24h, ở 350C. Chuẩn bị môi trường: Môi trường nuôi cấy Bac.subtilis có thành phần như sau: Pepton: 1% Cao thịt: 0,3% NaCl: 0,5% Cao nấm: 1% Tinh bột hoà tan: 1,75% Quá trình chuẩn bị môi trường để nuôi cấy trong phòng thí nghiệm được chuẩn bị như sau: + Hoà tan tất cả các thành phần của môi trường vào nước bằng cách đun sôi và điều chỉnh pH=6 bằng HCl. + Phân phối môi trường vào các bình tam giác 100ml, mỗi bình chứa 20ml. + Thanh trùng ở 1210C trong 30 phút. + Làm nguội môi trường về nhiệt độ phòng . Nuôi cấy sản xuất enzym: Chuẩn bị môi trường thay thế có thành phần như sau: Pepton: 0,5% Cao thịt: 0,05% NaCl: 0,5% Cao nấm:0,1% Tinh bột sắn: 5,5% Bột phế liệu tôm: 1,1% Quá trình chuẩn bị môi trường thay thế như sau: +Hoà tan tất cả các thành phần của môi trường vào nước bằng cách đun sôi và điều chỉnh pH=10 bằng HCl. + Phân phối môi trường vào các bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 200ml. + Thanh trùng ở 1210C trong 30 phút . + Làm nguội môi trường về nhiệt độ phòng. Quá trình nuôi cấy như sau: Cho giống tăng sinh vào nuôi trong môi trường thay thế với tỉ lệ giống là 1%.Quá trình nuôi được thực hiện trong tủ ấm có máy lắc 200vòng/phút, nhiệt độ 350C. Tách và tinh chế enzym: Dịch chiết enzym thô thu được bằng cách ly tâm lạnh ở 4000vòng/phút , ở nhiệt độ 40C, trong 10 phút . 2.2.2.Xác định hoạt độ enzym proteaza bằng phương chuẩn độ foocmol: 2.2.2.1.Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong các nhóm này để xác định hoạt độ enzym. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmol bao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ xác định. Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. Hoạt độ enzym được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau 1h ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin. 2.2.2.2.Hoá chất : Dung dịch đệm photphat có pH=6.5 Dung dịch cazein 1%, cân 1g cazein tinh khiết cho vào cốc thuỷ tinh 100ml với 12,5ml NaOH 0,1N, sau đó đặt cốc vào nồi cách thuỷ có nhiệt độ 66-700C, khuấy đều bằng đũa thuỷ tinh và giữ cho đến khi hoà tan hoàn toàn, để nguội và thêm dung dịch đệm photphat vào đến pH thích hợp. Chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức 100ml và thêm nước cất đến ngấn bình . Dung dịch thimolphtalein 1% trong cồn tuyệt đối. Hỗn hợp foocmol: cho 1ml thimolphtalein vào 50ml dung dịch foocmol 40% cho vài giọt dung dịch NaOH 0.1N đến khi dung dịch có màu xanh nhạt. 2.2.2.3.Cách tiến hành: Chuẩn bị 2 bình tam giác 100ml: Bình 1(thí nghiệm):cho vào 5ml dung dịch cazein trong đệm pH=6.5, thêm vào 1ml dung dịch proteaza và 4 ml nước cất, lắc đều và giữ ở 400C trong 30phút. Sau 30 phút lấy ra khỏi tủ ấm thêm 5ml hỗn hợp foocmol và 5 giọt dung dịch thimolphtalein 1% rồi chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0.1N đến khi xuất hiện màu xanh da trời. Bình 2(kiểm tra): cũng cho vào 5ml dung dịch cazein trong đệm pH=6.5, 5ml hỗn hợp foocmol, 1ml dung dịch proteaza và 4ml nước cất, 5 giọt dung dịch thimolphtalein 1%. Sau đó cũng chuẩn độ bằng NaOH 0.1N đến khi xuất hiện màu tương tự như ở bình 1. 2.2.2.4.Tính kết quả: Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là: HđP= đơn vị V1: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình thí nghiệm V2 : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình kiểm tra f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch dung dịch NaOH 0.1N t: thời gian enzym tác dụng, h V: thể tích dung dịch enzym đã dùng, ml 1,42: là số mg đạm amin tương úng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N 2.2.3.Phương pháp xác định nitơ foocmol: 2.2.3.1.Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở dụng foocmol bao vây nhóm amin và chuẩn độ nhóm carboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ dung dịch xác định. Từ lượng kiềm dùng chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. 2.2.3.2.Cách tiến hành: Hút chính xác 10 ml dung dịch nước mắm đã pha loãng 100 lần cho vào bình tam giác, cho vào 10ml dung dịch foocmol bão hoà, cho vài gọt thimolphtalein chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N cho đến khi có màu xanh da trời xuất hiện. Song song mẫu trên làm mẫu trắng thay dung dịch nước mắm bằng nước cất. Hàm lượng nitơ foocmol của 1lít nước mắm được tính theo công thức : X = V1 -Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml V2 -Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml 10 -Thể tích dịch lấy chuẩn 100 - Hệ số pha loãng 0,0014-số gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N 1000: hệ số quy đổi ra lít 2.2.4. Xác định hàm lượng nitơ amôniac: 2.2.4.1.Nguyên tắc: Trong thực vật, amôniac tự do chiếm một lượng không đáng kể .Trong các sản phẩm thực vật, NH3 có ở dạng tự do cũng như liên kết (chủ yếu là ở dạng muối của các axit hữu cơ), ở một số phẩm vật thực phẩm như thịt,cá, chao, nước mắm, các loại đồ hộp thịt cá…amôniac tích tụ một lượng khá lớn, thường tồn tại dưới dạng muối NH4Cl, (NH4)2SO4... Việc xác định nó có ý nghĩa đặc trưng cho mức độ hư hỏng của sản phẩm, để giải phóng NH3 ra khỏi dung dịch, người ta thường dùng các kiềm yếu ít tan trong nước như MgO, CaO. Cất amôniac ở nhiệt độ 35-400C và dưới áp suất thấp khoảng 15-20mmHg. 2.2.4.2.Hoá chất: NaOH 30%, H2SO4 0.1N, NaOH 0.1N. Thuốc thử: + Thuốc thử metyl đỏ + Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn tuyệt đối. 2.2.4.2.Cách tiến hành: Pha loãng dung dịch nước mắm: hút 1ml nước mắm cho vào bình định mức 50ml, cho nước cất để định mức đủ 50ml . Giai đoạn cất đạm : Dùng ống hút chính xác 50ml nước mắm đã pha loãng cho vào bình cất của máy cất đạm; 5giọt chỉ thị phenolphtalein và 10ml dung dịch NaOH 30% cho đến khi dung dịch trong bình cất có màu hồng. Hút 20ml axit H2SO4 0,1N cho vào bình nón, cho vào đó 1ml metyl đỏ, bình nón được đặt ở phía dưới sao cho hệ thống dưới ống sinh hàn phải ngập trong toàn bộ dung dịch trong bình tam giác . Tiến hành cất mẫu bằng cách đun sôi dung dịch trong bình cầu khoảng 1 giờ rồi dùng giấy quỳ thử xem NH3 hết chưa (giấy quỳ không đổi màu chứng tỏ NH3 đã hết ) Song song với quá trình trên làm với mẫu trắng hoàn toàn giống như trên nhưng thay nước mắm bằng nước cất. Giai đoạn chuẩn độ: lấy bình tam giác ra đưa đi chuẩn bằng NaOH 0.1N dung dịch chuyển từ màu tím nhạt sang màu vàng nhạt. Tính kết quả: Hàm lượng amoniac (X) được tính bằng g/l theo công thức sau : X = Trong đó : V1-Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml V2-Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml 50-Thể tích nước mắm pha loãng cho vào bình cất máy cất đạm 0,0014- gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N 1000:hệ số quy đổi ra lít 2.2.5. Xác định hàm lượng nitơ amin (đạm tan): Hàm lượng nitơ amin chính là hiệu số giữa nitơ foocmol và nitơ amoniac, đặc trưng cho lượng đạm tan trong dung dịch. CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thu nhận enzym từ Bacillus subtilis : 3.1.1.Hoạt hoá giống và quan sát một số đặc điểm hình thái của Bac.subtilis: Chủng vi khuẩn Bac.subtilis sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm -Huế. Sau một thời gian bảo quản thì tiến hành tuyển chọn lại giống nhằm mục đích đảm bảo yếu tố thuần khiết cũng như khả năng hoạt hoá của chúng . Để thu được chủng vi khuẩn Bac.subtilis thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi nó trên môi trường thạch-thịt-pepton trong 24h ở 300C.Rồi tiến hành phân lập lựa chọn dựa trên nguyên tắc pha loãng để tách từng khuẩn lạc riêng biệt. Để thuần khiết vi khuẩn Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng môi trường thạch-thịt-pepton, được hấp tiệt trùng 1210C trong 30 phút.Bằng phương pháp pha loãng thập phân canh trường chứa vi khuẩn như ở sơ đồ hình 1 đã mô tả. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thập phân lấy 0,1ml canh trường cho lên bề mặt của môi trường thạch trong mỗi hộp peptri. Dùng que trang dàn đều canh trường trên bề mặt thạch nhằm thu được các khuẩn lạc riêng rẽ. Các hộp peptri được nuôi trong 24h ở 350C, các khuẩn lạc xuất hiện thì đem ra quan sát. Khuẩn lạc mọc trên hộp peptri phụ thuộc vào độ pha loãng . Sơ đồ pha loãng như sau: Canh trường Vi khuẩn 9ml 9ml 9ml 9ml 9ml Bac.subtilis 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml Môi trường Thạch-thịt-pepton 1 2 3 4 5 Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và chọn giống Bảng 1:Một số đặc điểm về hình thái của khuẩn lạc Bac.subtillis trên môi trường thạch-thịt-pepton Độ pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Đặc điểm khuẩn lạc 10-6 Rất nhiều Các khuẩn lạc rất nhỏ, dính lại với nhau 10-7 98 7 khuẩn lạc dính lại với nhau 10-8 67 4 khuẩn lạc dính lại với nhau 10-9 42 Từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ 10-10 18 Từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ Sau khi nhận thấy ở hộp peptri số 5 các khuẩn lạc mọc riêng lẻ, chúng tôi tiến hành quan sát hình dáng khuẩn lạc : Màu sắc khuẩn lạc: màu trắng. Đặc tính bề mặt: trơn. Đặc tính mép khuẩn lạc: mép hình răng cưa. Sau đó chọn các khuẩn lạc còn trẻ, riêng biệt để cấy chuyền qua ống thạch nghiêng và được nuôi ở 300C trong 24h và được bảo quản ở 40C, sau một tháng thì cấy chuyền qua ống thạch nghiêng để giữ và bảo quản giống. 3.1.2.Khảo sát Bac.subtilis phát triển trên môi trường đĩa thạch: Bac.subtilis từ ống thạch nghiêng , chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát triển của nó trên môi trường đĩa thạch có thành phần môi trường sữa như đã trình bày ở phần phụ lục Sau khi Bac.subtilis được cấy trên đĩa thạch, chúng tôi tiến hành nuôi ở 300C trong 24h Nhận xét: Trên môi trường sử dụng, Bac.subtilis đã sử dụng nguồn cơ chất để sinh trưởng và phát triển. Bên cạnh quá trình sử dụng nguồn cacbon, nitơ có trong môi trường thì Bac.subtilis đã sinh tổng hợp proteaza làm thuỷ phân protein trong sữa . Chính vì vậy, ta thấy ở đĩa thạch có miền trắng đục do protein của sữa chưa bị thuỷ phân và miền trắng trong bao quanh khuẩn lạc do protein của sữa đã bị thuỷ phân , chỉ còn lại bề mặt của đĩa thạch. Hình ảnh Ta tiến hành nhuộm màu đĩa thạch trên với thuốc nhuộm amido black 10B để kiểm tra khả năng thuỷ phân của proteaza . Amido black 10B là một loại thuốc nhuộm có khả năng bắt màu với protein cho màu xanh, dựa vào đặc tính này người ta có thể xác định được vị trí của protein bị thuỷ phân trên đĩa thạch bằng cách đem nhuộm đĩa thạch trong dung dịch amido black 10B.Quá trình tiến hành như sau: Pha thuốc nhuộm trong dung dịch acid axetic 7% để đạt thuốc nhuộm có nồng độ 0,025%. Hút 5ml dung dịch thuốc nhuộm cho đều vào đĩa thạch trên. Để yên trong 24 giờ. Sau 24 giờ nhuộm màu ta thấy trên đĩa thạch có những vùng màu xanh và vùng trong suốt. Những vùng màu xanh là do trong sữa có cazein là protein chưa bị thuỷ phân nên nó bắt màu với thuốc nhuộm. Còn vùng trong suốt là vùng protein đã bị thuỷ phân ,do đó nó không bắt màu với thuốc thử. Hình ảnh 3.1.3.Khảo sát khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trên môi trường thay thế : Để thu được nguồn enzym dồi dào từ vi sinh vật, người ta phải nuôi cấy chúng trên các môi trường đặc hiệu. Về nguyên tắc, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzym: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu. Việc nghiên cứu sản xuất enzym bằng phương pháp bề mặt đã được tiến hành và cho kết quả tốt. Tuy nhiên, do sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt có nhiều nhược điểm hơn so với phương pháp nuôi cấy bề sâu. Chính vì vậy, trên thế giới việc sản xuất enzym theo phương pháp bề mặt chỉ chiếm 10%, còn lại 90% được thay thế bằng phương pháp chìm. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề sâu so với phương pháp nuôi cấy bề mặt: Tiết kiệm diện tích sản xuất. Dễ cơ giới hoá, loại bỏ được lao động thủ công, tạo năng suất cao. Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường , tránh được sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối canh trường ỳ rắn mà vi sinh vật không sử dụng được. Thu được enzym chứa ít tạp chất hơn. Đảm bảo được điều kiện vệ sinh và vô trùng, do đó hiện tượng nhiễm vi sinh vật lạ ít xảy ra hơn. Do những ưu điểm trên mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis trong môi trường lỏng. Khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm thì môi trường để vi khuẩn phát triển là môi trường lỏng. Thành phần môi trường thích hợp cho Bac.subtilis phát triển và sinh tổng hợp proteaza theo Đỗ Thị Bích Thuỷ bao gồm: pepton:0,5% ; cao thịt: 0,05%; NaCl: 0,5%;cao nấm: 0,1%; tinh bột sắn: 5,5%; bột phế liệu tôm: 1,1%; nước 1000ml; pH=10 Trong phương pháp nuôi cấy chìm , để đảm bảo điều kiện vô trùng thì phải thực hiện theo hai bước: Môi trường lỏng được tiệt trùng ở 1210C trong 30 phút . Quá trình cấy giống tiến hành trong điều kiện vô trùng. Sau khi cấy giống với tỉ lệ 2%, pH môi trường bằng 10 thì vi sinh vật được nuôi ở 350C. Quá trình nuôi được thực hiện trong máy lắc . Trong quá trình nuôi vi sinh vật ở những điều kiện như vậy, do môi trường ở dạng bán lỏng nên quá trình sinh tổng hợp enzym rất chậm, môi trường rất đục nên không thể kiểm tra động thái sinh trưởng và phát triển của Bac.subtilis mà chúng tôi chỉ tiến hành kiểm tra quá trình sinh tổng hợp enzym ngoại bào của nó . Để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzym ngoại bào của Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng phương pháp chuẩn độ foocmol ở thời điểm cách nhau 8 giờ. Dịch chiết enzym được thu nhận bằng cách lọc qua bông thấm nước . Dịch chiết enzym sau khi thu nhận được đánh giá hoạt lực proteaza. Về nguyên tắc , để đánh giá hoạt lực enzym bất kỳ có thể dựa vào tốc độ chuyển hoá của cơ chất hoặc tốc độ tích luỹ sản phẩm phản ứng sau một thời gian nhất định . Ở đây, để xác định hoạt lực enzym proteaza, chúng tôi dựa vào lượng sản phẩm tạo thành sau khoảng thời gian xác định.Theo mức độ thuỷ phân protein, nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng lên . Do đó dựa vào độ tăng một trong hai nhóm này để xác định hoạt độ enzym. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành xác định hoạt lực enzym proteaza theo phương pháp chuẩn độ foocmol, bằng cách cho dịch chiết enzym tác dụng với 5ml dung dịch cazein 1% trong thời gian 30 phút ở 300C. Dưới tác dụng của enzym proteaza , các nhóm acid amin giải phóng ra . Sau đó bao vây nhóm amin , còn chuẩn độ nhóm cacboxyl. Hoạt lực enzym càng cao thì hàm lượng acid amin càng lớn. Kết quả thu nhận được biểu diễn ở hình 2. Hình 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza của Bac.subtilis. Hoạt độ enzym ở đây được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành sau 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định, cũng có thể tính bằng đơn vị hoạt động enzym. HđP(1đvhđ/1ml): đơn vị hoạt động của enzym theo phương pháp chuẩn độ foocmol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau một giờ ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1 mg acid amin. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym proteaza tại các thời điểm khác nhau. Kết quả thu được biểu diễn ở hình 2. Dựa vào kết quả thu được chúng tôi nhận thấy rằng sau 88 giờ nuôi cấy thì Bac.subtilis có khả năng sinh tổng hợp proteaza là mạnh nhất .Hoạt lực enzym proteaza tại thời điểm đó là 5.68HđP. Trong khoảng thời gian 64giờ nuôi cấy thì khả năng sinh tổng hợp proteaza của Bac.subtilis cũng rất mạnh . Đây là giai đoạn sinh tổng hợp proteaza mạnh nhất trong suốt quá trình sinh tổng hợp của Bac.subtilis. Qua các nghiên cứu cho thấy rằng quá trình sinh tổng hợp proteaza diễn ra chủ yếu trong giai đoạn phát triển luỹ tiến của vi sinh vật. Ở giai đoạn này, vi sinh vật phát triển mạnh mẽ dẫn đến nhu cầu dinh dưỡng cao, cho nên nó phải sinh tổng hợp enzym mạnh để thuỷ phân cơ chất , tạo nhiều các chất dinh dưỡng để hấp thụ. Năm 1973, Conovalop đã kết luận rằng:"Sự phát triển tế bào và sự sản sinh enzym có liên quan chặt chẽ với nhau. Tế bào vi sinh vật sẽ sinh tổng hợp enzym ở các giai đoạn nhất định trong quá trình sinh trưởng. Tốc độ sinh tổng hợp enzym thường không đồng nhất với chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật". Sau 88 giờ thì hoạt lực proteaza của Bac.subtilis giảm dần, điều đó có thể giải thích rằng càng về cuối quá trình nuôi cấy thì hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đã cạn kiệt , vi sinh vật trải qua giai đoạn suy vong, nên khả năng sinh tổng hợp proteaza của nó cũng yếu dần. Như vậy, sau 88 giờ nuôi cấy trong môi trường thay thế có pH bằng 10 ở nhiệt độ 350C thì chúng tôi thu nhận được enzym proteaza từ Bac.subtilis có hoạt lực mạnh nhất. Không phải mỗi loài vi sinh vật chỉ sinh tổng hợp một loại enzym nhất định mà chúng có thể tổng hợp nhiều loại enzym khác nhau với hàm lượng không giống nhau và điều đó tùy thuộc vào phương pháp nuôi cấy và nhiều yếu tố khác. Năm 1988 và 1996, tác giả Đỗ Thị Giang và Lê Đức Mạnh dùng Bac.subtillis để sinh tổng hợp -amylaza theo phương pháp lên men bề mặt và phương pháp lên men bề sâu. Điều đó khẳng định một lần nữa trong tế bào vi sinh vật tồn tại nhiều hệ enzym khác nhau . Do đó tuỳ thuộc vào phương pháp và môi trường nuôi cấy mà ta có thể thu nhận được các loại enzym khác nhau. 3.1.4.Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện hoá lý đến hoạt tính của chế phẩm enzym proteaza từ Bac.subtilis: Cũng như các loại enzym khác, tốc độ phản ứng hay hoạt tính của enzym đều chịu sự tác động của của nhiệt độ , pH của môi trường, nồng độ của các ion trong môi trường , nồng độ chất kìm hãm, chất hoạt hoá, do đó hoạt lực của chế phẩm proteaza có thể tăng hoặc giảm. Tìm ra các điều kiện mà enzym có hoạt lực cao nhất gọi là điều kiện tối ưu cho enzym hoạt động . 3.1.4.1. Ảnh hưởng của NaCl đến hoạt tính của enzym proteaza : Qua rất nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy rằng khi nồng độ NaCl tăng thì hoạt lực của enzym giảm xuống. Do khi nồng độ muối cao sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu tác động lên cấu trúc phân tử enzym và cơ chất, làm ức chế phản ứng enzym. Để biết được mức độ ức chế , tốc độ giảm hoạt tính và nồng độ NaCl nào thì enzym proteaza bị ức chế hoàn toàn.Tôi đã bổ sung muối có các nồng độ 3%, 8%, 13%, 18%, 23%, 28%vào dịch chiết enzym, sau đó cho tác dụng với cơ chất cazein 1% trong 1giờ ở 300C, rồi dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để xác định hoạt tính của nó. Quá trình xử lý trong nước muối được tiến hành như sau: * Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml dun