Đồ án Nghiên cứu sử dụng môi trường dịch thể để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc

rong các ngành công nghiệp phi thực phẩm Trong công nghiệp dệt: Sợi thu được sau khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin. Chỉ cần một lượng nhỏ xerixin nằm lại trên tơ lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màu không đồng đều và khó trang trí lụa. Để tách lượng xerixin còn lại đó, ta dùng chế phẩm protease từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn. Trong kỹ nghệ phim ảnh: Protease vi khuẩn và xạ khuẩn được dùng để tái sinh các nguyên liệu cảm quang khác nhau như phim điện ảnh, giấy phim, phim Rơnghen, phim chụp máy bay... Trong công nghiệp da: Protease được dùng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi collagen. Khi xử lý bằng protease tính đàn hồi của da cũng tăng lên. Sử dụng protease cũng rút ngắn được quá trình tẩy lông, lượng lông thu được tăng lên 25÷30% so với phương pháp hoá học. Sử dụng enzyme trong công nghệ thuộc da tránh được độc hại cho công nhân, tránh được ô nhiễm môi trường. Trong công nghiệp dược phẩm và y học Protease được dùng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein của những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tụy tạng không bình thường, thiếu enzyme. Protease cũng được sử dụng để phân giải các chất hữu cơ trong cơ thể, chữa bệnh tắt tĩnh mạch. Protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôi cấy sinh vật để sản xuất chất kháng sinh, chất kháng độc... Ngoài ra còn dùng chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế huyết thanh kháng độc để chữa bệnh. Trong nông nghiệp: Protease dùng trong chăn nuôi để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thụ thức ăn của động vật hoặc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm. Trong nghiên cứu khoa học Protease được dùng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Trong thời gian gần đây người ta dùng chế phẩm protease không hoà tan bằng cách gắn vào những chất không tan như cellulose, sephadex, sepharose và các dẫn xuất của chúng: gel polyacrylamit, các polyme tổng hợp, bột thuỷ tinh, zeolit… Enzyme được giữ trên chất mang nhờ lực hấp phụ, lực liên kết hoá trị... để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong thực phẩm, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein. Ngoài ra protease còn được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt, thuốc đánh răng... làm cho da mịn, làm sạch cao răng, chữa viêm lợi và trong chừng mực nhất định có tác dụng diệt vi khuẩn. Trên đây ta thấy các protease được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, để có thể mở rộng hơn nữa phạm vi ứng dụng của nó cần tiếp tục nghiên cứu, cải tiến phương pháp tách và tinh chế nhằm giảm giá thành chế phẩm enzyme. Mặt khác để nâng cao hơn nữa hiệu suất sử dụng protease còn cần nghiên cứu kĩ hơn nữa về tính chất của chúng đặc biệt là tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng của chúng. Ưu điểm của vi sinh vật trong công nghiệp enzyme Enzyme cũng như protease nói riêng có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong các nguồn nguyên liệu này, vi sinh vật là nguồn thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính sau: Có thể chủ động nguồn nguyên liệu. Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, vào khoảng từ 16 – 100 giờ do đó ta có thể thu hoạch hàng trăm lần một năm và tốc độ sinh trưởng của chúng rất mạnh. Có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme. Có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau. Enzym thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao. Giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơn giản, rẻ tiền, dễ kiếm… Vi sinh vật là giới sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo qui mô công nghiệp. Tuy nhiên cần lưu ý là một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố, vì vậy cần có biện pháp xử lý thích hợp. So với protease thực vật và động vật, protease vi sinh vật có nhiều đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân riêng biệt và đa dạng. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp protease Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu từ năm 1960, mặc dù từ năm 1918, 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protease của xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm gần đây, số công trình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể hơn nhiều so với các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease của vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất enzyme và ứng dụng enzyme protease trong thực tế. Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Nhiều loại nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp một lượng lớn protease được áp dụng trong công nghệ thực phẩm là các chủng: Aspergillus. oryzae, Asp. terricola, fumigatus, Asp. satoi, Penicillium chrysogenum…Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tuỳ theo thành phần của môi trường. Ví dụ Asp. oryzae nuôi trong điều kiện bình thường sinh tổng hợp chủ yếu protease tính kiềm còn trong môi trường giảm gluxit thì chủ yếu tạo thành protease tính acid. Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào được nghiên cứu kĩ hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất trong qui mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau, trong công nghiệp và trong y học. Bảng 1.1: Bảng tóm tắt một số nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease [14, tr131] Tên nấm mốc Enzyme protease Asp. oryzae Asp. satoi Asp. awamori Asp. niger Asp. shirousami Asp. fumigatus Asp. candidus Asp. ochraceus Asp. sojae Asp. flavus Pen. janthinellum Pen. cyaneo fulvum Mucor pusillus Rh. Chinensis Rh. delema Rh. niveus Rh. nodous Rh. pseudokinensis Rh. Peka Phymatotrichum omnivorum Protease acid, protease trung tính và protease kiềm Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid và protease kiềm Protease acid Protease trung tính Protease kiềm Protease trung tính và protease kiềm Protease acid Protease kiềm Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Protease acid Aminopeptidase , cacboxypeptidase và một protease Các yếu tố hoá lý ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme protease ở vi sinh vật. Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật nói riêng cũng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như: độ ẩm môi trường, nhiêt độ nuôi, pH môi trường, độ thông khí, thành phần môi trường… Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Tùy từng vi sinh vật, nhiệt độ thích hợp có khác nhau: các loại nấm mốc phát triển thích hợp ở nhiệt độ 22-32OC, còn các vi khuẩn ở nhiệt độ cao hơn 36-55OC. Nói chung đa số vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Ảnh hưởng của pH môi trường Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật. Hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm mốc pH thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease vào khoảng 6 - 6,5. Các vi khuẩn phát triển tốt và tạo thành nhiều enzyme ở pH gần trung tính 6,6 - 7,4. Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự tích luỹ protease trong môi trường. Đáng lưu ý là pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật. PH ban đầu của môi trường thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh vật khác nhau không giống nhau. Đối với các nấm mốc, pH này vào khoảng 3,8 – 5,6, còn đối với vi khuẩn là 6,2 – 7,4. Độ thông khí của môi trường Độ thông khí của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo vi sinh vật. Trong một số trường hợp, thiếu oxy tuy có kiềm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trình tổng hợp protease. Lượng oxy thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau (Aleeva 1973-Aravina và tập thể năm 1976). Ngay cả đối với một số vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau (Crivova và tập thể năm 1977). Trong một số trường hợp, sự hiếu khí mạnh lại kiềm hãm tổng hợp protease. Ảnh hưởng của thành phần môi trường Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp, chọn tỷ lệ nồng độ thích hợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng các chất cảm ứng vì protease là enzyme cảm ứng. Đối với một vi sinh vật nhất định, điều kiện thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp các enzyme khác nhau thì không giống nhau. Nắm vững các qui luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinh vật sinh tổng hợp định hướng một loại enzyme xác định. Ảnh hưởng của nguồn cacbon: Nguồn cacbon thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường dùng là các glucid: mono – di và cả polysacarit. Các chất này ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật. Đặc tính tác dụng của nguồn cacbon tuỳ thuộc vào bản chất hoá học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn cacbon và nitơ tự nhiên thường dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mỳ, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Trong số monosacarit, glucose ảnh hưởng rất khác nhau đến quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như sinh tổng hợp protease. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Các chất có thể dùng làm nguồn nitơ trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ (protein và các sản phẩm thuỷ phân của chúng) hoặc các muối vô cơ (muối amôn, muối nitrat). Nhiều vi sinh vật còn có thể sử dụng cả nitơ của HNO3, HNO2. Nồng độ dạng nitơ trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt và có quy luật đến quá trình tổng hợp protease ngoại bào ở vi sinh vật. Nguồn nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein… Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon, nitơ thích hợp còn cần phải chải chọn tỷ lệ thích hợp giữa C : N. Bên cạnh đó photpho và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình sinh tổng hợp protease. Ngoài các yếu tố kể trên các nguyên tố vi lượng (Steiner 1961), NaCl (Kovaleva và tập thể 1977), vitamin (Emxêva 1975) và một số yếu tố khác (Aravina và tập thể 1977) cũng có ảnh hưởng đến lượng protease trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật [14, tr144]. Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận enzyme Để thu được enzyme, có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật: phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu hay còn gọi là phương pháp chìm. Trong phương pháp nuôi bề mặt, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn. Còn phương pháp nuôi chìm, vi sinh vật phát triển trên môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục. Cả hai phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng. Tuy nhiên phương pháp bề mặt không phù hợp trong sản xuất công nghiệp, chỉ sử dụng trong một số nhà máy sản xuất enzyme dưới dạng canh trường. Trong khi đó phương pháp bề sâu được sử dụng rộng rãi để sản xuất các chế phẩm enzyme tinh khiết. Do đó tuỳ theo đặc điểm công nghệ cũng như yêu cầu của sản phẩm mà chọn phương pháp nuôi cho phù hợp. 1.3. Các kết quả nghiên cứu đã được công bố của Việt Nam và thế giới Kết quả nghiên cứu của Lê Văn Việt Mẫn, Nguyễn Văn Hồng - Trường Đại Học Bách Khoa TP Hồ Chí Minh: “Xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm sợi Asp. oryzae tổng hợp protease theo phương pháp bề sâu”. Tác giả đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp hai để xác định mối quan hệ định lượng giữa hàm lượng bột đậu nành, hàm lượng và hoạt tính protease chất chiết nấm men thu được trong phương pháp nuôi cấy bề sâu chủng nấm sợi Asp. oryzae NT-1. Một số điều kiện nuôi cấy với quy mô phòng thí nghiệm như sau: nhiệt độ 30OC, tỷ lệ giống 178 mg chất khô bào tử cho 1l môi trường, tốc độ lắc 350 vòng/phút và thời gian nuôi cấy là 54h. Chế phẩm enzyme thô thu được có hoạt tính protease là 0.95đvhđ/ml. hoạt tính riêng là 5.35đvhđ/mg protein. Các nghiên cứu đang được tiếp tục thực hiện bao gồm việc nuôi cấy nấm sợi với quy mô lớn hơn, tinh sạch enzyme, xác đinh các tính chất của enzyme và thử ứng dụng chế phẩm trong công nghiệp hoá học và thực phẩm [14]. Báo cáo khoa học của KS. Nguyễn Văn Hồng _Phân Viện KTTV&MT phía Nam (2004), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme protease dùng thay thế một số chất xúc tác hoá học trong công nghiệp”. Kết quả cho thấy thành phần môi trường thích hợp để nấm mốc Asp. oryzae phát triển và sinh tổng hợp protease là môi trường lỏng có thành phần như sau: dexterin là 2.5g, bột đậu nành: 5g, saccharose: 3g, Na2CO3: 0.9g, NaHCO3: 0.3g, Na3PO4: 0.3g, chất chiết nấm men: 0.1g, nước: 100ml. [17] 3. “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩu phần ăn của bò vắt sữa và bê sâu cai sữa” của TS. Đinh Văn Cải_ Viện KHKTNN MN (1999 – 2001). Kết quả đã tạo ra chế phẩm BiO-D cho bò sữa và BiO-C cho bê sau cai sữa, với tỷ lệ pha trộn khác nhau dựa trên 3 thành phần nấm mốc, nấm men, vi khuẩn. Nấm mốc dùng sản xuất sinh khối bã khoai mì giàu cellulase, amylase, protease, lipase; Nấm men đưa vào rỉ mật tạo sinh khối giàu đường, đạm, acid amin; Vi khuẩn sống cho tác động lên cám, đậu nành để tạo sinh khối giàu protease và amylase. [16] CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và hoá chất và thiết bị Nguyên liệu bao gồm: cơm (gạo), vỏ cam, chanh, đất. Hoá chất bao gồm: Các hoá chất tinh khiết: NaNO3, KH2PO4, K2HPO4, KCl, MgSO4.7H2O, FeSO4.6H2O, saccharose, glucose, dextrin, Na2CO3, CaCO3, NaHCO3, Na3PO4, phenol tinh thể, acid lactic đậm đặc, glyxerin, nước cất, gelatin, foocmol 40%, cồn tuyệt đối, NaOH, H3PO4 0.1N, NaCl, Na2HPO4.2H2O, HCl, acid acetic, CH3COONa. Chỉ thị màu: thimolphtalein. Cao nấm men, peptone, agar-agar, bột đậu nành. Thiết bị : Tủ ổn định nhiệt, máy lắc, thiết bị thanh trùng, tủ cấy vô trùng, tủ lạnh, máy đo pH, giấy pH. Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10-2, 10-4 Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm . Phương pháp nghiên cứuThu nhận các chủng nấm mốc làm đối tượng nghiên cứu Phương pháp vi sinh Phương pháp chuẩn bị môi trường dinh dưỡng, môi trường phân lập, môi trường lên men Định lượng thành phần môi trường rồi tiệt trùng ở chế độ theo yêu cầu đối với từng loại môi trường. Phương pháp phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease Nguồn phân lập: Môi trường cơm: ký hiệu R. Vỏ cam, chanh: ký hiệu F. Đất: ký hiệu S. Môi trường phân lập và bảo quản giống: MT1 [phụ lục 1]. Quy trình phân lập: Canh trường phân lập (R, F, S) Xử lý (R, F: ủ mốc) Thu mẫu Pha loãng Phân lập trên môi trường MT1 [phụ lục 1] Nuôi trong tủ ấm (ở 30OC trong 4 ngày) Tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao: Để tuyển chọn loài vi sinh vật có hoạt tính protease cao, ta dùng môi trường sữa. Cấy nấm mốc vào các hộp petri có chứa môi trường trên thành từng chấm, nuôi ở 30OC sau 2, 3, 4 ngày hoặc lâu hơn rồi đem quan sát. Protease được tạo thành sẽ thuỷ phân casein của sữa nên vòng thuỷ phân hoàn toàn trong suốt, còn môi trường sữa thì trắng đục nên ta dễ dàng đo đường kính vòng thuỷ phân (D) và đường kính khuẩn lạc (d). Chủng nào cho tỷ lệ D/d càng lớn tức có khả năng sinh tổng hợp protease cao. Phương pháp bảo quản giống: cấy truyền trên ống thạch nghiêng, nuôi rồi sau đó bảo quản ở nhiệt độ 2 – 4 OC khoảng 15 ngày hay một tháng thì phải cấy truyền lại. Phương pháp hoá lý Xác định pH của dung dịch: Bằng pH metre. Xác định nhiệt độ: Bằng nhiệt kế bách phân. Xác định độ ẩm: Bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Xác định tốc độ lắc: Thông qua máy lắc vi sinh có thổi không khí tiệt trùng. Phương pháp hoá sinh Xác định hoạt độ protease bằng phương pháp chuẩn độ foocmol Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong các nhóm này để xác định hoạt độ enzyme. Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmol bao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ xác định. Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tương ứng. Hoạt độ enzyme được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điều kiện nhiệt độ và pH xác định. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme mà sau 1h ở 300C và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin. Tính kết quả: Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là: HđP = (đvhđ/ml) V1: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn bình thí nghiệm V2 : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng để chuẩn bình kiểm tra f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch NaOH 0.1N (f = 1.2) t: thời gian enzyme tác dụng (h) V: thể tích dung dịch enzyme đã dùng (ml) 1.42: là số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N Phương pháp toán học Xử lý số liệu thống kê, quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa hàm mục tiêu. Để tối ưu hóa hàm mục tiêu, trong nghiên cứu này, ta sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo phương án trực giao cấp một hai yếu tố để xác định sự ảnh hưởng đồng thời của hai yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp protease của nấm sợi. Ngoài ra, phương pháp này còn giúp đánh giá có định lượng về mức độ ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp protease. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng số thí nghiệm có chọn lọc, ít nhất mà vẫn diễn tả được nhiều nhất sự ảnh hưởng của các yếu tố đã chọn. Trong phạm vi nghiên cứu của đề tài, tiến hành quy hoạch theo mô hình trực giao cấp một hai yếu tố: pH của môi trường và thời gian nuôi cấy. Phương trình hồi quy trong trường hợp này có dạng: Y = b0 + b1x1 + b2x2 + b12x1x2 Trong đó: Y: hoạt lực enzyme protease tích lũy trong môi trường. bi, bij: các hệ số hồi quy. x1, x2: các biến số. Quá trình phân tích, xử lý toàn bộ kết quả thực nghiệm cho phép xác đinh các hệ số và sự tương thích của phương trình. Sau đó tiến hành tối ưu hóa thực nghiệm theo phương án đường dốc nhất đứng (građien) để tìm điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp protease. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập nấm mốc từ nguồn R, F, S Sơ đồ quy trình thí nghiệm: Bảo quản giống (2 – 4OC) Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme protease bằng phương pháp xác định vòng thủy phân Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nhiệt độ, tốc độ lắc và môi trường lên men) đến khả năng sinh tổng hợp enzyme protease Tối ưu hóa một số điều kiện cần thiết để thu nhận enzyme protease từ nấm mốc trong môi trường dịch thể Thu nhận các chủng nấm mốc làm đối tượng nghiên cứu Tuyển chọn (nhiều lần phân lập) Khảo sát đặc điểm của khuẩn lạc nấm mốc 3.1. Kết quả phân lập nấm mốc từ nguồn R, F, S Để sản xuất chế phẩm enzyme người ta có thể dùng các giống vi sinh vật phân lập được trong tự nhiên hoặc các giống đột biến đã được lựa chọn. Do đó ta tiến hành phân lập nấm mốc từ các nguồn R, F và S trên môi trường đặc hiệu MT1 [phụ lục 1]. Sau đó tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease cao. Sở dĩ ta chọn các nguồn trên để phân lập tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp protease vì đây là những nguồn có chứa nhiều chủng thuộc giống Aspergillus, Mucor và Pennicillium_ những giống có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease mạnh. Kết quả phân lập được 5 chủng từ nguồn R được ký hiệu: R1, R2, R3, R4 R5, R5; 5 chủng từ nguồn F được ký hiệu F1, F2, F3, F4, F5 và 4 chủng từ nguồn S được ký hiệu: S1, S2, S3, S4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chúng sau khi nuôi 4 ngày trên môi trường MT1được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập được Số thứ tự Ký hiệu chủng nấm mốc Đặc điểm khuẩn lạc sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường MT1 ở nhiệt độ 30OC Số lượng khuẩn lạc (cùng độ pha loãng) Hình dạng khuẩn lạc Kích thước khuẩn lạc (mm) Bề mặt khuẩn lạc Màu sắc bào tử 1 R1 Dạng tròn, hệ sợi 35 sần sùi, sợi tơ Màu xám đen 5 2 R2 Dạng tròn, hệ sợi 26 sần sùi, sợi tơ Màu vàng hoa cau 8 3 R3 Dạng rễ cây, hệ sợi 32 sần sùi, sợi tơ Màu nâu 6 4 R4 Dạng tròn, hệ sợi 25 sần sùi, sợi tơ Màu xanh lá cây 9 5 R5 Dạng tròn, hệ sợi 22 sần sùi, sợi tơ Màu xám xanh 17 6 F1 Dạng không đều, hệ sợi 29 sần sùi, sợi tơ Màu xanh rêu 7 7 F2 Dạng tròn, hệ sợi 26 sần sùi, sợi tơ Màu xanh lá cây 6 8 F3 Dạng rễ cây, hệ sợi 31 sần sùi, sợi tơ Màu nâu 5 9 F4 Dạng rễ cây, hệ sợi 30 sần sùi, sợi tơ Màu đen 2 10 F5 Dạng tròn, hệ sợi 21 sần sùi, sợi tơ Màu xanh rêu 9 11 S1 Dạng tròn, hệ sợi 5 sần sùi, sợi tơ Màu xám đen 1 12 S2 Dạng tròn, hệ sợi 4 sần sùi, sợi tơ Màu nâu 2 13 S3 Dạng tròn, hệ sợi 5 sần sùi, sợi tơ Màu trắng 1 14 S4 Dạng tròn, hệ sợi 5 sần sùi, sợi tơ Màu đen 1 Nhận xét: Như vậy trên cùng một loại môi trường (MT1), trong cùng điều kiện nuôi cấy, phân lập, từ các nguồn R (cơm), F (vỏ cam, chanh), S (đất), ta có thể phân lập được nhiều chủng nấm mốc với đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau. Dựa trên sự khác nhau về kích thước, số lượng khuẩn lạc, có thể nhận thấy các chủng nấm mốc: S1, S2, S3, S4 có số lượng rất ít, kích thước nhỏ hơn nhiều so sới các chủng khác. Như vậy các chủng nấm mốc từ đất có tốc độ sinh trưởng, phát triển chậm hơn từ nguồn cơm và nguồn vỏ cam, chanh. Vì thế ta không chọn chủng này để làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo. Theo lý thuyết và một số tài liệu tham khảo [18], dựa vào đặc điểm khuẩn lạc hệ sợi nấm và đặc biệt là màu sắc bào tử, ta có thể nhận thấy các chủng nấm mốc R1, R2, R3, R4, R5, F1, F2, F3, F4, F5 với các màu sắc từ xanh rêu, vàng hoa cau, nâu đen…có thể có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease nếu như được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc ở những điều kiện thích hợp. Do đó ta chỉ tiến hành khảo sát khả năng sinh enzyme trên các chủng được phân lập từ nguồn R và F. Sau đây là một số hình ảnh về các các ống giống từ các chủng phân lập được từ nguồn R và F: R5 R4 R2 R3 R1 Hình3.1: Các chủng được phân lập từ nguồn R F5 F4 F3 F2 F1 Hình 3.2: Các chủng được phân lập từ nguồn F Kết quả tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao Tiến hành tuyển chọn sơ bộ các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease cao từ các chủng phân lập được theo phương pháp đo đường kính vòng thủy phân trên môi trường thạch sữa. Sau khi nuôi 3 ngày ta bắt đầu đo đường kính vòng thuỷ phân D và đường kính khuẩn lạc d. Cứ tiếp tục đo D, d trong các ngày tiếp theo. Kết quả tuyển chọn được 2 chủng có hoạt tính enzyme protease cao: R5 và F1, cho tỉ lệ D/d đạt giá trị cực đại sau 6 này nuôi được thể hiện ở bảng 3.1, còn các chủng còn lại không tạo vòng thủy phân: Bảng 3.2: Bảng đo đường kính vòng thủy phân và đường kính khuẩn lạc của chủng F1 và R5 Tên chủng D (mm) d (mm) D/d F1 44 39 1.1282 R5 55.5 50 1.0700 Nhận xét: Trong 10 chủng phân lập được từ R và F chỉ có hai chủng R5 và F1 tạo vòng thủy phân tức có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease, các chủng còn lại thì không có khả năng đó. Do đó ta chọn hai chủng này để khảo sát tiếp theo. Chủng F1 có D/d lớn hơn so với chủng R5, điều này chứng tỏ chủng F1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease mạnh hơn chủng R5 trên môi trường thạch sữa Sau đây là một số hình ảnh mô tả khả năng thủy phân protein sữa của hai chủng F1 và R5: Hình 3.3: Vòng thuỷ phân protein sữa của chủng F1 trên môi trường thạch sữa Hình 3.4: Vòng thuỷ phân protein sữa của chủng R5 trên môi trường thạch sữa 3.3. Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng F1 và R5 Hình thái khuẩn lạc của chủng F1 và R5 Có thể nói màu sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho từng chủng, giống nấm mốc khác nhau. Do đó ta cần khảo sát hình thái khuẩn lạc cụ thể của F1 và R5 để phỏng đoán sơ bộ chúng thuộc giống mốc nào. Kết quả thể hiện qua hình 3.5 và hình 3.6. Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của F1 sau 4 ngày nuôi