Đồ án Nghiên cứu sử dụng nấm phanerochaete chrysosporium phân hủy chất thải rắn hữu cơ làm compost

ả những cấu trúc này. Nấm mục trắng đã giải quyết vấn đề này bằng sự tạo ra những enzyme có tính chuyên hoá thấp để khởi đầu những phản ứng oxy hoá trong lignin. Những bước khởi đầu trong sự depolymer hoá lignin bằng nấm mục trắng được xúc tác bằng enzyme không chuyên hoá dẫn tới một chuỗi phản ứng đa dạng. Sự oxy hoá không chuyên hoá của lignin được Kirk và Farrell gọi là quá trình “đốt cháy bằng enzyme”. Đến năm 1928, những nghiên cứu cho thấy tất cả các nấm mục trắng có hoạt động phenoloxidase ngoại bào. Kể từ phát hiện đó, vai trò của phenoloxidase (gồm peroxidase và laccase) trong sự phân hủy lignin được tranh luận nhiều hơn. Một nghiên cứu kỹ về những enzyme ngoại bào kết hợp với sự phân hủy lignin dẫn tới sự khám phá ra peroxidase ngoại bào ở Phanerochaete chrysosporium. Ngày nay người ta cho rằng hệ thống phân hủy lignin trong Phanerochaete chrysosporium bao gồm một tập hợp các enzyme là lignin peroxidase, manganese peroxidase và những enzyme tạo ra H2O2. Ngoài ra còn có một enzyme phân hủy lignin khác là laccase không được tạo ra bởi Phanerochaete chrysosporium nhưng được hình thành do nhiều nấm mục trắng khác. Năm 1983, có 2 nhóm nghiên cứu công bố về sự khám phá ra hoạt động của một enzyme ngoại bào đòi hỏi sự có mặt của H2O2 gọi là lignin peroxidase. Lignin peroxidase được mô tả là một glycoprotein chứa khoảng 15% carbohydrate và một nhóm phụ protoporphyrin sắt IX (heme). Lignin peroxidase có trọng lượng phân tử 41.000-42.000 và pH tối thích = 2; dưới pH này, enzyme không ổn định. Họ lignin peroxidase chứa nhiều isozyme, số lượng isozyme khác nhau đối với từng chủng nấm, điều kiện nuôi cấy và kỹ thuật tinh sạch, kỹ thuật phân đoạn. Hoạt độ của enzyme này được đo bằng sự oxy hoá veratryl alcohol cho ra veratraldehyde ở bước sóng 310nm. Lignin peroxidase không có cơ chất chuyên biệt, nó có thể oxy hoá những hợp chất lignin và liên quan đến lignin (có rượu hay không rượu), kết quả là phân cắt nối carbon α và carbon β, nối aryl carbon α, mở vòng thơm, oxy hoá rượu và demethoxyl hoá. Enzyme rất mẫn cảm nên dễ bị bất hoạt bởi H2O2 và hoạt động của nó cũng dễ bị ức chế bởi những thành phần của môi trường lignocellulose như acid ferulic. Veratryl alcohol tăng cường hoạt động của lignin peroxidase trên nhiều cơ chất lignin bằng cách hoạt động như một chất trung gian hay bằng cách bảo vệ enzyme chống lại sự bất hoạt. Hệ thống enzyme của sự phân hủy lignin đại phân tử phải đương đầu với nhiều khó khăn mới có thể hoạt động. Cơ chất là một polymer lớn không tương đồng đòi hỏi phải được tấn công bằng những tác nhân hoặc enzyme ngoại bào. Lignin không chứa những liên kết có thể thủy phân, điều này có nghĩa là các enzyme phải là enzyme oxy hoá. Những enzyme ngoại bào liên quan đến sự phân hủy lignin là lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP), laccase. Thêm vào đó là các enzyme sản xuất ra hydrogen peroxide; glyoxal oxidase (GLOX) và aryl alcohol oxidase (AAO) thuộc nhóm này. LiP và MnP là những glycoprotein chứa haem, chúng cần hydrogen peroxide như một chất oxy hoá. Đa số nấm tiết ra nhiều isoenzyme vào môi trường nuôi cấy chúng. LiP oxy hoá những cấu trúc phụ nonphenolic lignin bằng cách lấy một điện tử và tạo ra những gốc cation và rồi những gốc này bị phân hủy hoá học. MnP oxy hoá Mn(II) thành Mn(III) và rồi oxy hoá những vòng rượu thành những gốc phenoxyl dẫn tới sự phân hủy các hợp chất. Những nghiên cứu trên nhiều nấm mục trắng khác nhau cho thấy MnP xuất hiện nhiều hơn LiP. Trong những năm gần đây, những đặc điểm và vai trò của MnP đã được nghiên cứu rộng rãi. MnP có vai trò chủ yếu trong sự depolymer hoá lignin và chloro-lignin cũng như demethyl hoá lignin và làm trắng bột giấy. Nếu có sự hiện diện của những acid hữu cơ phù hợp thì MnP có thể khoáng hoá một số lượng lớn lignin và những hợp chất kiểu lignin. Bảng 2.2 Các enzyme liên quan đến sự phân hủy lignin và những phản ứng chính:  Enzyme Phần phụ hay cơ chất, chất môi giới Phản ứng hay ảnh hưởng chính Lignin peroxidase ( LiP) H2O2, veratryl alcohol. Oxy hoá vòng thơm thành gốc cation. Manganese peroxidase (MnP) H2O2, Mn, acid hữu cơ như chelator, thiols, các lipid không bão hoà. Oxy hoá Mn(II) thành Mn(III), oxy hoá chelated Mn(III) các hợp chất phenolic thành các gốc phenoxyl; các phản ứng khác với sự hiện diện của các hợp chất thêm vào. Laccase (Lacc) O2, các chất môi giới như hydroxybenzotriazole hay ABTS. Phenol bị oxy hoá thành những gốc phenoxyl; những phản ứng khác với sự hiện diện của những chất môi giới. Glyoxal oxidase (GLOX) Glyoxal, methyl glyoxal. Oxy hoá glyoxal thành acid glyoxylic; sản xuất ra H2O2. Aryl alcohol oxidase (AAO) Rượu thơm (anisyl, veratryl alcohol) Oxy hoá rượu thơm thành aldehyde; sản xuất ra H2O2. Một số enzyme tạo ra H2O2 Nhiều hợp chất hữu cơ. Khử thành H2O2 Laccase là một oxidase chứa đồng, nó sử dụng oxy phân tử như chất oxy hoá, và nó cũng oxy hoá vòng phenol thành những gốc phenoxyl. Nó cũng có khả năng oxy hoá những hợp chất không rượu dưới những điều kiện nào đó, ví dụ phản ứng được bổ sung ABTS hay những phân tử trung gian khác. Đa số nấm mục trắng có thể sản xuất ra laccase. Sự phân tích hệ thống phát sinh loài của nấm mục trắng và các nấm đồng đảm (homo-basidio) khác dựa vào trình tự DNA ribosom có thể cho những hiểu biết mới về những mối quan hệ của những hệ thống phân hủy lignin khác nhau. Sự sản xuất ra LiP có thể là tiêu biểu cho nấm mục trắng, nhưng các chủng được phân loại vào nhóm Euagarics như Pleurotus osteatus, Agaricus bisporus thì thường sản xuất ra MnP và laccase và ít sản xuất ra LiP. Hầu như tất cả nấm mục trắng đều sản xuất ra MnP và laccase nhưng chỉ một số nấm mới có thể sản xuất ra LiP trong khi chỉ có enzyme này mới có thể tấn công các cấu trúc phụ nonphenolic của lignin. 2.5.2 Xạ khuẩn: 2.5.2.1 Vị trí của xạ khuẩn trong VSV Trước thế kỷ 19 người ta xếp xạ khuẩn vào nấm. Về sau do nghiên cứu sâu hơn người ta mới thấy chúng có nhân nguyên thủy, có kích thước nhỏ bé như vi khuẩn nên xếp vào vi khuẩn thật. Năm 1978 Gibbens và Murray chia các vi khuẩn nhân nguyên thủy thành 4 ngành: ngành Gracilicutes (gồm các vi khuẩn gram âm), ngành Tenericutes (gồm xạ khuẩn và các vi khuẩn gram dương), ngành Mendosicutes (gồm các vi khuẩn mà thành tế bào không chứa peptidoglican) và ngành Mollicutes (gồm các vi khuẩn chưa có thành tế bào) Năm 1977 và 1980 Woese và cộng sự chia vi khuẩn nhân nguyên thủy thành 2 giới: giới vi khuẩn thật (Eubacteria) tương đương với 3 ngành Gracilicutes, Tenericutes và Mollicutes theo Gibbens và Murray, giới vi khuẩn cổ (Archaebacteria) tương đương với ngành Mendosicutes. 2.5.2.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là nhóm vi khuẩn thật(Eubacteria). Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces). Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony-forming unit) xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu. Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai koại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh. Đường kính khuẩn ti xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0.2 – 1.0 µm đến 2 - 3µm Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores). Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores). Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn. Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất. Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và thường tạo nhiều bào tử. Thậm chí một số loại xạ khuẩn còn hình thành túi bào tử như chi Streptosporangium, Micromonospora và bào tử di động như chi Actinoplanes, Kineosporia. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm. Xạ khuẩn xuất hiện khi trong khối ủ có bổ sung 1/3 rơm rạ, khi nhiệt độ khối ủ tăng lên là khi xạ khuẩn phát triển mạnh. Hình 2.10: Một số chi xạ khuẩn: A-Microtetraspora B- Planomonospora C- Actinosynnema D- Actinobispora E- Saccharothrix F- Crosiella. Đặc tính của xạ khuẩn là khả năng tiết kháng sinh (antibiotic), dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và cây trồng. Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ. Xạ khuẩn còn có khả năng tiết ra các enzym (proteas, amylaz...) và trong tương lai có thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm và vi khuẩn vì nấm có thể sinh ra aflatonxin độc cho người và gia súc. 2.5.3 Nấm Trichoderma: 2.5.3.1. Nguồn gốc và phân loại Nấm được xem là nhóm nguyên sinh động vật đa bào, không quang hợp và dị dưỡng. Hầu hết các loại nấm có khả năng phát triển trong điều kiện có độ ẩm thấp, là điều kiện không thích hợp cho vi khuẩn. Thêm vào đó, nấm có thể chịu được môi trường có pH khá thấp. Giá trị pH tối ưu cho hầu hết các nhóm nấm vào khoảng 5, 6; nhưng giá trị pH cũng có thể dao động trong khoảng 2 – 9. Quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật này là quá trình hiếu khí chúng phát triển thành các sợi dài gọi là sợi nấm tạo thành từ nhiều tế bào có nhân và có chiều rộng thay đổi trong khoảng từ 4 – 20 µm. Do nấm có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ trong nhiều điều kiện môi trường thay đổi rất rộng, nên chúng được sử dụng rộng rãi. Trichoderma là chi khá phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong môi trường đất. Theo Gary J. Samuels, Trichoderma ít tìm thấy trong thực vật sống và chúng không sống nội ký sinh với thực vật. Ngày nay, hệ thống phân loại của nấm Trichoderma vẫn chưa rõ ràng và khá phức tạp, do đó có nhiều ý kiến khác nhau đưa ra khi phân loại giống nấm này. Theo Rifai (1969), Barnett H.L v Barry B. Hunter (1972), Trichoderma spp thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes (fungi imperfect); thứ tự vị trí phân loại như sau: Giới : Nấm Ngành : Ascomycota Lớp : Deuteromycetes (nấm bất toàn) Bộ : Moniliales Họ : Moniliaceae Giống : Trichoderma spp - Hiện nay, nấm Trichoderma được tìm thấy ít nhất 33 loài. Các loài có hoạt tính xenlulaza cao như Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum và Trichoderma viride thuộc họ Deuteromycetes, bộ Moniliales. Hình 2.11: Nấm Trichoderma 2.5.3.2. Đặc điểm sinh hóa Trichoderma có thể sinh rất nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylase, lipase, pectinase, cellulase, protease, … để phân hủy xác thực vật và tế bào nấm bệnh trong đời sống hoại sinh và ký sinh của chúng. Sau đây là một số hệ enzyme điển hình ở Trichoderma. Cellulose là chất trùng hợp với tiểu đơn vị là D-glucose nối nhau bởi liên kết beta-1,4-glycosidic, cellulose được sử dụng như một nguồn năng lượng carbon ở rất nhiều vi sinh vật tiết ra cellulase. Hình 2.12: Công thức cấu tạo của cellulase Hệ enzyme cellulase ở Trichoderma spp được phân thành ba lớp: Beta-1,4-D-glucanase (cellobiohydrolase) giải phóng đơn vị cellobiosyl từ chuỗi cellulose. Endo-1,4-D-glucanase phân cắt liên kết glucosidic bên trong cấu trúc cellulose. Beta-1,4-D-glucanase phân cắt cello-oligosaccharide thành glucose khử. Quá trình thuỷ phân cellulose có sự phối hợp của ít nhất 1 enzyme chlobiohydrolase, hai enzyme endoglucanase và một enzyme beta-glucosidase (Hui et al. 2001), Trichoderma reesei RUT C30 được biết là chủng có khả năng tạo nhiều cellulase, Trichoderma hazianum T3 cũng là một chủng rất hiệu quả khi sử dụng để kiểm soát đối với Pythium, chủng này được biết cũng tạo nhiều loại enzyme cellulase. Chitin polysaccharide có nhiều trong tự nhiên, chúng tham gia trong hầu hết cấu trúc polyme ở nấm và côn trùng, công thức hóa học: [C8H13NO5]n. Chitin có cấu tạo và chức năng gần giống với cellulose, trong tự nhiên, chitin là chất hữu cơ chiếm thứ hai sau cellulose về số lượng, chitin thay thế một phần hay toàn bộ cellulose trong thành tế bào của một số loài thực vật. Chitin là chất rắn vô định hình, không tan trong nước và hầu hết các acid, alcol, dung môi hữu cơ khác. Tuy nhiên, chitin có thể bị thủy giải bởi acid vô cơ mạnh (HCl đậm đặc) hoặc bằng enzyme vi sinh vật. Enzyme chitinase l thủy giải chitin, chitinase xúc tác cắt liên kết C1 và C4 của 2 đơn vị: beta-1,4-N-acetylglucosamine (GlcNac). Hệ enzyme chitinase được phân thành 3 lớp (Sahai và Manocha, 1992): Chitobiosidase: enzyme này giải phóng đơn vị diacetylchitobiose. Endochitinase: phân cắt liên kết bền trong cấu trúc chitin ở vị trí bất kì, phóng thích các loại đường đa như chitotetraose, chitotriose,diacetylchitobiose; endochitinase được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình kí sinh nấm. Beta-1,4-N-acetylglucosaminedase: phân cắt chitotetraose, chitotriose, diacetylchitobiose thành GlcNac monomer. Glucosamine là sản phẩm phân giải cuối cùng, glucosamine là một đường khử có nhóm amin tự do nên vừa có đặc tính của hexo monosaccharide vừa mang đặc tính của nhóm amino. Người ta đã tinh chế được rất nhiều enzyme chitinase, trong đó phổ biến nhất là endochitinase có kích thước 42 kDa, sau đó là N-acetyl-b-D-glucosaminidase có kích thước 70 – 73 kDa. Ngoài ra cũng có endochitinase 37 kDa và 33 kDa (Cruz và cộng sự, 1992), chitobiosidase kDa (Harman và cộng sự, 1993), exochitinase 28 kDa (Dean và cộng sự, 1998), beta-1,4-N-acetylglucosaminidase 102 kDa có vai trò duy nhất trong việc gây ra sự biểu hiện của các enzyme thủy phân chitin khác nhau nhưng chưa được tinh chế (Harman và cộng sự, 1995). Enzyme chitinase của Trichoderma spp được xem là enzyme có hoạt tính thủy phân mạnh, hoạt động thủy phân của chitinase cũng kết hợp với các enzyme khác như beta-glucanase, sự phối hợp với các enzyme phân giải chitin và glucan đã dẫn đến sự tăng cường hoạt động thủy phân. Tuy nhiên, quan trọng hơn là chitinase làm tăng hiệu quả kháng nấm của các hợp chất không có bản chất enzyme. Theo báo cáo của Lorito và các cộng sự (1994), cho biết có sự phối hợp hoạt động giữa các enzyme thủy phân chitin với các hợp chất tự nhiên cũng như tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào (MAC). Beta – glucan trong vách tế bào nấm thường ở dạng beta-1,3-glucan và phần nhánh là dạng beta-1,6-glucan, beta-glucanase cũng là một hệ enzyme quan trọng của Trichoderma spp trong đặc tính kí sinh nấm, gồm 2 lớp enzyme chính: beta-1,3-glucannase và beta-1,6-glucanase.Beta-1,3-glucanase:là enzyme phân cắt liên kết O-glycosidic của beta-1,3-glucan nhờ 2 cơ chế: Exo-beta-1,3-glucanase phân cắt giải phóng glucose ở cuối chuỗi liên kết polyme. Endo-beta-1,3-glucanase cắt lin kết beta ở vị trí bất kì trong chuỗi polysaccharide, giải phóng oligosaccharide. Trichoderma spp phân giải beta-1,3-glucan thường kết hợp giữa hai hoạt tính exo và endo-1,3-glucanase, beta-1,3-glucanase có vai trò chính trong quá trình hoại sinh và ký sinh nấm, ngoài ra beta-1,3-glucanse gip thực vật chống lại mầm bệnh. Các vách tế bào nấm bệnh khác nhau cho chất tạo ra những mức độ hoạt tính khác nhau của enzyme beta-glucanase, bằng chứng trực tiếp cho thấy sự liên quan của beta-glucanase đối với sự ký sinh đã được chứng minh bởi Lorito và cộng sự (1994), và đã tách chiết invitro được một endo-beta-1,3-glucanase 78 kDa có khả năng ức chế sự nảy mầm của bào tử B. cinerea khi phối hợp với một GlcNAcase. Ở một số chủng khác nhau như chủng T – 24, người ta cũng tách chiết được một endo-beta-1,3-glucanase có kích thước tương tự, có khả năng ức chế sự phát triển của Sclerotium rofsii khi kết hợp với một ensochitinase 43 kDa (El-Katatny và cộng sự, 2001), Trichoderma spp cho thấy có thể tạo ra ít nhất l-3 enzyme beta-1,3-glucanase ngoại bào, Lora và cộng sự (1995) đã tạo dạng gen và cDNA của một beta-1,6-endoglucanase có kích thước 43 kDa, có thể ức chế sự phát triển của nhiều nấm bệnh khi phối hợp với các enzyme thủy phân khác. Beta-1,6-glucanase: trong điều kiện đặc biệt, Trichoderma spp tiết beta-1,6-glucanase, enzyme này phân cắt liên kết beta-1,6-glucan trong vách tế bào nấm. Theo Delgado và Jarana (2000) khi khảo sát trên Trichoderma spp đã xác định nhiều loại protease khác nhau tùy thuộc điều kiện môi trường có pH thấp và bổ sung chitin, glucose, amon, … Trichoderma spp tiết ra protease acid như là tác nhân điều hòa, để đáp ứng nhu cầu phân hủy những protein ngoại bào như chitinase, glucanase, cellulase, ngược lại protease có tính base hoặc trung tính được Trichoderma spp sinh ra trong môi trường có nguồn C khó bị phân hủy như vách tế bào nấm. Người ta đã tách chiết được một protease 42 kDa không nhạy cảm với pepsatin có liên quan đến sự giảm sút enzyme cellulase từ T.reesei QM 9414 trong điều kiện tạo cellulase (Haab và cộng sự, 1990). Trong một nghiên cứu khác của Dunaevesky và cộng sự (2000), một protease 73 kDa thuộc nhóm protease serin đã được tách chiết từ việc nuôi cấy Trichoderma spp. Protease của Trichoderma spp có vai trò trong việc tấn công ký chủ bằng cách thủy phân protein vốn l một phần của bộ khung vách tế bào. Gliotoxin l chất kháng sinh từ nấm Trichoderma spp, gliotoxin không bền và dễ bị phân hủy nhanh trong ánh sáng, phổ kháng sinh của gliotoxin bao gồm vi khuẩn (chủ yếu l vi khuẩn gram dương) và các nấm gây bệnh khác, hoạt tính kháng sinh của gliotoxin liên quan đến sự có mặt của phân tử lưu huỳnh trong cấu tạo của chúng.. Theo Dennis và Webster, Trichoderma spp có khả năng tiết Trichodermin, tạo ra các polypeptide có bản chất kháng sinh. Trichozianine là kháng sinh peptaibol có hoạt tính kháng nấm được phát hiện ở Trichoderma spp, Trichozianine kết hợp với những enzyme thủy phân vách trong quá trình ức chế sự nẩy mầm và kéo dài tơ nấm trong quá trình ký sinh nấm (Schirmbock, 1994).Trichothecene từ Trichoderma spp có hoạt tính kháng nấm (Corley et al, 1994). Tricholin l protein bất hoạt ribosome do T. vir tiết ra, chúng làm giảm sự hình thành chuỗi polysome. Viridiofungin l hợp chất aminoacyl alkyl citrate của Trichoderma spp, kháng sinh này có phổ rất rộng. Claydon (1987) xác định được chất alkylpyrons dễ bay hơi do Trichoderma spp ức chế nấm R. sola gây bệnh héo rũ trên cải trong điều kiện invitro. Bảng 2.3: Các phương pháp xác định hoạt tính cellulase Đo hoạt tính Cơ chất Phương pháp xác định Tác giả Hoạt tính hòa tan Giấy lọc Aicel Cellulose azur Giảm trọng lượng Đo mật độ quang Đo mật độ quang Halliwell v Riaz (1970) Lrisola v Linko (1976) Leisola v Linko (1976) Endoglucanase CMC, HEC Đường khử Mandel v Weber (1969) Cellulose tẩm H3PO4 Giảm độ nhớt Almin v Eriksson(1967) Exoglucanase Avicel, giấy lọc Đường khử Mandels v Weber (1969) Beta-glucosidase Cellobiose Glucose Selby v Maitland (1967) Wood và McCrae (1972) đã chứng minh rằng hoạt tính exoglucanase (được tinh chế) có khả năng phân cắt mạch cellulose (được xử lí với acid phosphoric) nhưng hoạt động trên CMC rất chậm. Sản phẩm phần lớn là cellobiose (95%). Endoglucanase phân cắt ngẫu nhiên các liên kết beta-1,4-glucosid ngay ở vùng trong của chuỗi cellulose được xử lí với acid phosphoric và cũng phân cắt các dẫn xuất của cellulose như CMC và HEC (hydroxylethyl cellulose). Vì bản chất của cơ chất lẫn enzyme đều phức tạp, nên việc phân tích hoạt lực cellulase cũng không đơn giản. Cellulase thu nhận được từ các vi sinh vật khác nhau cho thấy có nhiều dữ liệu khác nhau. Thành phần của enzyme từ cùng một chủng vi sinh vật phụ thuộc nhiều vào phương pháp lên men, thành phần môi trường và các điều kiện lên men. Cơ chất để phân tích hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase và beta-glucosidase là cellulose tinh thể không tan như Avicel, Solkfloc và đặc biệt là giấy lọc. Tuy nhiên, việc tiêu chuẩn hóa các cơ chất này rất khó, vì bản chất đại phân tử của chúng như mức độ polyme hóa, mức độ tinh thể, mức độ tinh sạch và nguồn gốc của cơ chất, tất cả đều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Các cơ chất phân tử nhỏ như p-nitrophenol-beta-glucosidase, cellobiose hoặc oligocellulodextrin là cơ chất lí tưởng để chuẩn hóa việc phân tích hoạt tính cellulase. Tuy nhiên, các cơ chất này không thích hợp cho họat động phối hợp của cả hệ cellulase mà chỉ thích hợp cho beta-glucosidase. Nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế ngăn ngừa các loại nấm bệnh hại cây trồng gây bệnh xì mủ, vàng lá thối rễ, chết yểu, héo rũ như: Rhizoctonia solani, Fusarium, Pythium, Phytophthora sp., Sclerotium rolfsii…. Cơ chế tác động là do Trichoderma tiết ra một enzym làm tan vách tế bào của các loài nấm khác, sau đó nó tấn công vào bên trong loài nấm gây hại đó và tiêu diệt chúng. Tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển sống trong đất trồng. Kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ cây trồng. Phân giải tốt các chất xơ, chitin, lignin, pectin … trong rác thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, giúp cho cây hấp thu được dễ dàng. 2.6 Chế phẩm khử mùi EM: Chế phẩm sinh học EM (Effective Microorganisms) có nghĩa là các vi sinh vật hữu hiệu, đang được ứng dụng rộng rãi với mục đích cải tạo nguồn nước (làm trong sạch, khử mùi hôi); tăng sức đề kháng cho vật nuôi, cây trồng; góp phần cải thiện môi trường (khử mùi hôi chuồng trại, rác thải sinh hoạt)... Hình 2.13: Chế phẩm sinh học khử mùi EM Chế phẩm này do Giáo sư Tiến sĩ Teruo Higa - trường Đại học Tổng hợp Ryukyus, Okinawoa, Nhật Bản sáng tạo và áp dụng thực tiễn vào đầu năm 1980. Trong chế phẩm này có khoảng 80 loài vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic, nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn. 80 loài vi sinh vật này được lựa chọn từ hơn 2000 loài được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men. Chế phẩm EM được giới thiệu tác dụng về nhiều mặt: Phân huỷ nhanh các chất hữu, khử mùi hôi thối. Ngăn cản quá trình oxi hoá. Thúc đẩy quá trình quang hợp tạo diệp lục. Tăng khả năng kháng bệnh và sâu bọ của cây trồng. EM được thử nghiệm tại nhiều quốc gia